一種根際促生菌及其應用的製作方法
2023-05-17 08:36:31
專利名稱：一種根際促生菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物，具體地說涉及一種根際促生菌及其應用。
背景技術：
我國紅壤面積約佔全國土壤總面積的1/5，是我國熱帶、亞熱帶經濟林果、經濟作物和糧食生產的重要基地。紅壤本身所具有的富鋁化、酸化、鐵質化及抗蝕性弱等物質循環特徵與規律的影響，我國紅壤地區當前生態與環境系統及土壤退化問題已極為嚴重，正因如此，紅壤區土壤與環境問題已成為世界土壤和環境科學的研究熱點。我國大多數耕地土壤全磷的80%以上為各種形態的無機磷酸鹽，尤其由於紅壤屬酸性土壤，其中含有大量的鐵、鋁等金屬離子，施入土壤中的水溶性磷肥很快被這些離子固定，喪失其有效性，從而降低了植物對肥料的利用率。在土壤中許多微生物能夠溶解難溶態磷，促進植物對磷的吸收，增加作物產量和改善作物品質，將解磷微生物作為生物肥料，不但可以提高土壤中磷的利用效率，節肥增產，而且可改善土壤結構，提高土壤有機質含量。植物根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria,PGPR)是重要的益生菌，是生活在土壤或定植於植物根表、根內或莖葉的一類可促進植物生長、防治病害、增加作物產量的有益微生物，通常指具有固氮、 溶磷、產生植物激素、分泌抗生素和產生促進植物生長生理活性等能力。但現在大部分植物根際促生菌還為被馴化成可有效應用於促進植物生長並具有較好溶磷效果的菌種，未必適應紅壤的土壤環境。
發明內容
發明目的本發明的一個目的是提供一種根際促生菌，可在紅壤環境中有效促進作物生長，同時可將難溶性磷酸鹽轉化為可被生物利用的可溶性磷酸鹽；本發明的另一個目的是提供一種根際促生菌在花生栽培上的應用。技術方案為實現上述目的，本發明的一種根際促生菌(Jrthrobacter chlorophenolicus L4)，於2011年8月1日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所(郵編 100101)分類名為氯酚節桿菌(JriAroAacier chlorophenolicus),1 ^ CGMCC No.5102。所述根際促生菌菌落較小為白色、隆起，邊緣整齊，表面光滑溼潤，不透明，幼齡菌體為不規則杆狀，常呈V形排列端圓，老細胞則縮短為球形，單個、成對排列，不規則的堆狀排列，不產芽孢。所述根際促生菌的生理生化特性是革蘭氏陽性，嚴格好氧，化能異養，接觸酶陽性，M. R和VP試驗陰性，澱粉水解陽性，明膠水解陽性，硝酸鹽還原陽性，檸檬酸鹽利用陰性。本發明所述的根際促生菌培養時使用的主要氮源包括但不限於蛋白腖、酵母粉、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨；使用的主要碳源包括但不限於蔗糖、木糖、甘露醇、麥芽糖；使用的無機組分包括包括但不限於氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、氫二鉀、磷酸三鈣、二水氯化鈣、七水合硫酸鎂、七水和硫酸亞鐵。本發明的根際促生菌發酵可在觀 321，？!15、的環境下進行。所述根際促生菌能高產吲哚乙酸並能利用難溶性磷酸鹽為磷源進行生長。本發明所述的根際促生菌分泌吲哚乙酸(IAA)的能力強，達152. 19 μ g · mL-1。吲哚乙酸是植物激素的一種，能夠促進根的發育。產吲哚乙酸的菌種，往往附著在植物根系或葉表面，利用植物代謝產生分泌物的同時產生IAA和少量GA3等植物激素來影響植物的生理過程和形態變化。表現為直接促進根的伸長，從而增大了與土壤中營養物質的接觸的機會；可提高植物體內源IAA的含量；誘導植物防衛基因的表達，提高植物體抗病，抗旱等抗逆性。作為本發明的優化方案，所述根際促生菌的發酵在pH5飛下進行，該環境下產IAA量最尚。