一種複合檢測戊型肝炎病毒抗體譜的試劑盒及其應用的製作方法
2023-05-17 02:37:36
專利名稱：一種複合檢測戊型肝炎病毒抗體譜的試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學檢測領域，具體地說，是一種利用流式微球檢測技術複合檢測戊型肝炎病毒抗體譜的試劑盒。
背景技術：
戍型肝炎(Hepatitis E, HE)是由戍型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)弓丨起的經消化道傳播的急性傳染病，發病率逐年升高，目前尚無特效治療方法。戊型肝炎廣泛流行於亞、非及美洲一些國家，發病例呈全球性分布，是發展中國家較常見的傳染病，我國為高發區。當成人感染HEV後，會出現尿黃、眼睛黃、皮膚黃髮熱，乏力、食慾減退、厭油、噁心、嘔吐、上腹不適、肝區痛關節痛等症狀。病情嚴重的病人可發生暴發性肝功能衰竭，肝昏迷，瀰漫性血管內凝血等危及生命的併發症，孕婦感染HEV後，病死率高(5% 25%)，還會造成流產和死胎。目前，HE V病毒的檢測方法主要有核酸檢測和免疫學檢測。HEV RNA檢測是臨床戊型肝炎診斷的金標準，但該方法操作複雜、成本高，不易在臨床廣泛開展，而且在急性戊型肝炎患者中，血液或糞便中HEV RNA存在的時間較短，所以臨床HEV的診斷主要依靠血液HEV抗體檢測。抗HEV IgM是HEV急性感染的診斷指標之一，在感染HEV第2周就可以在血清中被檢測到，第6周達到高峰，隨後迅速下降，陽性持續時間較短(3個月左右)，因此抗HEV IgM現有診斷試劑常有漏診和誤診。這部分漏診的帶毒者即成為HEV的移動傳染源，有可能是造成HEV區域性小規模流行和持續散發的原因。此外，類風溼因子等的存在會影響血清IgM的檢測，造成假陽性，這在其他疾病檢測中屢見不鮮，抗-HEV IgM檢測也不例外。這說明現有的IgM診斷試劑尚不能滿足HEV感染的臨床診斷和流行病學篩查與防治的需要。抗HEV IgG 一般在發病2周後可檢測到，在第7周達到高峰，並能一直保持在較高的水平，可持續I年甚至數年，因此抗HEV IgG檢測是目前HEV病毒感染診斷主要依據。但是抗HEV IgG不能鑑別患者為HEV急性感染還是既往感染。有研究表明IgG抗體親和力高低測定可診斷是否為急性感染，通常感染初期IgG親和力低，恢復期IgG親和力高，但重複感染患者通常也表現為IgG親和力高。這種情況在孕婦弓型蟲感染患者中也有報導。雖然抗體親和力能用來區分感染時間，特別是亞臨床和無黃疸的患者，也可以鑑定抗HEV IgM陰性的急性感染，但高和低親和力的區分不得不憑經驗，而且不是所有急性感染都是抗-HEV IgG親和力都低，也有的患者發病早期抗HEV IgG陽性，而親和力高，因此抗體親和力實驗只能作為一種驗證實驗。人體感染HEV後3 4周，首先出現抗HEV IgM和IgA，此後約I周即可檢測到抗HEV IgG。IgA抗體被證實在一些病毒性疾病的急性感染期升高，可以作為早期診斷的標誌。在大部分HEV早期感染患者中，可檢測到抗HEV IgM和抗HEV IgA陽性，但抗HEV IgA陽性持續時間比抗HEV IgM長，平均約為(120±23)d，對HEV感染的早期診斷更有意義。流式微球技術(cytometric bead array, CBA)是流式細胞技術與微球相結合的一項新技術，是近年發展起來的一種定量檢測細胞分泌或裂解釋放的細胞因子或其他可溶性蛋白的重要方法，與傳統的ELISA方法相比，CBA具有EL ISA所無法比擬的優點。CBA的技術原理是利用有機高分子微球為載體，用特異性抗原/抗體(捕獲抗體)進行包被，再與標準品/或待檢樣本及螢光素標記的特異性抗原/抗體(檢測抗體)一起反應，然後用流式細胞儀對其進行定量檢測。如果將多種螢光強度具有明顯差異的微球，分別用不同抗原的特異性抗體包被，將包被好的微球(捕獲微球)混合，並與標準/或待檢樣本及螢光素標記的特異性檢測抗體一起反應，可對樣本中的多種可溶性蛋白質同時進行定量。該技術在液相環境中進行，可保持蛋白質構象不變，有利於抗原抗體結合，且有高通量、快速分析多重生物反應、高的靈敏度和特異性等傳統ELISA無法比擬的優越性，已廣泛應用於醫學領域。中國專利文獻CN102375052A公開了一種在同一體系中檢測IgM抗體和IgG抗體的方法，但是關於一種利用流式微球檢測技術複合檢測戊型肝炎病毒抗體譜的試劑盒目前還未見報導。