蛋白質的口服釋放方法

2023-05-17 00:28:51

專利名稱：蛋白質的口服釋放方法
技術領域：
本發明涉及包括可膨脹水凝膠基質和包含在基質中蛋白質的組合物，和該組合物在將生物活性化合物以活性形式經口腔釋放到脊椎動物腸中的應用。
背景技術：
在開發蛋白質類化合物(如胰島素)的口服釋放系統的過程中存在兩個主要問題。第一個問題是許多蛋白質在胃腸(GI)系統，主要是胃中被消化酶滅活。這個問題可以通過設計一種載體而被克服，所述載體在釋放藥物進入GI道更適宜區域，特別是腸道低部區域之前保護蛋白質免受胃苛刻環境的破壞。此外，可應用蛋白酶抑制劑以阻滯存在於GI系統中能夠分解口服蛋白質的酶的活性。另一問題是將完整的大肽穿過腸道基膜進入血流的緩慢轉運。研究者已經嘗試藉助於吸收增強劑來繞過障礙，所述吸收增強劑可幫助巨分子穿過屏障轉運。然而，目前缺乏有效的可利用釋放載體。因此，期望有效的和相對低造價製備的口服釋放系統。
發明概述本發明涉及包括水凝膠基質載體和生物活性化合物的組合物，以及組合物將化合物以活性形式釋入腸道的應用。一種優選的水凝膠基質包括聚(甲基丙烯酸-g-乙二醇)交聯二甲基丙烯酸四甘酯共聚物網，即「P(MAA-g-EG)水凝膠」，由於酸性側基的存在和嫁接鏈上的醚基團與質子側基之間互聚絡合物的形成，水凝膠顯示出pH依賴性膨脹性質。在酸性介質，由於形成互聚絡合物，該系統相對不膨脹。在鹼性溶液，側基電離和絡合物分離。這些水凝膠的pH依賴性膨脹加之它們的生物粘附特性使得這些水凝膠成為口服釋放蛋白質的理想載體。
附圖簡述

圖1 P(MAA-g-EG)水凝膠中的可逆絡合作用。C代表裹入的生物活性化合物。
圖2 在37℃時，平衡聚合物體積分率作為樣品pH值的函數，所述樣品含有MW1000的PEG嫁接物和1∶1摩爾比的MAA∶EG。
圖3 37℃時，平衡篩孔尺寸作為樣品pH值的函數，所述樣品含有MW1000的PEG嫁接物和1∶1摩爾比的MAA∶EG。
圖4 37℃時丙羥茶鹼於pH3.2(·)和7.4(●)和維生素B12於pH3.2( )和7.4(◎)的緩衝鹽溶液中的控制釋放。
圖5a 37℃時茶礆自P(MAA-g-EG)水凝膠體外搏動性釋放。
圖5b 37℃時萬古黴素自P(MAA-g-EG)水凝膠體外搏動性釋放。
圖5c 37℃時胰島素自P(MAA-g-EG)水凝膠體外搏動性釋放。
圖6 含比值1∶1 MAA/EG和分子量為1000PEG嫁接鏈的P(MAA-g-EG)水凝膠在pH值3.2和7.4時與牛下頜腺粘蛋白接觸時的粘附行為。
圖7 大鼠口服25U/kg(O)和50U/kg(·)負載於P(MAA-g-EG)水凝膠中的胰島素和50U/kg胰島素溶液(●)(N＝5)後的血糖濃度。
圖8 大鼠口服負載於的P(MAA-g-EG)水凝膠中的胰島素(25U/kg)在含抑肽酶(O)和不含抑肽酶(·)時及50U/kg胰島素溶液(●)(N＝5)後的血糖濃度。
圖9 健康(·)和糖尿病(O)雄性Wistar大鼠口服P(MAA-g-EG)明膠膠囊微球(胰島素劑量為25IU/kg體重)後的血糖反應。
圖10 糖尿病雄性大鼠口服P(MAA-g-EG)Eudragit膠囊微球(25IU/kg體重)後的血糖反應。
圖11 健康犬(25kg)口服P(MAA-g-EG)明膠膠囊微球(胰島素劑量為10IU/kg體重)後的血糖反應。
圖12 糖尿病犬(25kg)口服P(MAA-g-EG)明膠膠囊微球(胰島素劑量為10IU/kg體重)後的血糖反應。
發明詳述本發明涉及通過口服給藥向脊椎動物釋放生物活性蛋白質和藥物的組合物。這裡使用的術語活性化合物指對生命細胞有效的任何化合物，例如可誘導細胞內生化作用的化合物。根據一個實施例，口服給予的組合物包括可膨脹水凝膠基質，和包含在可膨脹水凝膠基質中的不穩定蛋白質。這裡所用的不穩定蛋白質包括暴露於低pH或暴露於恆溫動物消化道中的酶之後生物活性被破壞或變小的任何蛋白質。