作為本發明的進一步優化，所述根際促生菌採用的碳源為木糖，採用的氮源為酵母粉或硝酸鉀或兩者的組合。利用上述碳源和氮源製得的培養基，培育出的根際促生菌產 IAA的量最高。本發明所述的根際促生菌以難溶性磷酸鹽為磷源進行生長，並將其轉化為可溶性磷酸鹽。在實驗室搖瓶條件下，所述根際促生菌對磷酸三鈣的轉化量達沈9. 12 mg - T10 相對於採用不接種菌作為空白對照的結果，所述根際促生菌對磷酸三鈣的轉化量比空白對照高出217. 74 mg·!/1。本發明所述的根際促生菌還對磷酸鋁和磷酸鐵具有溶解作用，在實驗搖瓶培養條件下分別比不接種菌作為空白的有效磷含量高出89. 59 mg · Γ1和115. 32 mg · L 1 ο有益效果本發明的一種根際促生菌高產吲哚乙酸，可有效將難溶性磷酸鹽轉化為可溶性磷酸鹽，提高肥料的利用率，促進植物根系發育和對肥料的吸收，增加土壤有效磷含量；本發明針對花生具有良好的促生長效果，高產的吲哚乙酸促進花生的生長發育，土壤有效磷含量的提高也使得花生對磷肥的利用率更高。
圖1是本發明菌株L4的菌落圖2表示不同初始pH對L4菌株產IAA的影響； 圖3表示不同裝液量對菌株L4產IAA的影響； 圖4表示不同碳源對菌株L4產IAA的影響； 圖5表示不同氮源對L4菌株產IAA的影響； 圖6表示種植花生30天後接種L4菌株對土壤IAA含量的影響； 圖7表示種植花生30天後接種L4菌株對花生根總長度的影響； 圖8表示種植花生30天後接種L4菌株對花生根表面積的影響； 圖9表示種植花生30天後接種L4菌株對花生根平均直徑的影響； 圖10表示種植花生30天後接種L4菌株對花生根尖數的影響； 圖11表示種植花生30天後的土壤有效磷含量；
圖12表示空白處理和接菌處理的花生根系生長情況對比，a圖為對照不接菌處理組，b圖為接L4菌株處理組。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明作更進一步的說明。實施例1
好氧性試驗
把滅過菌的LB培養基倒入3個已滅菌的試管中，大約在2/3處，在無菌操作臺上，用接種針挑取斜面培養的所述菌，穿刺接種到上述培養基中(必須穿刺到管底)。30 °C培養， 分別在3天至7天觀察結果。在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌，如沿穿刺線生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌。試驗結果表現，菌落沿瓊脂柱表面生長，穿刺線內無菌落生長，為嚴格好氧。過氧化氫酶的測定
在乾淨載玻片上滴ι滴3% ，取18 24 h的LB斜面培養物1環，在H2A中塗抹，若有氣泡產生則為陽性，否則為陰性。試驗結果為接觸酶陽性。甲基紅試驗(M. R試驗)
a.培養基及試劑蛋白腖5g，葡萄糖5g，氯化鈉5g，蒸餾水lOOOmL，調節ρΗ7. (Γ7. 2， 分裝試管，每管裝4 5 mL，121°C滅菌20 min。試劑甲基紅0. lg，95 %酒精300 mL，蒸餾 /K 200 mL 。b.菌種培養及結果觀察接種菌株於上述培養液中，30°C培養廣2天。在培養液中加入幾滴甲基紅試劑，如培養液呈現紅色，為甲基紅陽性，黃色為陰性(甲基紅變色範圍 4. 4紅色 6.0黃色)。試驗結果為M. R陰性。乙酞甲基甲醇試驗(VP試驗)
a.培養基培養基同甲基紅試驗。 b.菌種培養及結果觀察接種與培養同甲基紅試驗。做VP試驗時，取培養液(約2mL)和等量的40 %NaOH相混合，加少量肌酸，充分振蕩2 5 min後，如培養液出現紅色，即為VP陽性。試驗結果為VP陰性。澱粉水解試驗
a.培養基及試劑在肉湯蛋白腖瓊脂中添加0. 2%的可溶性澱粉，分裝三角瓶，121°C滅菌20min備用。路哥氏碘液碘片lg，碘化鉀2g，先用少量(3飛mL)蒸餾水溶解碘化鉀，現加入碘片，待碘完全溶解後，加水稀釋至300mL。b.菌種培養及結果觀察取菌種點接於平板上，30°C培養2、天，形成菌落後，在平板上滴加路哥氏碘液，以鋪滿菌落周圍為度，平板呈藍色，而菌落周圍如有無色透明圈出現，說明澱粉已被水解。透明圈的大小一般說明水解澱粉能力的大小。試驗結果為澱粉水解陽性。明膠水解試驗
