雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達的調控方法
2023-05-16 23:38:36
專利名稱：雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達的調控方法
技術領域：
本發明涉及基因調控方法，具體而言涉及調控雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達的方法。
背景技術：
vasa是動物細胞中特異性表達基因，其編碼的蛋白為DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)家族中的一種解旋酶，首先於果蠅中發現。隨後在水螅、渦蟲、線蟲、尼羅羅非魚、虹鱒、黃鱔、 鯉魚、斑馬魚、爪蟾、雞[11]、小鼠和人等物種中克隆獲得了同源基因。系統進化分析表明從低等無脊椎動物到高等哺乳動物中vasa均保持高度保守。基因表達分析表明在絕大多數物種中，vasa僅表達於生殖細胞中。已經證明，vasa基因敲除小鼠生殖細胞不能完成減數分裂，精子發生受阻。在雌性果蠅中vasa突變體中卵子有缺陷，即使受精，個體發育後則會缺少生殖細胞。對斑馬魚和果蠅的研究表明，vasa在卵細胞中為母源性基因，在早期胚胎發育中起重要作用。另外，vasa可以和諸如0skar、TudOr以及Maufen等蛋白一起參與生殖質的形成。有研究表明vasa的表達可引起其它基因的表達下降。進一步的研究表明， vasa和翻譯因子eIF5B可對翻譯過程起調控作用。目前，vasa已經被認為是生殖細胞的特異性標記分子，針對vasa開發的抗體以及GFP載體等分子標記已經運用於多項研究中。vasa最早在果蠅中發現，在脊椎動物中作為生殖細胞高度特異表達基因，是生殖細胞中公認的分子標誌。後來的實驗證明，在不同動物中vasa均為 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)家族中的一種解旋酶。迄今為止，魚類中vasa基因已經被廣泛克隆，而且在不同物種中有不同結構。在南方鯰中已經發現有兩種vasa基因，且有很高的同源性。在尼羅羅非魚中，也發現了兩種 vasa基因片段，這可能是魚類在多倍化的過程中演化而來。本發明克隆得到的vasa與尼羅羅非魚兩種vasa相似性最高，達到96. 3%和96. 1%，而與其它物種vasa基因的同源性則較低。進化樹分析結果與奧利亞羅非魚的分類學地位相一致。然而在奧利亞羅非魚中是否也存在著其它形式的vasa基因還有待研究。vasa在脊椎動物中僅僅於生殖細胞中表達，在奧利亞羅非魚中也得到印證。在 vasa基因敲除小鼠中，精子發生阻滯於第一次減數分裂的偶線期，從而導致精細胞凋亡，最終引起雄性小鼠不育。在魚類中vasa主要於精原細胞和還未進入減數第一次分裂的精母細胞中，但在未成熟的精子中表達下降，而在成熟精子中則不表達。本文結合原代細胞培養技術，在培養過程中加入不同濃度的LHRH-A後分析原代精巢細胞中vasa mRNA的表達差異。結果顯示在LHRH-A刺激後vasa mRNA的表達水平明顯降低。在性腺發育調控中，下丘腦-垂體-性腺軸在激素水平扮演者重要角色。在適應的環境刺激下，如溫度、光照等，下丘腦分泌&iRH刺激垂體，垂體LH隨之表達升高，LH進入血液循環，最終在魚類性腺成熟以及排卵排精過程中起重要作用。奧禾Ij亞羅非魚(Oreochromis aurea)屬於鱸形目(Perciformes),鱺魚科 (Cichlidae)，羅非魚屬(Oreochromis)。奧利亞羅非魚對溫度和鹽度的耐受能力比尼羅羅非魚強，因此在越冬保種時較尼羅羅非魚有優勢。在實際生產中，雄性奧利亞羅非魚主要作為奧尼羅非魚的雜交親本在繁殖育種中廣泛使用。生產得到的奧尼雜交羅非魚雄性率很高 (可達95%以上)，不但具有母本尼羅羅非魚生長速度快的優勢，而且還具有父本奧裡亞羅非魚抗逆性強的優勢，是我國羅非魚養殖業養殖的主要品種之一。隨著我國大規模羅非魚尤其是雜交羅非魚養殖業的發展，必須對其親本的生殖生理調控進行深入研究，以便指導育種工作。vasa是生殖細胞發育分化的重要基因，對其進行研究不僅能了解其在奧利亞羅非魚中的作用，而且對今後在奧利亞羅非魚生殖細胞的定位研究開發分子標記有意義。
發明內容