水凝膠是本領域普通技術人員眾所周知的水可膨脹性、交-聯的聚合物基質。參見例如，Dresback於1980年9月2日提交的美國專利4,220,152，在此特意地在將其公開引入參考。已發現水凝膠是向脊椎動物口服釋放蛋白質的有效釋放載體。可利用水凝膠的可膨脹特性，當組合物通過消化道時首先保護水凝膠內容物免受胃惡劣環境的影響，然後將水凝膠內容物釋入GI道更適宜區域，特別是腸道較低區域。已經發現本發明組合物在通過胃時基本不膨脹並定位於小腸，在小腸部位水凝膠膨脹並伴隨著其內容物的釋放。
水凝膠可充滿或負載各種生物活性化合物，包括但不限於藥物、生長激素、疫苗成分、維生素、類固醇和肽，並可作為此類生物活性化合物的口服釋放載體。隨著水凝膠在動物消化系統中變成水合物，負載於水凝膠中的化合物以控制方式釋放。在一實施例中，本發明水凝膠基質是由聚甲基丙烯酸構成的粒狀形式，該聚甲基丙烯酸聚合物嫁接了一個離子性長鏈聚合物如聚乙二醇(PEG)。
水凝膠顆粒優選在存在交聯劑的條件下通過甲基丙烯酸聚合反應而合成。交聯劑可選自本領域人員已知的各種生物適合性交聯劑包括二甲基丙烯酸四甘酯、二甲基丙烯酸乙烯酯、二甲基丙烯酸二乙烯酯、二甲基丙烯酸三乙烯酯、二甲基丙烯酸四乙烯酯、二甲基丙烯酸五乙烯酯、相應的二丙烯酸酯，或星形聚合物包括甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯或亞甲基雙丙烯醯胺基團。聚合反應由本領域技術人員已知的自由基引發劑如熱引發劑包括有機過氧化物或UV自由基引發劑來引發。
在一實施例中，水凝膠基質包括與生物適合性交聯劑交聯的甲基丙烯酸和聚(二醇)單甲基丙烯酸酯(或單丙烯酸酯)的共聚物。本發明使用的「聚(二醇)單甲基丙烯酸酯」包括聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯、聚(丙二醇)單甲基丙烯酸酯和聚(乙烯/丙二醇)單甲基丙烯酸酯，其中聚(乙烯/丙烯乙二醇)單甲基丙烯酸酯是由羥基功能性甲基丙烯酸酯引發氧化乙烯和氧化丙烯混合物聚合形成的聚合物。結果聚(二醇)側基分子量為約200～約4000，更典型的是約200～約2000，在一實施例中為約200～約1200。甲基丙烯酸和聚(二醇)單甲基丙烯酸酯(或單丙烯酸酯)單體比值為約4∶1～約1∶4。
在一優選實施例中，水凝膠基質包括甲基丙烯酸和聚(二醇)單甲基丙烯酸酯與二甲基丙烯酸四甘酯交聯的聚合物，「P(MAA-g-EG)水凝膠」。為製備所述聚合物，分子量約為200～約2000，更典型地是約200～約1200的聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯與甲基丙烯酸和二甲基丙烯酸四甘酯進行共聚。甲基丙烯酸和聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯單體分子比約為4∶1～約1∶4。在另一實施例中，甲基丙烯酸和聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯單體分子比約為1∶1。交聯劑加入量約0.25～約10.00摩爾％，更優選約0.25～約1.00摩爾％，在一實施例中約為0.75摩爾％。
水凝膠可以按照本領域技術人員已知的標準技術負載所需的化合物。在一實施例中，P(MAA-g-EG)水凝膠形成大小範圍為直徑約50μm～約500μm，更優選直徑約100-200μm的微粒。根據一實施例，通過形成聚合基質並研磨基質以形成所需平均顆粒大小的水凝膠顆粒從而製得水凝膠微粒。水凝膠微粒可負載所需化合物並使用本領域技術人員已知的標準技術包裝為標準片劑或膠囊劑。在一實施例中，水凝膠顆粒包入明膠膠囊。
