提取和純化非變性蛋白質的方法與流程

2023-05-17 04:56:01 3

相關申請案的交叉引用

本申請案要求2014年10月6日申請的美國臨時申請案第62/060,400號和2014年10月1日申請的62/058,211的優先權，它們都以全文引用的方式併入本文中。

本文涉及用於提取和純化蛋白質的材料和方法，並且具體來說涉及用於提取和純化在低溫下變性的蛋白質的材料和方法。

背景技術：

未變性狀態的低溫變性蛋白質對於食品仿真產品(例如乳酪或肉類仿真產品，例如牛肉仿真產品)的成功至關重要。現有商業蛋白質提取工藝包括降解蛋白質的單元操作和條件，並且不適用於製造含有這類蛋白質的產品。另外，大部分蛋白質具有相關的顏色和氣味，這可能對其在食品仿真產品中的效用有負面影響。

技術實現要素：

本文至少部分基於用於從植物材料提取和純化蛋白質，使得蛋白質保留其非變性狀態而不具有其相關顏色和氣味的工藝的開發。舉例來說，本文至少部分基於如下出人意料的發現，親水性聚合物並且具體來說聚乙二醇(peg)可以從蛋白質溶液吸附有顏色和有氣味的化合物。

一方面，本文提供一種用於從生物質純化蛋白質的方法。所述方法可以包括用含有peg和任選地絮凝劑的水溶液提取生物質，產生含有大塊固體和提取物的提取漿液；任選地將提取漿液的ph調整到ph2到10；收集提取物並且添加鹽形成兩相混合物；分離兩相混合物產生peg相和產物相；以及收集和過濾產物相產生含有蛋白質的經過濾的產物相。生物質可以包括植物材料。(例如花或葉子)。植物可以是藻類、玉米、小麥、大米、高粱、黑麥、芥花、小米、大麥、大豆、向日葵、紅花、菸草、苜蓿、馬鈴薯、芸苔屬、棉花、西紅柿或菸草。蛋白質可以是核酮糖二磷酸羧化酶。peg的分子量可以是約8000。絮凝劑可以包括烷基胺表氯醇。鹽可以包括硫酸鎂。分離步驟可以包括重力沉降或離心(例如使用圓盤堆疊離心機)。過濾可以包括微過濾。所述方法可以進一步包括濃縮和透濾經過濾的產物相，產生產物濃縮物。透濾可以包括使用超濾膜系統。所述方法可以進一步包括對產物濃縮物滅菌，獲得經滅菌的產物濃縮物。滅菌可以包括uv照射、巴氏滅菌或微過濾。所述方法可以進一步包括乾燥所述經滅菌的產物濃縮物。乾燥可以包括在溫和條件下使用噴霧乾燥器或冷凍乾燥器。

另一方面，本文提供一種從蛋白質溶液去除雜質的方法。所述方法可以包括向蛋白質溶液添加親水性聚合物和鹽，產生聚合物富集相和蛋白質相，並且分離聚合物富集相與蛋白質相。親水性聚合物可以是peg。peg的分子量可以是約8000。所述方法可以進一步包括向蛋白質溶液添加絮凝劑。絮凝劑可以含有烷基胺表氯醇。鹽可以包括硫酸鎂。所述方法可以進一步包括將蛋白質溶液的ph調整到ph2到10。蛋白質可以是核酮糖二磷酸羧化酶。分離可以包括重力沉降或離心(例如使用圓盤堆疊離心機離心)。所述方法可以進一步包括過濾所述蛋白質相產生經過濾的產物相(例如通過微過濾)。所述方法可以進一步包括濃縮和透濾經過濾的產物相，產生產物濃縮物。透濾可以包括使用超濾膜系統。所述方法可以進一步包括對產物濃縮物滅菌，獲得經滅菌的產物濃縮物(例如通過uv照射、巴氏滅菌或微過濾)。所述方法可以進一步包括乾燥所述經滅菌的產物濃縮物(例如在溫和條件下使用噴霧乾燥器或冷凍乾燥器)。

本文還提供一種含有核酮糖二磷酸羧化酶和親水性聚合物的組合物，其中親水性聚合物以低於約0.1％(w/w)的濃度存在。親水性聚合物可以是peg。親水性聚合物可以低於約0.01％(w/w)的濃度存在。

另一方面，本文提供一種用於純化蛋白質的方法，其中所述方法包括提供已經去除固體的蛋白質懸浮液；任選地向蛋白質懸浮液添加鹽；任選地將蛋白質懸浮液的ph調整到ph2到10；針對peg溶液滲析蛋白質懸浮液，或使peg在膜的滲透側的方式對蛋白質懸浮液進行超濾；以及使經滲析或超濾的蛋白質溶液進行一或多個濃縮或過濾步驟，產生含有蛋白質的產物相。蛋白質懸浮液可以含有一或多種來自植物材料的蛋白質。植物材料可以包括花或葉子。植物可以是藻類、玉米、小麥、大米、高粱、黑麥、芥花、小米、大麥、大豆、向日葵、紅花、菸草、苜蓿、馬鈴薯、芸苔屬、棉花、西紅柿或菸草。蛋白質可以是核酮糖二磷酸羧化酶。peg的分子量可以是約8000。提供步驟可以包括提取經分解的生物質以去除固體並且產生蛋白質懸浮液，任選地向生物質添加絮凝劑。絮凝劑可以包括烷基胺表氯醇。提取可以包括使用重力沉降或離心來分離固體與蛋白質懸浮液。鹽可以包括硫酸鎂。一或多個過濾步驟可以包括透濾。所述方法可以包括濃縮和過濾經滲析或超濾的蛋白質溶液，產生產物濃縮物。所述方法可以進一步包括對產物濃縮物滅菌，獲得經滅菌的產物濃縮物，和/或乾燥經滅菌的產物濃縮物(例如在溫和條件下使用噴霧乾燥器或冷凍乾燥器)。

