一種檢驗鑑別遺傳性心肌肥厚相關基因突變的試劑盒的製作方法
2023-05-17 04:56:31 2
專利名稱：一種檢驗鑑別遺傳性心肌肥厚相關基因突變的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，涉及醫學診斷和生物技術，涉及一種檢測肥厚型心肌病相關基因突變的體外診斷試劑盒，具體的是一種採用大規模平行測序平臺技術檢驗鑑別遺傳性心肌肥厚相關基因突變的試劑盒。
背景技術：
心室肌肥厚是一種症狀或者說是一種臨床表現，並不是病名.關於心室肌肥厚，定義就是在心臟中，心室心肌形態上發生變化，數量上增加，造成心室室壁的增厚，而心室的室腔相對空間減小，血容量減少。對於造成心室肌肥厚的原因有多種，比如高血壓，冠心病，肥厚性心肌病，瓣膜病(如主動脈關閉不全)等.除了上述原因外，還有一些遺傳因素造成的代謝障礙、心肌發育過程障礙也會引起心肌肥厚。這些疾病多數起病隱匿、臨床表現 相似，物理檢查差異不大，但是治療方法和預後方面存在巨大的差異。最常見的遺傳性心肌肥厚的原因是肥厚型心肌病。肥厚型心肌病(HCM)是一種原發性的心肌疾病，表現為不明原因的左心室和/或右心室以及室間隔非對稱性的肥厚。它的病理學特徵是肥厚心肌細胞紊亂。臨床表現多樣，可以無症狀，亦可表現為心衰、心律失常、猝死等惡性心臟事件，是年輕人心源性猝死的首位病因，年死亡率1_6%。過去認為HCM是一種罕見的心臟疾病。但近年流行病學調查顯示白人HCM的發病率高達O. 2%。而我國HCM患者超過200萬。可見HCM不再是所謂的罕見疾病。巨大的患病群體和嚴重的臨床預後以及患者帶病生存的質量差，造成了巨大的社會和家庭負擔。西方發達國家20年前就系統地開展了 HCM分子遺傳學研究，已公認的遺傳度最高的心血管疾病，並明確HCM為常染色體顯性遺傳的單基因疾病，即後代只要繼承了父母任何一方(患病者)的含突變基因的染色體即可能發病。已經發現至少15個突變基因、超過700個位點突變是HCM的病因。對於心肌肥厚疾病的鑑別診斷傳統的方法主要依靠臨床表現、心電圖、超聲心動圖和心臟核磁。這些手段存在很大的缺點1.心室肥厚出現時間差異性大，早期無肥厚，有的出現肥厚需幾十年時間；2.導致心室肥厚因素眾多，不僅有時與高血壓難以鑑別，還有很多疾病表現出與HCM完全一致的心臟大體形態學特點，例如Fabry病是一個性連鎖遺傳的溶酶體Ot.半乳糖奇酶缺乏性疾病。此病屬於性連鎖遺傳，致病基因定位在Xq22，目前已經在此基因區內發現了 150個基因突變，其中錯義點突變75 %，基因缺失佔15 %，多數家族表現為個體基因突變。臨床研究證明有6. 3%的年齡超過40以上發病的肥厚性心肌病患者屬於Fabry病。而Fabry病不需要手術幹預,只要藥物替代治療可以的。並且Fabry病發生心源性猝死的風險要遠遠低於肥厚型心肌病。故傳統診斷方法面臨明確診斷時間晚(症狀出現後)、容易發生誤診、難以判斷預後等問題。基因診斷的優勢在於一是特異性高，旦明確致病基因突變，就是100%確診；二是早期診斷，即可在症狀出現前或不可逆病理改變前作出診斷；三是能夠根據基因型判斷良惡性臨床轉歸和預後，提供針對性的「個體化治療」；四是可根據基因型提供遺傳諮詢和生育指導。這一切都揭示了基因診斷在臨床上有巨大的應用前景。由於遺傳性的心肌肥厚性疾病涉及的病種多、基因多、突變位點多。如何經濟有效的進行基因診斷是非常困難的。傳統的PCR、多重PCR、第一代自動測序儀測序都只是針對少量的位點篩查可行。但是面對遺傳性的心肌肥厚涉及如此多的的已知突變位點和大量未知潛在突變位點的診斷目標時，這些方法就暴露出時間長、成本高、操作難度大的軟肋。近年，大規模DNA 平行測序平臺(massively parallel DNA sequencingplatform)已經發展為主流的測序技術，這項測序技術的出現不僅令DNA測序費用降到了以前的百分之一，還讓基因組測序這項以前專屬於大型測序中心的「特權」能夠被眾多研究人員分享。利用這種平臺更能輕鬆地把病人所有涉及心肌細胞發育和功能的基因完整檢測出來，使HCM這類複雜遺傳性疾病的基因診斷成為可能。但是直接使用大規模DNA平行測序平臺檢測的成本目前仍然令個人難以承受。本 發明可以同時把多個甚至幾十病人的遺傳性的心肌肥厚相關基因精確的選擇性捕獲，然後用於大規模測序平臺，可以進一步極大地降低基因診斷的成本，使之廣泛應用於臨床成 為可能。
發明內容