為了對雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達進行調控，本發明採用如下的技術方案一種雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達進行調控的方法，其特徵在於使用 LHRH-A進行調控。在本發明的一個優選實施方式中，其特徵在於對奧利亞羅非魚精巢進行原代培養，培養時使用LHRH-A處理。在本發明的一個優選實施方式中，其特徵在於LHRH-A的濃度為1(Γ9Μ以上，優選為 10、及其以上。在本發明的一個優選實施方式中，特徵在於所述的羅非魚為奧利亞羅非魚。本發明另外一方面還涉及一種羅非魚人工繁殖時進行催產的方法，其特徵在於給予一定量的LHRH-A。在本發明的一個優選實施方式中，其特徵在於LHRH-A的濃度為1(Γ9Μ以上，優選為 10、及其以上。在本發明的一個優選實施方式中，其特徵在於所述的羅非魚為奧利亞羅非魚。本發明另外一方面還涉及LHRH-A在調控雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達中的應用。
具體實施例方式奧尼亞羅非魚精巢細胞原代培養參照文獻進行，具體方法如下取3條成體奧尼亞羅非魚精巢組織約4g剪碎後PBS清洗3次，5min/次。500U/ml膠原酶25°C消化池後， 用M199 (sigma)培養基稀釋後種入M孔板，每條魚的精巢細胞種12孔，一共36孔。每孔中包含Iml M199培養基。5% CO2, 25°C培養過夜。將過夜培養後的細胞分為4組對照組，低濃度LHRH-A (Sigma) (10_12M)處理組、中濃度LHRH-A(KTkiM)處理組和高濃度LHRH-A (10_8M)處理組，每組3孔作為平行孔。分別在各孔中加入相應濃度的LHRH-A進行處理。2小時後收集細胞提取RNA。提取的RNA進行DNase I消化後，以Iyl RNA進行反轉錄。根據獲得的序列設計引物進行實時定量PCR(表1)。將樣本cDNA進行5倍稀釋，反應體系為SOyLdXSTOR Premix Ex Taq (ABI) 10 μ L，上下遊引物各 2 μ L(10 μ mol/L)，稀釋後的 cDNA 模板 4 μ L， ddH20 16μ L，95°C IOs預變性，95°C 5s,60°C 34s,40個循環。擴增完成後進行熔解曲線分析以確定反應是否特異。最後以β-actin為內參通過2_「CT計算不同組的相對含量。
用實時定量PCR對不同處理組樣品的vasa mRNA進行檢測。結果顯示，對照組vasa 表達量最高(P < 0. 05)，設對照組表達量為1。LHRH-A 10_1組表達量最低為0.四士0. 097， (P 0. 05)。實驗結果顯示LHRH-A對精巢細胞的vasa表達起抑制作用。提示在奧利亞羅非魚生殖細胞最終成熟時，垂體中LH分泌上調，從而抑制了 vasa的表達。應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換， 而所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
權利要求
1.一種雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達量進行調控的方法，其特徵在於使用 LHRH-A進行調控。
2.根據權利要求1所述的調控方法，其特徵在於對奧利亞羅非魚精巢進行原代培養， 培養時使用LHRH-A處理。
3.根據權利要求1所述的調控方法，其特徵在於LHRH-A的濃度為KT9M以上，優選為 10、及其以上。
4.根據權利要求1-3任意一項所述的調控方法，其特徵在於所述的羅非魚為奧利亞羅非魚。
5.一種羅非魚人工繁殖時進行催產的方法，其特徵在於給予一定量的LHRH-A。
6.根據權利要求6所述的催產方法，其特徵在於LHRH-A的濃度為1(Γ9Μ以上，優選為 10、及其以上。
7.根據權利要求5或6所述的催產方法，其特徵在於所述的羅非魚為奧利亞羅非魚。
8.LHRH-A在調控雄性羅非魚精巢細胞vasa基因表達中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種LHRH-A對雄性奧利亞羅非魚精巢細胞vasa基因進行調控的方法，通過適宜濃度的LHRH-A調控vasa基因的表達，能夠實現在人工繁殖時達到催產的目的。
文檔編號C12N15/63GK102286507SQ201110165008
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月20日 優先權日2011年6月20日
發明者嚴欣, 餘高雲, 張明, 曹謹玲, 楊麗, 楊軍, 楊弘, 王玉, 甘西, 羅永巨, 肖俊, 郭忠寶, 郭恩彥, 陳麗兵 申請人:廣西壯族自治區水產研究所