根據一實施例，通過平衡分配使水凝膠負載生物活性化合物。尤其是，水凝膠在pH＞5.8並包含所負載組合物的溶液中成為水合物。然後回收水凝膠，再用pH＜5.8的溶液洗滌。然後乾燥水凝膠並於4℃貯存。負載本發明水凝膠的另一方法包括將所需化合物的水溶液加到單體和交聯劑的溶液中以及引發混合物聚合反應的步驟。
化合物通過交聯聚合物網擴散的能力取決於凝膠膨脹程度和化合物的大小。水凝膠膨脹，交聯點之間的聚合物鏈伸展和網孔大小或相關長度，ξ，增加從而允許材料中更大溶質滲透(見圖1)。平衡膨脹得到絡合網架，網架膨脹程度取決於存在於系統中的化學性和物理性交聯的數量。在P(MAA-g-EG)網架，平衡膨脹比值更主要取決於周圍環境的pH。
本發明P(MAA-g-EG)水凝膠，暴露於酸性條件(典型地是pH＜5.8)時形成暫時的物理性交聯，這是由於聚甲基丙烯酸酯基團和側伸出的聚(二醇)基團之間形成氫鍵。這些物理性交聯本質上是可逆的，並取決於環境pH和離子強度。因此，交聯度和網眼大小，ξ，更主要取決於周圍環境的pH和離子強度。在酸性介質，由於大分子間絡合物形成，故此系統相對不膨脹。在鹼性溶液，側基離子化和絡合物分離。P(MAA-g-EG)水凝膠的平衡膨脹示於圖2。數據表示作為pH函數的水凝膠(PEG嫁接物分子量1000，MAA∶EG分子比1∶1)的聚合物體積分率。以等克分子量的MAA和EG在低pH值時為例，絡合程度高和膨脹狀態下凝膠中聚合物體積分率，V2，S，幾乎為0.70。然而，如果膨脹溶液的pH增加到高於pH＝4.6，則絡合物開始分離且主鏈延伸導致凝膠中平衡聚合物體積分率顯著降低。由於更多的水摻入到結構中，所以該高度膨脹、無-絡合水凝膠包含的聚合物小於5％。
因為P(MAA-g-EG)凝膠中的絡合/解絡現象，網架的網孔大小隨著有關的pH範圍不同而顯著不同。此外，得到了在不同pH溶液中輕度變形(小於10％)水凝膠的係數。使用這些數據，通過測定交聯(不論共價還是物理性的)之間聚合物鏈首尾相連長度，可計算出作為pH函數的網孔大小。平均網孔大小或相關長度引人注目地受膨脹溶液pH的影響(圖3)。在低pH溶液中，將出現絡合，P(MAA-g-EG)水凝膠網孔大小低至70。然而，隨著pH增加，物理性交聯分離，聚合物鏈延伸導致網孔大小乘以因子3而增加至幾乎210。更重要地，假定理想網架，擴散可利用面積等於網孔大小的平方。於是，無-絡合水凝膠(pH大於5.2)較絡合水凝膠(pH小於5.2)的擴散面積大9倍。由於絡合現象的可逆性質，P(MAA-g-EG)水凝膠用于振蕩性釋放藥物非常理想。另外，由於小的pH變化可引起網架結構大的變化，故這些材料可良好地作為肽和蛋白質的載體。尤其是，本發明P(MAA-g-EG)水凝膠可作為分子量範圍為約1,000～約100,000，更優選地為約1,000～約20,000的化合物的釋放載體。
在評價凝膠作為特定藥物載體潛能時的重要參數是有效分子大小(水動力學直徑，dh)與網孔大小的比值。為了研究這些網架的大小-排除特性，研究了兩種不同分子大小的溶質，即丙羥茶鹼(分子量238，dh＝4.3)和維生素B12(分子量1355，dh＝17)，從絡合和無-絡合水凝膠中的釋放(圖4)。溶液pH＝3.2時，水凝膠聚合物高度絡合，藥物轉運顯著受阻。2小時內從網架中釋放的維生素B12少於10％。然而，由於分子小，在同樣時間內幾乎有30％的丙羥茶鹼從凝膠中釋放。當水凝膠與pH＝7.4的溶液接觸時，由於側酸基團的離子化，致使水凝膠鏈間絡合分離。結果，水凝膠膨脹到很大的程度，允許維生素B12和丙羥茶鹼自聚合物大量擴散。