a.培養基及試劑蛋白腖5g，明膠120g，蒸餾水lOOOmL。調節pH7. 2 7. 4，分裝試管，培養基高度約為4 5cm，121°C滅菌20min。b.菌種培養及結果觀察用穿刺法接種在試管中央。在30°C溫箱中培養一個月，觀察明膠是否液化。試驗結果為明膠水解陽性。硝酸鹽還原試驗
a.培養基及試劑蛋白腖10g，KNO3Ig,蒸餾水lOOOmL，pH7. 0 7. 4。格裡斯氏(Gries) 試劑=A液對氨基苯磺酸0. 5g，稀醋酸(10%左右)150mL ；B液蔡胺0. Ig,蒸餾水20mL,稀醋酸(10%左右)150mL。二苯胺試劑二苯胺0. 5g溶於IOOmL濃硫酸中，用20mL蒸餾水稀釋。b.菌種培養及結果觀察將試驗菌接種於硝酸鹽液體培養基中，30°C培養1、3、5 天。在白色瓷盤小孔中倒入少許培養液，然後在其中分別滴1滴試劑A和B液，當培養液變為粉紅色、玫瑰紅色、橙色或棕色等時，表示有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性，否則為陰性。試驗結果為硝酸鹽還原陽性。檸檬酸鹽的利用
a.培養基及試劑檸檬酸鈉 2g，NaCl 5g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，(NH4)2 · HPO4 lg，1% 澳百裡香酚藍水溶液10mL，瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL，pH6. 8-7. 0,121°C滅菌20min。b.菌種培養及結果觀察取幼齡菌種接種於斜面上，30°C培養3-7天，培養基呈鹼性(藍色)者為陽性反應，不變者則為陰性。檸檬酸鹽利用的試驗結果為陰性。實施例2
首先準備以下三種培養基。LB培養基蛋白腖10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml， pH 7. 0-7. 2，121°C滅菌，20min。LB液體培養基不加瓊脂，其它條件同上。無機磷細菌培養基(ΡΚ0培養基)磷酸三鈣5g，葡萄糖10g，硫酸銨0. 5g，氯化鈉 0. 3g，七水合硫酸鎂0. 3g，氯化鉀0. 3g，硫酸錳0. 03g,七水合硫酸亞鐵0. 03g，pH 7. 0瓊脂 20g，蒸溜水 1000ml，ρΗ 7· 0 7· 2。121°C滅菌，20min。無機鹽培養基硫酸銨2. Og ；磷酸二氫鈉0. 5g ；磷酸氫二鉀0. 5g ；七水硫酸鎂0. 2 g;二水氯化鈣 0. lg，蒸餾水 lOOOmL，pH 7. 0，121°C滅菌，20min。將從江西鷹潭採取的紅壤土盛於盆缽中，然後將花生種子播於缽中(花生種子進行20%雙氧水表面消毒20min，催芽2d)，待花生生長30d後，輕輕拔出花生苗，抖落根上鬆散的附著土，將花生苗自根莖處剪斷，稱取根IOg置於盛有100 ml滅菌水的250 ml的三角瓶中，在搖床中，30°C，150r · miiT1振蕩20min，靜置lOmin，得到根際土壤懸浮液。該根際土壤懸浮液中含有若干種根際促生菌，採用稀釋法稀釋後塗於LB培養基，將平板倒置，於 300C，恆溫箱中培養24h後，挑取不同類型典型單個菌落，經平板純化後，4°C保存在LB斜面待用。下面再通過定性測定和定量測定篩選出可分泌吲哚乙酸的根際細菌。定性測定將分離純化後的細菌接種於採用含有L-色氨酸(100 mg/L)的LB液體培養基，30°C，180 r ^irT1搖床培養Id。取50 μ L菌懸液滴於白色陶瓷板上，同時加50 μ L Salkowski 比色液(50mL 35%HC104+lmL 0. 5M FeCl3)。