另一方面，本文提供一種用於純化蛋白質的方法，其包含提供已經去除固體的蛋白質懸浮液；任選地向蛋白質懸浮液添加鹽；任選地將蛋白質懸浮液的ph調整到ph2到10；向包含peg的支撐物施加蛋白質懸浮液；以及收集未保留在支撐物上的蛋白質相。蛋白質懸浮液可以含有一或多種來自植物材料的蛋白質。植物材料可以包括花或葉子。植物可以是藻類、玉米、小麥、大米、高粱、黑麥、芥花、小米、大麥、大豆、向日葵、紅花、菸草、苜蓿、馬鈴薯、芸苔屬、棉花、西紅柿或菸草。蛋白質可以是核酮糖二磷酸羧化酶。peg的分子量可以是約8000。提供步驟可以包括提取經分解的生物質以去除固體並且產生蛋白質懸浮液，任選地向生物質添加絮凝劑。絮凝劑可以包括烷基胺表氯醇。提取可以包括使用重力沉降或離心來分離固體與蛋白質懸浮液。鹽可以包括硫酸鎂。所述方法可以包括用包含peg的支撐物培育蛋白質懸浮液持續24到48小時。所述方法可以進一步包括濃縮蛋白質相產生產物濃縮物，和/或對產物濃縮物滅菌獲得經滅菌的產物濃縮物，和/或乾燥經滅菌的產物濃縮物(例如在溫和條件下使用噴霧乾燥器或冷凍乾燥器)。

除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。儘管可以使用與本文所述的那些方法和材料類似或等效的方法和材料實踐本發明，但適合的方法和材料描述如下。本文提到的所有公開案、專利申請案、專利和其它參考文獻都以全文引用的方式併入。在矛盾的情況下，將以本說明書(包括定義)為準。另外，材料、方法和實例僅僅是說明性的並且不打算是限制性的。

在附圖和以下描述中闡述本發明的一或多個實施例的細節。本發明的其它特徵、目標和優勢將在具體實施方式和附圖以及權利要求書中顯而易知。

附圖說明

圖1為顯示如本文所提供的提取和純化過程的通用實施例的步驟的流程圖。

圖2a為顯示如本文所提供的提取和純化過程的一個實施例的步驟的流程圖。圖2b為描繪圖2a中所描繪的方法的替代實施例的流程圖。

圖3為顯示如本文所提供的提取和純化過程的另一個實施例的步驟的流程圖。

圖4為顯示基於ph的純化過程的一個實施例的步驟的流程圖。

圖5為顯示色譜純化過程的一個實施例的步驟的流程圖。

圖6為顯示膨脹床色譜純化過程的一個實施例的步驟的流程圖。

圖7為顯示利用膜的純化過程的一個實施例的步驟的流程圖。

圖8為顯示利用固定peg的純化過程的一個實施例的步驟的流程圖。

圖9為顯示peg再循環方法的一個實施例的步驟的流程圖。

圖10為顯示如本文所提供的提取和純化過程的另一個實施例的步驟的流程圖，指示可能添加的有用步驟。

具體實施方式

未變性狀態的低溫變性蛋白質對於食品仿真產品(例如牛肉仿真產品)的成功至關重要。然而，現有商業蛋白質提取工藝可能導致這類蛋白質的變性。另外，可能在食品仿真產品中具有功能的大部分蛋白質具有相關顏色和氣味，這可能降低或抑制其應用。舉例來說，核酮糖二磷酸羧化酶(核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶)代表了植物葉綠體中的約30到50％可溶性蛋白質，它的綠色顏色和青草味氣味可能抑制其在食品仿真產品中的應用。核酮糖二磷酸羧化酶也在低溫(50℃到60℃)下變性。別處針對提取核酮糖二磷酸羧化酶報導的方法包括例如在50℃到60℃下基於加熱的沉澱、用高濃度的還原劑提取、非核酮糖二磷酸羧化酶蛋白質的基於溫度的沉澱、碳吸附、基於結晶的純化和/或在ph11下提取隨後在ph4.5下沉澱蛋白質以及用有機溶劑大規模洗滌(參看例如美國專利案第3,959,246號、第4,006,078,4,334,024號以及第4,588,691號；pct公開案第wo2011/078671號；拉姆索(lamsal)等人,美國農業工程師學會會報(trans.asae)46(3):715-720,2003)；以及楊(yang)等人,農業與食品化學雜誌(j.agric.foodchem.)52:2223-2225,2004)。

本文所提供的材料和方法可以用於提取和純化足夠量並且具有可用於食品仿真產品中的適合特徵的低溫變性蛋白質(諸如核酮糖二磷酸羧化酶)。這些方法可以在低至一個步驟中提供高純度的產品，並且在一些情況下，不使用色譜法。所述方法還可以提供通過使用化學行業的常規提取設備按比例放大的可能性，並且具有低資本支出和提高的製造回收率。