釋放數據擬合為平面系統經典Fickian表達的溶液的短時近似值並計算丙羥茶鹼和維生素B12通過絡合和無-絡合P(MAA-g-EG)水凝膠擴散的擴散係數(表1)。由於溶質直徑與網孔大小的比值增加，大分子量溶質，維生素B12，的轉運較丙羥茶鹼更顯著地受到絡合的影響。維生素B12自無-絡合水凝膠的擴散係數較絡合水凝膠高出兩個數量級，而丙羥茶鹼在無-絡合水凝膠的擴散係數只高出絡合水凝膠一個數量級。
表1.丙羥茶鹼和維生素B12在絡合和無-絡合P(MAA-g-EG)水凝膠中的擴散係數。溶質 PH ξ() dh/ξ D3.12×108(cm2/s)丙羥茶鹼3.2 70.8 0.060 0.403丙羥茶鹼7.4194.4 0.022 9.38維生素B123.2 70.8 0.240 0.0168維生素B127.4194.4 0.087 6.75為進一步研究P(MAA-g-EG)水凝膠作為維生素、藥物和氣體生物活性化合物口服釋放載體的能力，測定了在受激胃腸條件下各種化合物的搏動性釋放。使用茶礆(MW＝180.2)、萬古黴素(MW＝1485.7)和胰島素(MW＝5733.2)進行體外釋放試驗。見實施例1。通過平衡分配將每個化合物負載於P(MAA-g-EG)水凝膠中，然後將負載了化合物的水凝膠浸入200ml pH＝1.2受激胃液中2小時。接著將聚合物微粒轉移至pH＝6.8的磷酸緩衝液中。使用HPLC檢測釋入環境溶液的胰島素濃度，並將茶鹼、萬古酶素和胰島素的結果分別用圖5a-5c顯示。
化合物自水凝膠基質的釋放在酸性溶液中降低(見圖2，暴露的前2小時)。然而，觀察到在pH 6.8緩衝液中化合物的快速釋放。隨著藥物分子量增加，這種現象趨向於更為明顯。例如P(MAA-g-EG)水凝膠是胰島素(MW＝5733.2)的有效釋放載體在試驗的第一時段，在受激胃液(pH-1.3)中胰島素自聚合物的釋放小於10％。然而，將顆粒置入pH＝7.4緩衝液後，水凝膠快速膨脹使得胰島素快速釋放。結果表明嫁接共聚物P(MAA-g-EG)在發展口服胰島素釋放系統方面是有益的。這裡使用的術語胰島素旨在包括純化的人和動物天然胰島素以及它們的衍生物，如胰島素脂蛋白(lispro)和重組形式的胰島素，及胰島素或胰島素衍生物的單價或二價鹽。
此外，由於作為附著促進劑的嫁接PEG鏈的存在，P(MAA-g-EG)水凝膠顯示出強的黏膜粘附特性。而且，P(MAA-g-EG)水凝膠的黏膜粘附性強烈地依賴於環境液的pH(見圖6)。凝膠和黏膜之間的粘附在刺激性腸道狀態條件下(pH＝7.4)顯著高於刺激胃環境狀態時。然而，為了真實地比較凝膠的黏膜粘附特性，將粘附功標準化以解釋聚合物凝膠部分。水凝膠的標準化粘附功在無-絡合態時高出兩個數量級。相應地，當它們通過胃並保持絡合狀態時P(MAA-g-EG)水凝膠的黏膜粘附特性會相對較低。在到達腸道後鏈間絡合解離，因此相對於與胃黏膜的粘附性，凝膠對腸道黏膜粘附性增加。因而，口服給予脊椎動物後，胰島素載體在胰島素被吸收區域(即在腸道)的駐留時間大大增加。
不同pH值時水凝膠粘附性的不同是由於PEG鏈在每個材料中的移動性不同。在高度膨脹、無-絡合狀態，側PEG鏈是游離的並作為粘附的錨方便地穿透黏膜。在絡合狀態，P(MAA-g-EG)水凝膠中的側PEG鏈與主鏈形成絡合物，並且不能與黏膜表面相互作用。
根據本發明，水凝膠組合物可用於將治療有效量的蛋白質施予脊椎動物。方法包括將包括包含於水凝膠載體中蛋白質的組合物對脊椎動物口服給藥的步驟。包含於水凝膠基質中的組合物可進一步包括本領域普通技術人員已知的蛋白酶抑制劑、可藥用載體、穩定劑和生物適合性填充劑。