本發明的目的是，提供一種檢測遺傳性的心肌肥厚相關基因突變的多重目標捕獲再測序的試劑盒。該試劑盒提高了基因捕獲的通量和基因平行測序的通量，操作簡便、成本低。為實現上述目的，本發明採用的技術方案是一種新的多重目標捕獲再測序方法，包括以下步驟a.設計並製備用於捕獲遺傳性的心肌肥厚相關基因的突變捕獲探針。並將這些探針結合在磁珠、薄膜或者玻片上。b.將待測基因組DNA樣品分別片段化至100_400bp，然後將末端補平，加入的ATP使片段兩端引入粘性末端。c.分別加入設計好的一端帶有標籤序列的接頭序列片段，加入連接酶，使每個片段都與一對接頭連接，形成新的片段。標籤序列的設定位置在接頭的粘性末端。標籤序列的設計見表I。d.調節反應溫度激活DNA聚合酶，用一對標準引物，對步驟c所得不同基因組完成連接的片段序列混合後進行PCR擴增反應；標準引物見表2。e.將步驟d所得PCR擴增反應產物與步驟a所設計的捕獲探針雜交，雜交反應後通過多次洗脫純化反應，得到待測片段。f.將待測片段通過illumina公司的標準方案進行大規模平行測序。g.將得到的測序結果同標準資料庫進行比較，得到診斷結果。為實現上述技術方案，步驟a所述的捕獲探針可以是脫氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)組成，但不僅限於DNA和RNA。探針的長度從20bp至IOObp不等的與目標互補的片段組成。探針可以是結合在磁珠上的，也可以結合在載玻片上，但不僅限於這些介質。其中，步驟a所述的捕獲探針，包括覆蓋以下基因ACTCI、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2KI、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MY0Z2、PRKAG2、RAFl、SOSU TCAP, TNNCU TNNI3, TNNT2、TPMU TTN, TTR、VCL 全部外顯子片段和兩端50bp範圍內的序列。這些探針以疊瓦式設計，片段長度為15bp-50bp，最優為22bp ;探針之間重疊部分為2-8bp，最優為5bp ;覆蓋度為IX至10X，最優為3X。其中，步驟c所述的接頭在引物結合區的下遊設計標籤，標籤末端為粘性末端可以和基因組片段結合。接頭序列特徵如表I所示。其中，步驟d的引物能夠在同樣條件下效率均一地擴增含有不同標籤接頭的片段，擴增出的片段包含作為標籤的鹼基序列。在步驟d的擴增時，不同樣品已經進行了等量的混合。本發明的主要優點在於I)本發明可以在一次測序反應中同時進行多個不同來源樣本全部遺傳性的心肌 肥厚相關基因的檢測；全部序列直接測出，準確率可以達到99. 99%。2)本發明的試劑盒可以一次完成1-18個樣品的平行捕獲，提高了捕獲效率，極大地降低了樣品準備的成本。3)本發明的試劑盒可以一次完成8-96個樣品的全部遺傳性的心肌肥厚的基因，近4000條序列的平行檢測，充分利用設備的高通量特性，極大降低了每個樣品的測序成本。4)本發明的檢測方法步驟簡單，減少重複操作的環節，因而避免了複雜操作過程中存在的諸多不確定引物，提高了檢測準確率和穩定性。5)本發明所提供的檢測方法所需時間大大少於sanger法的測序技術，檢測的準確度大大優於基因晶片技術，更符合臨床檢測要求。
附圖
是探針設計示意圖。
具體實施例方式下面用實施例僅是對本發明實際應用的舉例描述，本發明的實際應用不僅限於以下實施例實施例一、肥厚型心肌病221 例檢測 MYH7、MYH6、MYBPC3、TNNT2、TNNI3, TNNCUACTCl、TPMl、TTN、CSRP3、DES、DMD、LDB3、VCL, TCAP, PLN、NEXN、ACTN2、FKTN、MYPN、TMPO,ANKRDl、PSENl、PSEN2、ABCC9、SGCD、DSG2、EYA4、DSP、SCN5A、LMNA, MURC 基因外顯子，尋找新的突變位點。一、探針設計根據人類基因組資料庫公布的基因MYH7、MYH6、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TNNCl、ACTCl、TPMl、TTN、CSRP3、DES、DMD、LDB3、VCL、TCAP、PLN、NEXN、ACTN2、FKTN、MYPN、TMPO, ANKRDl、PSENl、PSEN2、ABCC9、SGCD、DSG2、EYA4、DSP、SCN5A、LMNA, MURC 的外顯子序列設計合成探針，探針為RNA，在目標區段疊瓦式設計，探針長度20bp，重疊區域5bp，覆蓋範圍達到目標區段兩端15bp。採用agilent公司的SureSelect緩衝系統體系。二、基因組提取採用 Qiagen FlexiGene DNA Kit (Code No :51204)進行提取待測96份樣本的基因組，OD值達到I. 8-2. 0，各取5ug做為起始模板。三、測序前樣品製備I)目的基因片段化取定量過的96份基因組DNA，稀釋至每100 μ L中含有5 μ g基因組DNAJP 50ng/yL。取110 μ L，用超聲破碎儀分別進行片段化。