本文所提供的方法可以包括使用親水性聚合物，諸如聚乙二醇(peg)。舉例來說，一種方法可以包括peg分散和提取有色體的步驟，隨後含水的兩相分離步驟。在一些實施例中，peg相的體積濃度可以是2％(w/v)到50％(w/v)peg(例如2-10％(w/v)、10-25％(w/v)或25-50％(w/v))，潛在地鹽析蛋白質。有色體對peg的親和力可能導致其與混合物的其餘部分分離。peg的分子量在約300到約300,000範圍內(例如300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000或300,000、約300到約3000、約3000到約10,000、約10,000到約30,000、約30,000到約100,000，或約100,000到約300,000)。在一些情況下，舉例來說，peg的分子量可以是約8000。

在一些實施例中，生物質(例如花、葉子或其它植物材料)可以通過粉碎機和/或高剪切混合機研磨，接著用含有peg(例如分子量8000peg)和任選地一或多種含有烷基胺表氯醇、聚二甲基二烯丙基氯化銨或多元胺(例如或)的絮凝劑的水提取，形成提取漿液。一或多種絮凝劑可以幫助減少離心分離液中留存的微細固體的量並且略微減少離心分離液的顏色。peg的存在可以提高蛋白質的溶解度並且可以提高產量；還觀測到peg會減少提取物中留存的微細固體的量。

接著可以傾析(例如使用傾析式離心機)提取漿液來分大塊固體與提取物。提取物可以收集到攪拌槽反應器中，並且可以向其中添加鹽形成兩相混合物。鹽可以使peg形成不連續相併且從溶液分離出來。適用的鹽包括例如金屬(例如鈉、鉀、鈣、鎂、鋅、鐵、鈷或鋁)與抗衡離子(例如氯離子、溴離子、硫酸根、硝酸根、乙酸根、氰離子、檸檬酸根、碳酸根、乙酸根或磷酸根)的鹽。在一些實施例中，鹽是nacl或mgso4。還可以使用鹽的混合物。鹽濃度可以是約100mm到約2m(例如100到200mm、200到500mm、500到750mm、750mm到1m或1到2m)。

由例如葉綠素、類胡蘿蔔素、類黃酮的小分子組成的有色化合物和反應產物(例如酶促、氧化或褐變反應產物)可以排斥體積選擇性地留在peg相中，而蛋白質留在鹽水溶液中。有氣味化合物(例如青草味、綠色氣味化合物)也可以排斥體積留在peg相中。兩相混合物接著可以分離成peg相和產物相(例如通過重力沉降或使用離心機，例如圓盤堆疊離心機)。回收的peg層可以送回到提取槽用於隨後提取，直到其被有色組分飽和。這時，peg相可以經熱處理來分離純peg和溶液中的有色體。應注意，在一些實施例中，在固體分離步驟之後，可以向相分離步驟添加peg(和任選的絮凝劑)。

與兩相混合物分離的產物相可以經微過濾(例如通過切向流過濾系統或一次性通過空端微過濾系統)來分離任何殘餘微細固體和微生物。經過濾的產物相可以使用超濾膜系統或色譜法與超濾膜系統的組合濃縮並且用水透濾，產生產物濃縮物。這一步驟可以允許分離經過濾的產物相中的剩餘peg和鹽。產物濃縮物還可以進行微生物減少步驟，其可以包含例如巴氏滅菌(例如高溫短時巴氏滅菌或高壓巴氏滅菌)、uv照射或γ照射。在一些情況下，非熱方法可能適用。產物濃縮物(滅菌或非滅菌)可以在溫和條件下使用噴霧乾燥器或冷凍乾燥器等乾燥，確保蛋白質不變性，產生脫色脫味的純蛋白質。應注意，產物可以含有低含量(例如低於約1％(w/w)、0.1％(w/w)、0.01％(w/w)、約0.001％(w/w)、約0.0001％(w/w)或約0.00001％(w/w))peg。

在一些實施例中，親水性聚合物(例如peg)並非必須與蛋白質懸浮液物理接觸，但可以經孔徑足夠小以防止聚合物或目標蛋白質轉移的滲透膜與蛋白質懸浮液分離。舉例來說，peg和蛋白質懸浮液可以經孔徑為約3kda到約500kda(例如3到5kda、5到10kda、10到30kda、30到50kda、50到100kda或100到500kda)的膜分離。peg相的濃度可以是2-50％(w/v)peg(例如2-10％、10-25％或25-50％)。蛋白質懸浮液可以含有一或多種鹽來促進有色體和異味化合物轉移。在一些實施例中，還可以調整蛋白質溶液的ph(例如調整到介於2與10之間的ph)來促進有色和異味化合物的轉移。如上所述，蛋白質懸浮液可以包括鹽，例如(但不限於)金屬(例如鈉、鉀、鈣、鎂、鋅、鐵、鈷或鋁)與抗衡離子(例如氯離子、溴離子、硫酸根、硝酸根、乙酸根、氰離子、檸檬酸根、碳酸根、乙酸根或磷酸根)的鹽(例如nacl或mgso4)，或鹽的混合物。同樣，鹽濃度可以在約100mm到約2m範圍內。有色體對peg的親和力可能導致其與混合物的其餘部分分離。如上所述，peg的分子量可以在約300da到約300,000da範圍內(例如約8000da)。使用peg以間接脫去有色體和異味化合物可尤其適用於可能在低peg濃度下沉澱(因此使隨後的相分離成問題)的蛋白質。舉例來說，peg可以跨膜使用，以從(但不限於)大豆7s和豌豆白蛋白蛋白質去除異味。