將加入 50 μ L 50 mg/L 吲哚乙酸的比色液作為陽性對照。白色陶瓷板於室溫避光放置30 min後觀察，顏色變紅者表示能夠分泌吲哚乙酸。定量測定對初篩獲得的分泌IAA的細菌進行定量測定，培養條件同上。首先用分光光度法測定菌懸液的0D600值，然後將菌懸液以10000 r -min"1離心10 min取上清液加入等體積Mlkowski比色液，避光靜置30min，測定其OD53tl值。計算菌濃度0D_值為1 時，單位體積發酵液中吲哚乙酸的含量。標準曲線的繪製採用分析純的吲哚乙酸梯度稀釋製備。把得到的產IAA菌進行溶磷情況的篩選測定，將供試菌株接種於盛有30mL無機磷細菌液體培養基的150 mL三角瓶，30°C，180 r ^irT1培養4d後，將培養液裝入離心管4°C 下10000 r · HiirT1離心，15 min。取上清液用鉬藍比色法測定有效磷含量。通過以上測定即可篩選出高產吲哚乙酸，溶磷能力強的菌株，如圖1所示。該菌株形成的菌落為較小為白色、隆起，邊緣整齊，表面光滑溼潤，不透明，幼齡菌體為不規則杆狀，常呈V形排列端圓，老細胞則縮短為球形，單個、成對排列，不規則的堆狀排列，不產芽孢，株型命名為L4。將上述方法篩選分離出的菌株，經南京市金斯瑞生物科技有限公司測序，根據 16SrDNA的測序結果，在http //www. ncbi. nlm. nih. gov在線查詢分析，利用Blast軟體在 GenBank中與其它的16S rDNA序列進行同源性比較，選擇相近的序列與L4的序列用MEGA version 3軟體構建L4的16SrDNA系統進化樹。根據該菌株的生理生化特徵，鑑定為氯酚 Tiff (.Arthrobacter chlorophenolicus), 11] ! 100%。該菌種呈革蘭氏陽性、無芽孢的不規則杆狀。菌落較小為白色、隆起，邊緣整齊，表面光滑溼潤。嚴格好氧，化能異養。最適生長溫度為30°C。接觸酶陽性，硝酸鹽還原陽性。 分泌IAA能力強，達到152. 19 μ g · mL—1，以難溶性磷酸鹽為磷源進行生長，並將其轉化為可溶性磷酸鹽。實施例3
為了進一步驗證實施例1得到的根際促生菌L4產吲哚乙酸的能力和最適條件，下面針對不同PH、裝液量、不同碳源、不同氮源探索對吲哚乙酸產量的影響。將含有L-色氨酸(100mg/L)的LB培養基分別調節到不同的pH (4、5、6、7、8、9、 10)，取50mL裝於250mL的三角瓶中，按1% (ν/ν)接種量接種處於對數生長期的L4後，置於30°C，180r · min-1搖床培養Mh，按定量測定的方法測定產IAA的量，結果如圖2所示， 表明PH為4和10時不產IAA，在強酸強鹼環境中，菌體無法進行生長代謝，菌種在微酸環境中產IAA多於鹼性環境，該菌種高產IAA的最適pH為5飛。將含有 L-色氨酸(100mg/L) LB 液體培養基按 25ml，50ml，75ml，IOOrnl，150ml 裝於 250mL的三角瓶中，按1%(ν/ν)接種量接種處於對數生長期的L4後，置於30°C，180r ^irT1 搖床培養M h，按定量測定的方法測定產IAA的量。結果如圖3所示，由於菌株L4是好養代謝，通氣量影響菌株產IAA的效率，50mL裝液量時，菌株產IAA量最多，之後隨著裝液量增大，產量越少。 在含有L-色氨酸(100mg/L)無機鹽培養基中分別加入l%(w/v)的碳源，碳源有葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖等，取50ml裝於250ml的三角瓶中，按1% (ν/ ν)接種量接種處於對數生長期的L4後，置於30°C，180 r· rniiT1搖床培養M h，按定量測定的方法測定產IAA的量。結果如圖4所示，該菌株在供給木糖時，產IAA的能力最強， 其次是麥芽糖，果糖的利用率最低，幾乎不產IAA。在含有L-色氨酸(100mg/L)無機鹽培養基(不包括硫酸銨)中分別加入0. l%(w/ ν)的氮源，氮源包括硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白腖、酵母粉、穀氨酸等，取50ml裝於250ml 的三角瓶中按1% (ν/ν)接種量接種處於對數生長期的L4後，置於30°C，180r · mirT1搖床培養M h，按定量測定的方法測定產IAA的量。結果如圖5所示，說明取酵母粉為氮源時， 產IAA的量最多，除硝酸鉀除外，有機氮源的利用率高於無機氮源。實施例4