一優選的水凝膠載體是P(MAA-g-EG)，在一實施例中P(MAA-g-EG)水凝膠基質包含包括胰島素的可藥用組合物。而且，根據本發明的一個實施例，胰島素組合物進一步包括蛋白酶抑制劑或吸收促進劑。包含於P(MAA-g-EG)水凝膠內的包括胰島素的組合物已經顯示出在將胰島素釋入動物血流方面具有驚人的有效性(見實施例3和4)。利用本領域技術人員已知的技術將水凝膠基質典型地製備成微粒形式並包裝於適宜的口服釋放載體內(即片劑、膠囊等)。
在一實施例中，釋放系統由聚(甲基丙烯酸)與聚(乙二醇)的交聯共聚物和所包含的胰島素組成。在組合物通過胃的苛刻環境時，由於共聚物結構呈現pH敏感性膨脹行為而使胰島素得以保護，所以該系統特別有效。側PEG鏈也起到粘附促進劑作用而增加水凝膠載體在打算釋放部位的駐留時間。如實施例2中指出的那樣，水凝膠的黏膜粘附性明顯地受pH的影響，由此與粘附於胃表面相比更宜於粘附於腸道表面。此外，側PEG聚合物的存在作為肽穩定劑並幫助保持生物活性化合物如胰島素的生物活性。
水凝膠共聚物中形成的鏈間絡合物對環境液體的性質和pH以及共聚物組合物和嫁接鏈長度敏感。在胃的酸性環境，由於由羧酸質子與嫁接鏈上醚基團之間的氫鍵穩定的互聚物絡合物的形成，水凝膠呈絡合狀態。由於孔眼小，ξ，在這些狀態時具有至少1000分子量的化合物(例如胰島素)不能方便地通過膜擴散，因而這些化合物免受胃的苛刻環境的破壞。隨著顆粒通過胃並進入腸道，環境pH增加超過凝膠的轉變pH。絡合物立即解離，網孔迅速增大導致分子量小於100,000的化合物釋放。因此，P(MAA-g-EG)水凝膠可用作分子量範圍為約1,000～約100,000化合物的有效的口服釋放載體。
實施例1P(MAA-g-EG)水凝膠內容物的pH依賴性釋放研究了P(MAA-g-EG)水凝膠作為不同大小三種化合物的釋放載體的能力茶鹼(MW 180.2)、萬古酶素(MW 1485.7)和胰島素(MW5733.2)。
在37℃通過甲基丙烯酸和聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯的自由基溶液聚合反應製備P(MAA-g-EG)水凝膠，生成的低聚物鏈與二甲基異丁烯酸四甘酯交聯。將生成的水凝膠在去離子水中漂洗一周以除去未反應單體和未-交聯的低聚物鏈，真空乾燥並研磨成平均顆粒直徑為100-150μm的粉末。
利用茶鹼(MW 180.2)、萬古酶素(MW 1485.7)和胰島素(MW 5733.2)進行藥物摻入實驗。將每一個藥物溶於pH 7.4的磷酸緩衝液中並將P(MAA-g-EG)水凝膠加入到藥物溶液中，通過平衡分配負載水凝膠。然後將水凝膠基質與酸性溶液接觸，從而誘導互聚絡合物形成，由此降低水凝膠基質網孔的大小。接著過濾收集水凝膠微球並真空乾燥。用HPLC分析檢測起始溶液中殘留藥物量的濃度和洗脫游離水凝膠所得過濾液中藥物濃度來計算摻入效率。
按照日本藥典(Japanese Pharmacopoeia(JP))攪拌方法進行藥物釋放實驗。37℃以100rpm在JP的1液(pH 1.2)、2液(pH 6.8)中用槳攪拌組合物。用1液處理2小時後，過濾收集聚合物樣本並轉移至pH 6.8的2液中。HPLC檢測藥物濃度。
實驗開始後30分鐘胰島素摻入水凝膠基質的平均摻入效率達94％，因此認為該聚合物是胰島素的適宜載體。茶鹼、萬古酶素和胰島素自P(MAA-g-EG)水凝膠釋放結果分別顯示於圖5a、5b、5c。在酸性溶液中化合物自水凝膠基質的釋放降低(見暴露前2小時)。然而，在pH6.8緩衝液中觀察到化合物的快速釋放。隨著藥物分子量增加，這種趨勢變得更為明顯；實驗的第一階段在受激胃液(pH-1.3)中胰島素自聚合物的釋放小於10％。然而，將顆粒置入pH＝7.4緩衝液後，水凝膠迅速膨脹使得胰島素快速釋放。結果表明嫁接共聚物P(MAA-g-EG)在開發口服胰島素釋放系統中是有用的。