使用膜保持蛋白質懸浮液與peg相分離可以消除對相分離步驟的需要。蛋白質和peg懸浮液可以使用多種方法與滲透膜接觸，所述方法例如滲析、返流過濾、超濾、微過濾或納米過濾。所述膜可以由多種材料中的任一種製成，包括聚合物，例如聚醚碸、聚丙烯、聚偏二氟乙烯、聚丙烯腈、乙酸纖維素以及聚碸。在一些實施例中，膜可以併入到物理基質中，例如陶瓷或鋼。

在一些涉及使用膜的實施例中，生物質(例如花、葉子或其它植物材料)可以通過粉碎機和/或高剪切混合機磨碎，接著用含有一或多種絮凝劑(例如或)的水提取，形成提取漿液。絮凝劑可以幫助減少離心分離液中留存的微細固體的量，並且還可以減少離心分離液的顏色。提取漿液接著可以使用傾析式離心機傾析或穿過螺旋壓力單元來分離大塊固體和離心分離液。離心分離液可以經切向流過濾系統或一次性通過空端微過濾系統微過濾，去除任何殘餘微細固體和微生物。微過濾滲透物可以收集於槽中並且可以添加鹽以達到特定導電性。這一溶液接著可以針對8％peg溶液用uf膜透濾。一旦產物脫色，可以停止peg透濾，並且所得材料可以濃縮並且用水透濾，以獲得低鹽濃縮脫色的蛋白質(例如核酮糖二磷酸羧化酶)。在一些實施例中，可以對樣品進行離心以去除固體。產物濃縮物還可以經歷微生物減少步驟，其可以包含例如巴氏滅菌(例如高溫短時巴氏滅菌或高壓巴氏滅菌)、uv照射或γ照射。在一些情況下，非熱方法可能適用。產物濃縮物接著可以在溫和條件下使用噴霧乾燥器、冷凍乾燥器等乾燥，確保蛋白質不變性，因此產生脫色脫味的純蛋白質。

在一些實施例中，親水性聚合物在與蛋白質懸浮液接觸之前可以經固定。同樣，生物質(例如花、葉子或其它植物材料)可以使用粉碎機和/或高剪切混合器研磨，並且任選地可以添加一或多種含有烷基胺表氯醇、聚二甲基二烯丙基氯化銨或多元胺(例如或)的絮凝劑形成提取漿液，並且懸浮液任選地可以例如通過傾析、沉降或離心來澄清化，從而去除固體。蛋白質的懸浮液接著可以暴露於經固定的親水性聚合物(例如peg)。在一些實施例中，經固定的peg可以樹脂形式存在。樹脂可以由具有peg分子塗層的固體核建構。固體核可以含有多種材料中的任一種，例如瓊脂糖、聚碳酸酯、羥基磷灰石、玻璃、金屬、木炭、二氧化矽、氧化鋁、陶瓷、聚丙烯、聚苯乙烯或二乙烯基苯。如上所述，peg的分子量可以在約300da到約300,000da範圍內(例如約8000da)。在一些實施例中，peg可以通過交聯固定，形成樹脂，例如novapeg(emd密理博(emdmillipore)；麻薩諸塞州比勒利卡(billerica,ma))。在其它實施例中，peg可以固定於膜上。對於上文所述的方案，蛋白質懸浮液可以含有一或多種鹽來促進有色體轉移(例如100mm到2m範圍內存在的鹽，包括金屬(例如鈉、鉀、鈣、鎂、鋅、鐵、鈷或鋁)與抗衡離子(例如氯離子、溴離子、硫酸根、硝酸根、乙酸根、氰離子、檸檬酸根、碳酸根、乙酸根或磷酸根)的鹽)。

在利用經固定的親水性聚合物(例如peg)的方法的一些實施例中，可以通過將樹脂添加到蛋白質懸浮液來將蛋白質懸浮液暴露於所述樹脂上的聚合物。在4℃到45℃(例如4℃到10℃、10℃到20℃，或20℃到45℃)下足以允許有色體與peg締合的時間段(例如1分鐘到48小時，例如1到10分鐘、10到30分鐘、30到60分鐘、60分鐘到2小時、2到4小時、4到6小時、6到12小時、12到24小時或24到48小時)之後，可以通過多種方法分離蛋白質與經固定的peg，所述方法包括重力過濾、真空或離心過濾、沉降和傾析，或離心和分離離心分離液。經固定的peg任選地可以經洗滌以去除所夾帶的蛋白質。

在一些實施例中，經固定的peg可以用作色譜樹脂。蛋白質懸浮液可以在有色體結合於樹脂但目標蛋白質流過床並且被收集的條件下穿過樹脂床。同樣，蛋白質相可以含有一或多種鹽來促進有色體的結合。

經脫色脫味的蛋白質懸浮液可以經進一步加工產生經脫色脫味的蛋白質粉末。舉例來說，經脫色的蛋白質可以濃縮和透濾。在一些實施例中，經脫色的蛋白質懸浮液可以經離心去除固體。濃縮物還可以進行微生物減少步驟。如上所述，這類程序可以包括巴氏滅菌(例如高溫短時巴氏滅菌或高壓巴氏滅菌)、uv照射或γ照射，或非熱方法。產物濃縮物接著可以在溫和條件下乾燥(例如使用噴霧乾燥器、冷凍乾燥器等)，確保蛋白質不變性，產生脫色脫味的純蛋白質。