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種複合檢測戊型肝炎病毒抗體譜的試劑盒。本發明的再一目的是，提供一種複合檢測戊型肝炎病毒抗體譜的試劑盒的應用。本發明的另一的目的是，提供一種利用流式微球檢測技術複合檢測同一體系中戊型肝炎病毒抗體譜的方法。為實現上述目的，本發明採取的技術方案是:一種複合檢測戊型肝炎病毒抗體譜的試劑盒，包括以下組分: a)捕獲微球，所述的捕獲微球為包被有不同HEV特異性抗原的聚苯乙烯微球，所述的HEV特異性抗原為HEV病毒基因組ORF 2和ORF 3重要抗原位點融合表達的戊肝抗原；
b)螢光標記的三種二抗，其中三種二抗為針對人HEVIgG、IgM、IgA抗體的二抗，所述的三種二抗標記的螢光基團各不相同；
c)磷酸緩衝液。所述的a中HEV特異性抗原為人HEV IgG、IgM和IgA抗原。所述的a中聚苯乙烯微球為羧基表面微球。所述的b中的三種二抗為羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊抗人IgA，螢光基團選自FITC, PE, PI, CY5, preCP、ECD 中的三種。所述的c中磷酸緩衝液的濃度0.01mol/L, pH7.4。所述的a中捕獲微球的製備方法為:將偶聯液、洗滌液、封閉/儲存液放置到室溫備用，所述偶聯液為NaH2PO4 0.lmol/L, ρΗ6.2，所述洗滌液為PBS 0.01mol/L, ρΗ7.4，所述封閉/儲存液為PBS+l%BSA+0.02% NaN3 取微球用洗滌液衝洗；②加入活化緩衝液和EDC和NHS活化劑，混勻；③室溫下避光搖震通向活化的微球中加入HEV特異性抗原，混勻； 室溫下避光搖振用洗滌液衝洗；⑦加入封閉液；⑧室溫下避光搖震；⑨將包被好的微球放在儲存液中4°C避光保存。為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是:所述的試劑盒在製備檢測戊型肝炎病毒抗體譜的檢測器械中的應用。
為實現上述第三個目的，本發明採取的技術方案是:一種利用流式微球檢測技術複合檢測同一體系中戊型肝炎病毒抗體譜的方法，包括以下步驟:
a)捕獲微球的製備，所述的捕獲微球為包被有三種不同HEV特異性抗原的聚苯乙烯微球，所述的HEV特異性抗原為人IgG、IgM和IgA抗原； b)待檢樣品的處理:在同一反應器中，加入待檢樣品、捕獲微球、不同突光標記的三種二抗，孵育後形成微球-抗體-螢光二抗夾心複合物，其中三種二抗為針對人HEV IgG、IgM、IgA抗體的二抗；
c)檢測和結果判讀:用流式細胞儀對經過孵育產生的微球複合物進行分析檢測，通過分析三種螢光信號結果可獲知待檢樣品的戊型肝炎病毒抗體譜。所述的b中的三種二抗為羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊抗人IgA，所述的螢光基團選自 FITC, PE, PI, CY5, preCP、ECD 中的三種。所述的a中捕獲微球的製備方法為:將偶聯液、洗滌液、封閉/儲存液放置到室溫備用，所述偶聯液為NaH2PO4 0.lmol/L, ρΗ6.2，所述洗滌液為PBS 0.01mol/L, ρΗ7.4，所述封閉/儲存液為PBS+l%BSA+0.02% NaN3 取微球用洗滌液衝洗；②加入活化緩衝液和EDC和NHS活化劑，混勻；③室溫下避光搖震通向活化的微球中加入HEV特異性抗原，混勻； 室溫下避光搖振用洗滌液衝洗；⑦加入封閉液；⑧室溫下避光搖震；⑨將包被好的微球放在儲存液中4°C避光保存。本發明優點在於:
1、本發明提供一種應用流式微球技術聯合檢測戊型肝炎病毒IgG、IgM、IgA的方法及應用該方法的試劑盒，以克服傳統單種抗體檢測假陰性、假陽性率高的缺陷，提高檢測靈敏度和特異性；
2、本發明還可用於HEV病毒感染的分期；
3、利用流式微球檢測技術，反應過程一步完成，可以提高檢測效率和自動化程度。
附圖1為本發明實施例中對抗HEV IgG，IgM，IgA用流式微球技術進行檢測的結果圖，圖中藍色、紅色、黃色三條圖譜分別代表抗HEV IgG, IgM, IgA。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。如未特別指明之處，可根據本領域技術人員所熟悉的《細胞實驗指南》(科學出版社，北京，中國，2001年)、《免疫檢測技術》(科學出版社，北京，中國，1991)等實驗手冊中所列方法來實施。實施例1檢測試劑盒和相應檢測試劑的製備