2)末端補平取I. 5mL EP管，96份基因組樣品分別按下表所示，在冰盒上加入各種試劑，保持冰浴狀態
權利要求
1.一種檢驗鑑別遺傳性心肌肥厚相關基因突變的試劑盒，其特徵在於捕獲目的基因探針；一對用於擴增待測片段的通用引物；12對加入不同標籤的測序接頭序列；緩衝液；dNTP ；高保真聚合酶；Dynabeads M-280 Streptavidin (invitrogen 公司，112-06D)磁珠。
2.根據權利要求I所述的肥厚型心肌病基因檢測試劑盒其特徵在於；捕獲ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MY0Z2、PRKAG2、RAFI、SOSI、TCAP、TNNCI、TNNI3、TNNT2、TPMl、TTN、TTR、VCL全部外顯子片段以及鄰近50bp的非編碼區的探針。
3.權利要求2所述的探針可以是寡聚核糖核酸(RNA)，也可以是寡聚脫氧核糖核酸(DNA)，但是不僅限於RNA和DNA，可以包括修飾後的DNA或者RNA等。
4.根據權利要求2所述的探針可以是結合在磁珠上的，也可以結合在載玻片上，但不僅限於這些介質。
5.權利要求2所述的探針針對目標區域以疊瓦式設計，探針序列與目標區域為互補序列。
6.權利要求2所述的探針長度在15-50bp，最優為22bp;探針之間重疊區域為2_10bp，最優為5bp。
7.根據權利要求I所述的一種檢驗鑑別遺傳性心肌肥厚相關基因突變的試劑盒其特徵在於；12對加入不同標籤的接頭序列；
8.權利要求5種所述的標籤特徵是標籤序列的位置接頭的最內側，通過粘性末端與待測片段結合；接頭5』和3』端分別進行磷酸化和硫化修飾。
9.按照權利要求I所述，根據權利要求I所述的檢驗鑑別遺傳性心肌肥厚相關基因突變的試劑盒其特徵在於一對通用引物，可以擴增任何加入了標籤接頭的目的片段，其反應體系和條件完全一致。
10.一種基因檢測遺傳性心肌肥厚的方法，其特徵在於，所述方法包括以下內容 a.設計並製備捕獲ACTCl、ACTN2、BRAF, CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS, JPH2、KRAS,LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MY0Z2、PRKAG2、RAFl、SOSI、TCAP、TNNCl、TNNI3、TNNT2、TPMl、TTN, TTR、VCL全部外顯子片段以及鄰近50bp的非編碼區的探針； b.將多個待測DNA樣品分別連接到設計好的加了特異性標籤的接頭； c.將經過步驟b所得的不同樣品的DNA片段混合然後使用設計好的通用引物進行擴增； d.將處理好的待測DNA片段混合物和步驟a所得探針加入反應管中，DNA樣本與探針雜交，通過洗脫得到待測的目標片段； e.調節反應溫度激活DNA聚合酶，用一對通用引物對步驟d所得序列進行PCR擴增反應； f.將步驟e所得PCR擴增反應產物通過大規模基因平行分析平臺進行測序。大規模基因平行分析平臺可以是illumina公司的GA系列，但是不僅限於此測序平臺。
g.根據標籤特徵分別對不同來源的基因樣本比對進行數據分析。
全文摘要
本發明涉及一種檢測遺傳性心肌肥厚相關基因突變樣品製備試劑盒。具體的涉及一種應用大規模平行測序平臺技術檢測遺傳性心肌肥厚相關基因的產品，該試劑盒包括a)獨特設計並製備捕獲探針，針對基因ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、PRKAG2、RAF1、SOS1、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、VCL全部外顯子片段；b)設計獨特帶有標籤序列的接頭；c)通用引物對探針序列進行PCR擴增；d)設計獨特的混合後目的片段的捕獲操作。這個方法和試劑盒製備的大規模平行測序平臺樣品通量大、效率高、操作簡便，極大地降低了測序檢驗成本。
文檔編號C12Q1/68GK102965428SQ20111029385
公開日2013年3月13日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者侯青 申請人:康旭基因技術(北京)有限公司