現在轉而參看圖式，圖1是描繪如本文所提供的方法的一個實施例中的通用步驟的流程圖。一般來說，提取步驟110(例如使用分解/研磨/均質化生物質和緩衝液)可以後面接著是固體分離步驟120(例如通過傾析和添加絮凝劑，以及任選地還有peg)、顏色去除步驟130(例如通過添加peg和鹽，以及任選地絮凝劑，在一些實施例中後面是色譜法、ph沉澱和再增溶)、滅菌步驟140(例如通過微過濾、巴氏滅菌或uv照射)和濃縮步驟150(例如通過超濾或薄膜蒸發，後面是乾燥)。

圖2是描繪如本文所提供的提取和純化方法的一個示範性實施例中的步驟的流程圖。蛋白質富集固體進行分解步驟210，後面是使用含有peg和任選地一或多種絮凝劑的水溶液的提取220。在步驟230中分離出固體。向提取物添加鹽(例如經再循環步驟265)，並且相分離步驟240分離peg與蛋白質產物相。peg在步驟245中再循環用於將來的提取步驟。蛋白質產物相進行過濾步驟250，後面是濃縮步驟260，在此期間去除鹽並且經步驟265再循環用於將來的相分離步驟。濃縮的蛋白質產物進行滅菌步驟270和乾燥步驟280，產生脫色脫味的非變性蛋白質產物。使用這一方法的實例提供於下文實例1中。

圖2b是顯示圖2a中描繪的方法的替代實施例中的步驟的流程圖。在這一實施例中，向相分離步驟240中添加peg和任選地絮凝劑，並且peg再循環到進一步相分離步驟。

圖3是描繪如本文所提供的提取和純化過程的另一個實施例中的步驟的流程圖，其中在初始提取步驟之後添加peg。蛋白質富集固體進行分解步驟310，後面是使用任選地含有一或多種絮凝劑的水溶液的提取步驟320。在步驟330中分離固體，並且提取物分別在步驟340和350中過濾和濃縮。添加peg和鹽產生多相混合物。在步驟360中分離各相。peg在步驟365中再循環用於將來的分離步驟。蛋白質產物相在步驟370中濃縮，在此期間去除鹽並且在步驟375中再循環用於將來的相分離和/或濃縮步驟。濃縮的蛋白質產物進行滅菌步驟380和乾燥步驟390，產生脫色脫味的非變性蛋白質。

圖4是描繪基於ph的純化過程的一個實施例中的步驟的流程圖。蛋白質富集固體進行分解步驟410，後面是使用添加的提取緩衝液的提取步驟420(例如任選地含有絮凝劑的水溶液)。在步驟430中分離固體，並且剩餘溶液在步驟440中過濾，並且在步驟450中濃縮。在步驟460中混合稀酸與濃縮物，並且在步驟470中分離出蛋白質。在步驟475中混合稀鹼與蛋白質，隨後蛋白質產物進行滅菌步驟480和乾燥步驟490。這一方法的用途的實例提供於下文實例3中。

圖5為描繪色譜純化過程的一個實施例中的步驟的流程圖。蛋白質富集固體進行分解步驟510，後面是使用提取緩衝液的提取步驟520(例如任選地含有絮凝劑的水溶液)。在步驟530中分離固體，並且剩餘溶液在步驟540中過濾，並且在步驟550中濃縮。在步驟560中將濃縮物施加於色譜柱(例如凝膠過濾柱)並且洗出非蛋白質和未結合材料。洗脫蛋白質並且接著在步驟570中濃縮，隨後經濃縮的蛋白質產物進行滅菌步驟580和乾燥步驟590。這一方法的用途的實例提供於下文實例4中。

圖6為描繪膨脹床色譜純化方法的一個實施例的步驟的流程圖。蛋白質富集固體進行分解步驟610，後面是使用添加的提取緩衝液的提取步驟620(例如任選地含有絮凝劑的水溶液)。在步驟630中分離固體。在步驟640中將剩餘溶液施加於色譜柱(例如離子交換柱，或基於疏水性相互作用或純吸附的系統，例如活化碳)，並且洗出非蛋白質和未結合材料。洗脫蛋白質接著在步驟660中濃縮，隨後經濃縮的蛋白質產物進行滅菌步驟670和乾燥步驟680。

圖7是說明使用膜保持蛋白質懸浮液與peg溶液分離的方法的一個實施例中的步驟的流程圖。蛋白質富集固體進行分解步驟710，後面是使用水和任選的絮凝劑的提取步驟720。在步驟730中去除固體，並且使用微過濾步驟740去除微細殘餘固體和/或微生物。在步驟750中，針對peg跨膜透濾濾液，這是可以包括例如滲析、返流過濾、超濾、微過濾或納米過濾的步驟。接著在步驟760中濃縮蛋白質溶液，在步驟770中透濾去除鹽，並且進行滅菌步驟780和乾燥步驟790。

圖8是說明使用經固定的peg去除著色劑和有氣味化合物的方法的一個實施例中的步驟的流程圖。蛋白質富集固體進行分解步驟810，後面是使用水和任選的絮凝劑的提取步驟820。在步驟830中去除固體，並且將蛋白質懸浮液添加到經固定的peg(例如在色譜柱中或作為分批色譜步驟)並且在步驟840中培育。在步驟850中，濃縮蛋白質溶液，後面是滅菌步驟860和乾燥步驟870。

圖9是描繪peg再循環方法的一個實施例中的步驟的流程圖。添加peg和相分離之後(例如圖2和3中描繪並且上文所述)，可以在步驟910中再懸浮peg層中的peg，接著進行碳吸附步驟920。peg可任選地在步驟930中(例如通過微過濾、巴氏滅菌或uv照射)滅菌。