本發明對花生具有明顯促生長作用，下面通過盆栽試驗進行說明。採集自然條件下紅壤(T20cm 土層的新鮮土壤，過5mm篩，每盆裝土 700g，種植花生，調節含水量至田間最大持水量的60%，30天後採樣，用根系掃描儀(LA1600+ scanner, Canada)掃描獲得根系圖像後，用根系分析軟體(WinrhiZO200;3b，Canada)進行相關根係指標分析，用HPLC法測定土壤IAA含量，用鉬藍比色法測定土壤有效磷含量。花生種子花生種子進行20%雙氧水表面消毒20min，無菌水衝洗多次，催芽2d，選取發芽一致的種子備用。接菌處理將本發明的L4接種於LB液體培養基，30°C，180r · mirT1搖床培養，培養菌長至對數生長期，然後將菌懸液IOOOOr · mirT1離心lOmin，再用無菌水重懸同樣離心三次，接種量為IO8CF^gA對照處理作為對照，土壤不噴灑L4菌液，加等量無菌水。結果如圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12所示。從圖6可以看出，經接菌處理後，土壤IAA含量顯著增加，比對照組高出2倍左右；從圖7、圖8、圖9、圖10可以看出，接種 L4處理與不接菌處理進行對比，花生根系總長度，根平均直徑，根表面積和根尖數都顯著增加，促進了花生根系的發育；從圖11可以看出，經接菌處理土壤有效磷含量提高了約90%。 結合以上結果可以看出，本發明的根際促生菌L4對根基的生長、發育具有明顯效果，IAA產量高，可以有效促進作物生長發育。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種根際促生菌(JriAro^cier chlorophenolicus L4)，於 2011 年 8 月 1 日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，分類名為氯酚節桿菌UriAro如cter chlorophenolicus ), 1 ^ CGMCC No. 5102。
2.根據權利要求1所述的一種根際促生菌，其特徵在於所述根際促生菌能高產吲哚乙酸並能利用難溶性磷酸鹽為磷源進行生長。
3.如權利要求1所述的根際促生菌在花生栽培上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種根際促生菌及其應用，屬於微生物領域，該根際促生菌(ArthrobacterchlorophenolicusL4)，於2011年8月1日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，分類名為氯酚節桿菌(Arthrobacterchlorophenolicus)，保藏號CGMCC No.5102。該菌株能高產吲哚乙酸並能利用難溶性磷酸鹽為磷源進行生長，提高肥料的利用率，促進植物根系發育和對肥料的吸收，增加土壤有效磷含量；本發明針對花生具有良好的促生長效果，高產的吲哚乙酸促進花生的生長發育，土壤有效磷含量的提高也使得花生對磷肥的利用率更高。
文檔編號C12N1/20GK102391960SQ20111033353
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月27日 優先權日2011年10月27日
發明者劉滿強, 李引, 李輝信, 焦加國, 胡鋒 申請人:南京農業大學