實施例2體外黏膜粘附研究使用溶液聚合技術將P(MAA-g-EG)水凝膠製成薄膜。在pH＝3.2和7.4的DMGA緩衝鹽液將水凝膠漲大平衡。將膨脹水凝膠切成直徑20cm的盤狀並置入25℃和90％RH的張力測驗器中。鑑於用膠粘劑將膠凝的牛頜下粘蛋白樣本固定於低口，使用氰基丙烯酸酯醫用膠粘劑將聚合物樣本粘附於檢測器的上柄。將兩口拉在一起15分鐘然後以1mm/min速度分開。測定分離力作為位移的函數。分離功，等於按曲線下面積計算的生物粘附功。
由於P(MAA-g-EG)水凝膠可以阻滯蛋白酶抑制劑的作用，又能附於腸道壁黏膜，使得緊密接觸並由此有助於藥物的吸收，故P(MAA-g-EG)水凝膠可以很好地起到胰島素載體的作用。
當包含胰島素的水凝膠置於腸道液中，水凝膠迅速膨脹而使胰島素釋放。包含胰島素的P(MAA-g-EG)微粒在磷酸緩衝鹽溶液中膨脹1小時，然後移至腸液中。使用EIA試劑盒檢測胰島素在腸液中的蛋白分解。在蛋白水解酶存在時，大於50％的胰島素生物活性維持1小時以上。相反，當胰島素溶於腸液中，生物活性迅速喪失。P(MAA-g-EG)水凝膠起到保護胰島素的作用，這是由於水凝膠將鈣結合到離子化側基上，而這種結合反過來阻滯蛋白水解酶的作用。
此外，由於作為粘附促進劑的嫁接PEG鏈的存在，使得P(MAA-g-EG)水凝膠顯示出黏膜粘附特性。P(MAA-g-EG)水凝膠的黏膜粘附性強烈地依賴於環境液的pH(圖6)。圖6曲線下面積等於凝膠和黏膜之間的粘附力。在刺激腸pH(pH＝7.4)條件下，凝膠和黏膜之間的粘附力顯著增大。然而，為真實比較水凝膠的黏膜粘附性，將粘附功標準化以解釋聚合物凝膠部分(見表2)。標準化的粘附功在無-絡合狀態水凝膠要高出絡合水凝膠2個數量級。相應地，水凝膠對腸道黏膜的粘附要大大超過對胃黏膜的粘附。因此，胰島素載體在胰島素能夠吸收部位的駐留時間大大增加。
表2.含比值1∶1MAA/EG和分子量為1000嫁接PEG鏈的P(MAA-g-EG)水凝膠的粘附功pH粘附功聚合物體積分率，O2，s標準化的粘附功W*106(J) W/(O2，s)2/3*106(J)3.2 5.380.693 62.17.4 9.340.049 6720水凝膠在不同pH值的不同粘附性是由於PEG鏈在每種材料中的移動性。在高度膨脹的無-絡合狀態時，嫁接PEG鏈是游離的並作為粘附的錨很容易穿透黏膜。在絡合狀態，嫁接PEG鏈在P(MAA-g-EG)中與主鏈形成絡合物，因而不能穿透凝膠/黏膜界面和形成臨時錨。
實施例3胰島素大鼠給藥的體內研究通過甲基丙烯酸和聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯的自由基溶液聚合反應製備嫁接共聚物。將生成的水凝膠在去離水中漂洗7天以除去未反應單體和未-交聯的低聚物鏈，將水凝膠真空乾燥並研磨成粉末。過濾粉末得到平均顆粒直徑為100-150μm的顆粒。通過平衡分配負載晶狀豬胰島素(26.9U/mg)。過濾負載了藥物的顆粒並洗去表面藥物及進行真空乾燥。
雄性Wistar大鼠(200g)禁食24小時。仰臥位固定大鼠，給予負載了胰島素的聚合物明膠膠囊微粒，明膠膠囊在胃中立即溶化。實驗前和給藥後0.25、0.5、1、2、4、6和8小時由頸靜脈採集0.2ml等份血液樣本進行血清葡萄糖檢測。3000rpm離心3分鐘分離血清並冷凍血清至分析時使用。使用EIA試劑盒通過酶聯免疫分析法測定血清胰島素水平。使用B-測試試劑盒用葡萄糖氧化酶方法測定血清葡萄糖水平。
圖7概括了大鼠接受包含在P(MAA-g-EG)微粒中的胰島素劑量後的血糖反應。接受聚合物劑型後2小時內，觀察到強的低血糖效應(血糖水平降低)。血糖水平的下降強烈地取決於胰島素劑量。在接受胰島素溶液的大鼠未觀測到反應。