圖10為顯示如本文所提供的提取和純化方法的一個實施例中的步驟的流程圖，其包括添加的有用步驟。來自分離步驟(例如如本文所述的基於peg的方法中)的所提取的固體和溶劑進行提取步驟1010，後面是分離步驟1020。在步驟1030中蒸發溶劑，獲得例如類胡蘿蔔素、葉綠素、類黃酮和醇溶谷蛋白等化合物。富含纖維的廢固體在步驟1040中球粒化並且例如用於例如寵物飼料的產品中，或進行酶消化步驟1050，接著是發酵步驟1060和固體分離步驟1070。去除發酵的廢固體。溶劑在步驟1080中蒸發，獲得未發酵的可溶性化合物，以及可以用作例如生物燃料的其它材料。

本發明將在以下實例中進一步描述，所述實例不限制權利要求書中所述的本發明的範圍。

實例

實例1-菠菜核酮糖二磷酸羧化酶分離

將一千克新鮮菠菜葉在3摻合機(俄亥俄州克利夫蘭的維他美仕公司(vitamixcorp.,cleveland,oh))中以1:1(w/w)的比率用含有8％(w/v)peg(carbowaxsentrypeg8000；密西根州米德蘭的陶氏化學公司(dowchemicals,midland,mi))和0.1％(w/v)陽離子絮凝劑(863a；德克薩斯州休斯頓的端福克公司(tramfloc,inc.,houston,tx))的磷酸鉀緩衝液(ph7.4)浸軟。在最高設置(3hp電動機)下進行提取3分鐘，始終使溫度維持在30℃以下。磨碎後使用10mnaoh溶液將ph調整到7.4。勻漿使用臺式離心機(allegrax15r，sx4750轉子；加利福尼亞州帕薩迪納的貝克曼庫爾特公司(beckmancoulter,inc.,pasadena,ca))在3500g下離心5分鐘。棄去離心塊並且單獨收集清液層(約1.6l)。將七水合硫酸鎂鹽(德國卡塞爾的k+skali有限公司(k+skaligmbh,kassel,germany))添加至清液層中以達到1m濃度。將溶液徹底混合併且使用臺式離心機(allegrax15r，sx4750轉子；貝克曼庫爾特公司)在5451g下離心3分鐘。在離心瓶中形成三層，並且其餘的綠色固體以離心塊形式被分離出(約0.1l)。分離peg層(約0.3l)並且形成頂層，選擇性分級分離有色化合物和有氣味的化合物。中間層中剩餘的澄清產物蛋白質接著使用中空纖維型式的0.2μm改性的聚醚碸(mpes)膜(k02e20u-05n；加利福尼亞州多明格斯牧場的光譜實驗室公司(spectrumlaboratories,inc.,ranchodominguez,ca)微過濾。保留物(約0.25l)使用約0.75l的1m硫酸鎂溶液透濾。來自這一過濾步驟的滲透物(約3l)使用70kdampes膜(minikrosn02e070-05n；光譜實驗室公司(spectrumlaboratories,inc.))濃縮到約0.1l。將其用約0.5l去離子水分5步進行進一步透濾。蛋白質濃縮物的ph為約7並且導電率小於5ms/cm。所得蛋白質濃縮物為澄清的淺黃色。產物使用噴霧乾燥器乾燥，或使用冷凍乾燥器冷凍並乾燥。使用標準660nm皮爾斯蛋白質分析(pierceproteinassay)和sds凝膠密度測定法分析這一材料。使用ir溼度分析儀分析乾燥固體。使用滴定方法分析最終產物中的絮凝劑和peg濃度。蛋白質濃度為約91％(w/w)，並且總固體為約95％(w/w)。peg和絮凝劑濃度經分析小於0.2％(w/w)。產物純度超過90％，且在整個工藝中的回收率超過90％。所獲得的產物脫色並且保留低溫變性特性。

實例2-苜蓿核酮糖二磷酸羧化酶分離

在含有8％(w/v)peg(carbowaxsentrypeg8000；陶氏化學公司(dowchemicals))和0.1％(w/v)陽離子絮凝劑(863a；端福克公司)的有夾套的攪拌槽中製備兩千升提取緩衝液(ph7.4的磷酸鉀)。將五百千克新鮮苜蓿葉在corencom12da粉碎機(加利福尼亞州聖羅莎的克倫可(corenco,santarosa,ca))中浸軟，在磨碎期間連續再循環提取緩衝液以改善分解並且將工藝溫度始終維持在低於40℃。磨碎後使用10mnaoh溶液將ph調整到7.4。勻漿在3500g下在約5加侖每分鐘(gpm)的饋入速率下使用gea韋斯伐裡亞傾析機gce-345(新澤西新澤西州的gea機械設備(geamechanicalequipment,newjersey,nj))離心。棄去離心塊。將約625kg硫酸鎂鹽(k+skali有限公司)添加到液體離心分離液(約2200l)中。將溶液徹底混合併且在約5gpm的饋入速率下用gea韋斯伐裡亞分離器esd-30(gea機械設備)離心。綠色固體作為球粒排出，損失約10％(v/v)饋料。分離peg層(饋料的約20％v/v)並且形成頂層，選擇性分級分離有色化合物和有氣味的化合物。中間層中剩餘的澄清產物蛋白質接著使用呈中空纖維型式的0.2μm改性mpes膜(k02e20u-05n；光譜實驗室公司)微過濾。保留物(約200l)使用約400l的1m硫酸鎂溶液透濾。來自這一過濾步驟的滲透物使用70kdampes膜(km-070e-300-01n；光譜實驗室公司)濃縮到約50l。將其用約250l去離子水分5步進行進一步透濾。蛋白質濃縮物的ph為約7並且導電率小於5ms/cm。所得蛋白質濃縮物為澄清的淺黃色。產物使用噴霧乾燥器乾燥，或使用冷凍乾燥器冷凍並乾燥。使用標準660nm皮爾斯蛋白質分析和sds凝膠密度測定法分析這一材料。使用ir溼度分析儀分析乾燥固體。蛋白質濃度為約880g/l，並且總固體為約95％(w/w)。peg和絮凝劑濃度經分析小於0.2％(w/w)。產物純度超過90％，且在整個工藝中的回收率超過90％。所獲得的產物脫色並且保留低溫變性特性。