給予包括包含胰島素和蛋白酶抑制劑即抑肽酶的P(MAA-g-EG)水凝膠組合物的效果由圖8表示。對照組大鼠給予的是無蛋白酶的含胰島素水凝膠(作為比較)，一組給予50U/kg胰島素溶液(作為對照)。接受聚合物劑型胰島素的這兩組大鼠在給藥後2小時內血糖濃度大幅度下降。而那些接受胰島素和蛋白酶抑制劑即抑肽酶聯合用藥的大鼠其血糖水平下降最大。抑肽酶阻滯腸道酶的降解作用並使胰島素局部釋放而保持較長時間活性。所以，在接受水凝膠胰島素和蛋白酶抑制劑組合物(包膠囊於P(MAA-g-EG)水凝膠中)的大鼠轉運進入血流的胰島素量最高，導致血液葡萄糖濃度的較大降低。
實施例4糖尿病大鼠和犬的體內研究通過施予鏈佐星誘導健康雄性Wistar大鼠患糖尿病。通過施予四氧嘧啶使健康犬患糖尿病。用大量自由基、甲基丙烯酸和聚(乙二醇)二異丁烯酸酯(PEG MW＝1000)懸浮聚合反應製備P(MAA-g-EG)微球。加入作為交聯劑的二異丁烯酸四甘酯。加入佔單體總量0.5％的作為熱反應引發劑的2，2』-偶氮二異丁腈(AIBN)。
通過將胰島素平衡分配入P(MAA-g-EG)微粒中完成藥物負載。牛胰島素溶於200μl 1N NaOH中。用20ml磷酸緩衝液(pH＝7.4)稀釋胰島素溶液並用200μl 0.1N NaOH校準。將最初乾燥的P(MAA-g-EG)在胰島素溶液中膨脹24小時而完成負載。然後過濾顆粒並用100ml 0.1N HCL溶液洗滌從而微粒塌陷並「擠出」殘留的緩衝液。真空乾燥負載了藥物的微球並貯於4℃。用HPLC分析初液和洗滌的過濾液中胰島素濃度來測定負載程度。
在施予負載胰島素的P(MAA-g-EG)水凝膠之前，雄性Wistar大鼠(250g)禁食24小時。仰臥位固定大鼠，使用明膠膠囊和EudragitL100製備的膠囊將負載了胰島素的P(MAA-g-EG)微粒和對照溶液灌胃。明膠膠囊在胃中迅速溶化，而Eudragit膠囊以顯著慢的速度溶解。
試驗期間，大鼠分籠(每籠4隻動物)並可進水。給藥後0.25、0.5、1、2、4、6和8小時由頸靜脈採集0.2ml等份血液樣本。3000rpm離心3分鐘分離血清。使用葡萄糖B-測試試劑盒用葡萄糖氧化酶方法測定血清葡萄糖水平。
糖尿病犬(25kg)在服用製劑之前禁食24小時。使用明膠膠囊的聚合物劑型口服投藥。在投藥時餵食犬。
試驗期間，將犬關進籠內並允許進水。自留置導管採集血液樣本。使用可攜式葡萄糖分析儀測定血清葡萄糖水平。
雖然許多系統能夠有效地降低口服含胰島素聚合物載體後的健康動物的血糖水平，但在糖尿病動物未觀察到類似的結果。糖尿病和健康大鼠在口服含胰島素P(MAA-g-EG)明膠膠囊微粒(劑量25IU/kg)後的血糖反應由圖9表示。糖尿病大鼠的血液葡萄糖水平下降至起始水平的40％。血糖水平下降持續超過8小時，而事實上糖尿病動物的血糖水平下降程度大於健康動物。此外，在糖尿病動物觀察到低血糖效應的持續時間更長。
糖尿病大鼠口服負載胰島素的P(MAA-g-EG)Eudragit膠囊微粒(劑量25IU/kg)後的血糖反應見圖10。單次給藥後接受這些劑量的大鼠的葡萄糖水平下降超過50％至少8小時。用Eudragit包膠囊的微粒較明膠膠囊更為有效，大概是由於包在Eudragit膠囊中的微粒因Eudragit膠囊的緩慢溶解而暴露於上GI道惡劣環境的時間短的緣故。
健康犬在口服單聚合物劑型(10IU/kg)後血糖顯著下降。0時，餵食犬，機體的正常反應維持在基礎水平。餵食後，血糖水平升高，然而，由於胰島素在小腸上段的攝取，給藥後2時內血糖水平下降超過20％。此外，與前面在大鼠觀察到的一致，8小時點附近，出現第二次下降反應，可能由於胰島素的結腸吸收。還有，8小時後血糖水平穩定下降，可能由於胰島素的結腸吸收所致。
糖尿病犬的葡萄糖反應也證實了口服後的胰島素攝取。糖尿病犬的血糖水平由口服的含胰島素的P(MAA-g-EG)明膠膠囊微粒(劑量10IU/kg)控制。餵食並給予聚合物劑型，最初犬的葡萄糖水平迅速升高。然而，由於胰島素的吸收，1小時後葡萄糖水平在接下來的3個小時內保持穩定。接受聚合物劑型的糖尿病犬其血糖水平較未接受胰島素的犬低40％。
口服胰島素釋放系統必須能夠保護藥物免受胃的惡劣環境的破壞並使胰島素在長時段內以生物活性構象形式存在以便沿GI道到達吸收的更適宜區域如小腸上段。由於其性質，絡合P(MAA-g-EG)水凝膠是此應用的理想載體。
P(MAA-g-EG)水凝膠經口服途徑能夠有效釋放生物活性胰島素。這些材料已經顯示出降低糖尿病大鼠和犬的血糖水平並維持血糖在正常水平附近超過8小時。這些材料功能良好，由於胰島素包含在水凝膠中不被釋放直至材料到達小腸上段。在小腸中，水凝膠強烈地粘附於黏膜使得載體和吸收位點密切接觸。此外，聚合物起到阻滯腸道蛋白水解酶活性的作用使得胰島素在吸收前長時間保持活性狀態。據信聚合物對酶功能的抑制作用衍生自聚合物與酶功能所必需的陽離子，如鈣，形成絡合物的能力。
權利要求
1.一種口服給藥的藥學組合物，所述組合物包括可膨脹水凝膠基質和包含在此基質中的不穩定蛋白質，所述水凝膠基質包括甲基丙烯酸和聚(二醇)單甲基丙烯酸酯的交聯共聚物。
2.權利要求1所述組合物，其中聚(二醇)單甲基丙烯酸酯是聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯。
3.權利要求1所述組合物，其中水凝膠基質是與二甲基丙烯酸四甘酯交聯。
4.權利要求2所述組合物，其中甲基丙烯酸和聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯的分子比是約1∶1。
5.權利要求4所述組合物，其中蛋白質分子量為約1,000～約20,000。
6.權利要求4所述組合物，其中蛋白質是胰島素。
7.權利要求4所述組合物，其中聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯的分子量為約200～約4000。
8.權利要求4所述組合物，其中水凝膠是顆粒形並包於膠囊內。
9.權利要求8所述組合物，其中膠囊是明膠膠囊。
10.權利要求4所述的組合物，進一步包括蛋白酶抑制劑。
11.施予脊椎動物的胰島素口服釋放組合物，所述組合物包括包含於P(MAA-g-EG)水凝膠中的胰島素。
12.權利要求1 1所述的組合物，進一步包括蛋白酶抑制劑。
13.權利要求11所述組合物，其中水凝膠是顆粒形並包於膠囊內。
14.權利要求13所述組合物，其中膠囊是明膠膠囊。
15.將治療有效量的蛋白質施予脊椎動物的給藥方法，所述方法包括將權利要求1所述組合物口服給藥施予所述脊椎動物的步驟。
16.製備權利要求1所述組合物的方法，包括以下步驟甲基丙烯酸和聚(二醇)二甲基丙烯酸酯和交聯劑的聚合形成水凝膠基質；所述水凝膠基質與蛋白質的水溶液接觸，其中溶液的pH值大於約5.4；和調整溶液的pH至小於約5.4；並分離含蛋白質的水凝膠基質。
17.權利要求16所述方法，其中聚(二醇)單甲基丙烯酸酯是聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯。
全文摘要
描述了對脊椎動物口服給藥的生物活性組分的組合物和方法。該方法包括將組合物口服給藥施予脊椎動物的步驟,所述組合物包括可膨脹水凝膠基質和包含在水凝膠基質中的生物活性組分。
文檔編號A61K38/28GK1259045SQ98805351
公開日2000年7月5日 申請日期1998年4月2日 優先權日1997年4月2日
發明者N·A·佩帕斯, A·M·洛曼, T·納蓋, M·莫裡施塔 申請人:普渡研究基金會