實例3-使用基於ph的純化的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶分離

一千克新鮮菠菜葉在「維他美仕」折彎機中以1:1的比率用含有0.1mnacl的磷酸鉀緩衝液(ph7.4)浸軟。磨碎後使用10mnaoh溶液將ph調整到7.4。勻漿在3500g下離心5分鐘。棄去固體球粒，並且接著使用0.2μmmpes膜對液體離心分離液(約1.6l)進行微過濾。保留物使用約1.5l提取緩衝液透濾。來自這一過濾步驟的滲透物(約3l)使用10kdampes膜濃縮到約0.1l。這一步驟的蛋白質濃縮物為約ph7.4。向濃縮物添加酸(例如hcl)，以將ph降低到5。使用磁性攪拌板或均質機劇烈攪拌濃縮物混合物30分鐘。這一混合物接著在3500g下離心5分鐘以獲得灰白色球粒和褐色離心分離液。棄去上清液並且用去離子水洗滌蛋白質球粒。將球粒再懸浮於0.05-0.1l去離子水中。將溶液劇烈混合成均勻漿液並且使用鹼(例如naoh)將ph緩慢升高到11。所得溶液為澄清的黃色。接著，將ph降到9以保持澄清的混合物。產物以此形式使用噴霧乾燥器乾燥，或使用冷凍乾燥器冷凍和乾燥。所獲得的產物略微脫色並且保留低溫變性特性。

實例4-使用色譜法的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶分離

通過尺寸排阻色譜純化上文實例3中製備的濃縮物。superdex200柱(26/600)用20mmkphosph7.4、100mmnacl預平衡。將0.4g蛋白質(5ml濃縮物)以2.5ml/min注入到柱上。柱接著用20mmkphosph7.4、100mmnacl緩衝液洗脫。觀測到間隙體積中聚結的蛋白質、純核酮糖二磷酸羧化酶、有色組分(粉紅色、黃色)與鹽之間發生高分辨分離。

實例5-通過透濾作用的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶脫色

一百克新鮮菠菜葉在3摻合機(俄亥俄州克利夫蘭的維他美仕公司)中以1:4(w/w)的比率用去離子水浸軟。在最高設置(3hp電動機)下進行提取3分鐘，始終使溫度維持在30℃以下。磨碎後使用10mnaoh將ph調整到7.4。勻漿使用臺式離心機(allegrax15r，sx4750轉子；加利福尼亞州帕薩迪納的貝克曼庫爾特公司)在10000g下離心30分鐘。棄去離心塊並且分別收集清液層。向清液層添加氯化鈉鹽以達到0.75m濃度。溶液接著針對8％peg(carbowaxsentrypeg8000；密西根州米德蘭的陶氏化學公司)溶液使用3kdauf膜滲析。

顏色與一些蛋白質和水一起通過膜滲透到peg相中。滲析結束時的產物經2倍濃縮並且沒有顏色。使用標準660nm皮爾斯蛋白質分析和sds凝膠密度測定法分析這一材料。

實例6-通過分批色譜法的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶脫色

一百克新鮮菠菜葉在3摻合機(俄亥俄州克利夫蘭的維他美仕公司)中以1:4(w/w)的比率用去離子水浸軟。在最高設置(3hp電動機)下進行提取3分鐘，始終使溫度維持在30℃以下。磨碎後使用10mnaoh溶液將ph調整到7.4。勻漿使用臺式離心機(allegrax15r，sx4750轉子；加利福尼亞州帕薩迪納的貝克曼庫爾特公司)在10000g下離心30分鐘。棄去離心塊並且分別收集清液層。向懸浮液中每毫升懸浮液添加20mg乾燥novapegwang樹脂(emd米利波爾(emdmilipore)，目錄號855122)。接著滾磨材料以確保攪拌45小時，隨後材料在10000×g下離心5分鐘。分離清液層，並且uv-vis分析顯示在320nm下吸光率顯著降低。通過標準660nm皮爾斯蛋白質分析和sds凝膠密度測定法分析清液層的蛋白質含量和組成，顯示相對於初始蛋白質懸浮液沒有發生顯著改變。

實例7-通過針對peg的透濾作用從大豆蛋白質去除異味

使用2nnaoh使3％(w/v)大豆伴大豆球蛋白溶液達到ph8.5。接著使樣品達到0.75m氯化鈉，並且使用3500da截止膜針對含有0.75m氯化鈉的5％peg8000溶液(ph調整到8.5)滲析。針對peg加鹽進行滲析之後，針對水對蛋白質樣品進行滲析以去除過量鹽。鹽濃度降低20倍之後，評估樣品的口味。品嘗者描述最終樣品有苦味，但完全去除了紙板和泥土的異味。相比之下，品嘗者描述未經處理的大豆伴大豆球蛋白樣品有苦味並且具有強烈的紙板和泥土風味。

實例8-方法的變化

可以使用上文所描述的方法的如下的其它變化：

方法變化

●一種替代方案是在傾析步驟之後添加peg，由此使peg經傾析固體的損失降到最低。在這一情形下，將傾析器離心分離液添加到預先形成的兩相peg-鹽溶液中，分級分離peg相中的有色體。

●另一選擇是向離心分離液添加固體peg，並且當混合完成時，添加鹽以形成相分離。

●所述方法的一種另外替代是對uf濃縮物而非提取物利用兩相提取策略。在這一情形下，在不添加peg或硫酸鎂的情況下進行整個工藝直到產生uf濃縮物。

●另一選擇是在巴氏滅菌或乾燥之前對peg處理的溶液進行離心以去除任何沉澱。

單元操作變化

●使用均質機或高剪切研磨機加強分解和細胞破壞。

●用於分離三個層的圓盤堆疊離心步驟換成使用重力沉降槽的步驟。

●使用脫鹽色譜柱(例如g50柱)進行鹽的分離。

組分變化

●所述方法使用菠菜和苜蓿葉測試，但可以擴展到任何核酮糖二磷酸羧化酶來源(例如藻類、玉米、小麥、大米、高粱、黑麥、芥花、小米、大麥、大豆、向日葵、紅花、菸草、苜蓿、馬鈴薯、芸苔屬、棉花、西紅柿或菸草)或其它蛋白質(例如其它植物蛋白)。

●所述方法可以用於去除任何蛋白質懸浮液的顏色和/或氣味，包括含有一或多種選自由以下組成的群組的蛋白質的懸浮液(非限制性)：豆血紅蛋白、非共生血紅蛋白、血紅蛋白、肌紅蛋白、血綠蛋白、無脊椎動物血紅蛋白、神經球蛋白、細胞球蛋白、原球蛋白、截短的2/2球蛋白、hbn、藍藻球蛋白、hbo、glb3以及細胞色素、地獄之門球蛋白i(hell'sgateglobini)、細菌血紅蛋白、纖毛肌紅蛋白、黃素血紅蛋白、核糖體蛋白、肌動蛋白、己糖激酶、乳酸脫氫酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸果糖激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、蛋白酶、脂肪酶、澱粉酶、糖蛋白、凝集素、粘蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、肌動蛋白、轉譯延長因子、組蛋白、核酮糖二磷酸羧化酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶活化酶(核酮糖二磷酸羧化酶活化酶)、白蛋白、大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、球蛋白、豌豆球蛋白、伴白蛋白、麥膠蛋白、谷蛋白、谷蛋白、麥谷蛋白、大麥醇溶蛋白、醇溶谷蛋白、菜豆蛋白(蛋白質)、蛋白質體、黑麥醇溶蛋白、伸展蛋白、小麥族谷蛋白、膠原蛋白、玉米蛋白、高梁醇溶蛋白、燕麥蛋白、脫水蛋白、親水素、胚胎後期富集蛋白、天然非摺疊蛋白、任何種子貯藏蛋白、塊莖貯藏蛋白、馬鈴薯糖蛋白、塊莖特異蛋、蛋白酶抑制劑、動物蛋白、魚蛋白、卵蛋白、家禽蛋白、藻類蛋白、真菌蛋白、重組蛋白、油體蛋白、油體鈣蛋白、油體固醇蛋白或其它油體蛋白、營養貯藏蛋白a、營養貯藏蛋白b、綠豆種子貯藏8s球蛋白、豌豆球蛋白以及豌豆白蛋白。

●使用較高分子量peg進一步降低工藝中的peg濃度。

●其它親水性聚合物(例如聚丙二醇、丁二醇、己二醇、甘油、二甘油、二乙二醇、二丙二醇以及其混合物)也潛在地適用。

●提取緩衝液中使用提供0.05-1體積％陽離子絮凝劑官能度的絮凝劑(例如來自新澤西州弗洛勒姆帕克巴斯夫(basf,florhampark,nj)的781g或lt7989)。其它適用絮凝劑包括例如石灰石、熟石灰和二價或三價金屬的鹽(例如氯化鐵、硫酸鐵、硫酸亞鐵)、硫酸鋁、鋁酸鈉、氯化鋁、鹼式碳酸鎂、碳酸鈣、氫氧化鈣、活化矽酸鹽、瓜爾膠、澱粉、丹寧、海藻酸鈉、聚合硫酸鋁、聚合羥基氯化鋁、以及合成聚電解質(例如以及)。

●用於相破裂的鹽不限於瀉鹽(epsomsalt)。其它適用鹽包括磷酸鉀、氯化鈉和乙酸銨。如果基於霍夫邁斯特系列(hoffmiesterseries)適當選擇離子，那麼分離更好；所述系列中後來的鹽可以使蛋白質鹽化。

●提取方法通過向初始提取緩衝液添加還原劑(例如偏亞硫酸氫鹽(約2％(w/v)溶液或更多))並且通過所述方法維持厭氧條件來改進。

方法效率

●分離的peg層再循環到另一提取緩衝液製劑中，由此使所用peg的效率最大。

●來自uf膜分離的滲透物使用ro膜濃縮以回收工藝用水和鹽濃縮物。

其它實施例

應理解，雖然本發明已經結合其上述詳細說明進行了描述，但是上述描述是打算說明並且不限制本發明的範圍，本發明的範圍由所附權利要求書的範圍限定。其它方面、優勢和修改在所附權利要求書的範圍內。