本發明提供一種應用流式微球技術聯合檢測戊型肝炎病毒IgG、IgM、IgA的試劑盒和相應檢測試劑的製備。用於本發明的檢測試劑盒，其中包括:捕獲微球，螢光-羊抗人IgG，螢光-羊抗人IgM,螢光-羊抗人IgA，緩衝液。其中捕獲微球為包被有HEV特異性抗原的聚苯乙烯微球。優選微球為羧基表面微球。
捕獲微球的製備過程為:將偶聯液(NaH2PO4 0.1mol / L，ρΗ6.2)、洗滌液(PBS
0.0lmol / L，ρΗ7.4)、封閉/儲存液(PBS+ l%BSA+0.02% NaN3)放置到室溫備用。①取微球用洗滌液衝洗；②加入活化緩衝液和EDC和NHS活化劑，混勻；③室溫下避光搖震；④向活化的微球中加入HEV特異性抗原，混勻；⑤室溫下避光搖震用洗滌液衝洗加入封閉液；⑧室溫下避光搖震；⑨將包被好的微球放在儲存液中4°C避光保存。其中優選的HEV特異性抗原為HEV病毒基因組ORF 2和ORF 3重要抗原位點融合表達的戊肝抗原。羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊抗人IgA標記各不相同的螢光基團。優選螢光基團是FITC, PE, PI, CY5, preCP, ECD。緩衝液優選磷酸緩衝液，濃度0.0lmol / L，ρΗ7.4。實施例2檢測方法
本發明還提供一種應用流式微球技術聯合檢測戊型肝炎病毒IgG、IgM、IgA的方法，包括以下步驟:
(O捕獲微球的製備；
(2)在同一反應器中，加入待檢樣品、捕獲微球、三種螢光標記的二抗，孵育反應後形成微球-抗體-螢光二抗複合物；
(3)用流式細胞儀對經過孵育產生的微球複合物處理後的樣品進行分析檢測，通過分析三種螢光信號結果，可獲知感染患者戊型肝炎病毒患者血樣中抗體譜。捕獲微球的製備參見實施例1或3。待檢樣品的處 理過程為:①取待檢樣品與捕獲微球混勻，加入三種螢光標記的二抗；②室溫避光搖震以形成微球-抗體-螢光二抗夾心複合物；③用緩衝液衝洗，重懸浮後待測。其中待檢樣品為血清/血漿。其中三種二抗為羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊抗人IgA。其中，各種二抗標記的螢光基團是不同的，優選螢光基團是FITC，PE, PI, CY5，preCP, E⑶。檢測結果的判定方法為:按照流式細胞儀給出三種螢光信號值，獲得患者的HEV抗體譜。其中檢測到PE螢光信號的為IgM陽性，為急性期感染；檢測到CY5螢光信號的為IgA陽性，為急性期感染；僅檢測到FITC螢光信號的為IgG陽性，為既往感染。實施例3捕獲微球的製備:
本實施例中微球(0.4 μ m, I X IO8個/ mL)購自Spherotech公司。將偶聯液(NaH2PO40.1mol / L，pH6.2)、洗滌液(PBS 0.0lmol / L，pH7.4)、封閉 /儲存液(PBS+I%BSA+0.02%NaN3)放置到室溫備用。①取I μ L微球懸液(I X IO5個/ μ L)用洗滌液洗一遍；②加入80 μ L活化緩衝液和10 μ LEDC和NHS (5mg/mL)活化劑，混勻；③室溫下避光搖震20min ;④向活化微球中加入100 μ L (4 μ g/mL) HEV抗原，混勻； 室溫下避光搖震2h ;⑥用洗漆液洗3次；⑦加入200 μ L封閉液；⑧室溫下避光搖震Ih 將包被好的微球放在100 μ L封閉/儲存緩衝液中4°C避光保存。實施例4微球-抗體-螢光二抗複合物的製備
取100 yL血清/血漿與10 μ L(約IX IO6個)檢測微球輕輕混勻，加入100yL(l:25倍稀釋)螢光二抗(FITC-羊抗人IgG、PE-羊抗人IgM、CY5-羊抗人IgA)，用PBS調至反應體積為500 μ L 室溫避光搖震2h以形成微球_抗體_突光二抗複合物用洗漆液洗兩次，重新懸浮後待測，同時作陰性樣本對照。實施例5結果判斷檢測到二抗螢光信號的判定為HEV陽性樣本。其中檢測到PE螢光信號的為IgM陽性，為急性期感染；檢測到CY5螢光信號的為IgA陽性，為急性期感染；僅檢測到FITC螢光信號的為IgG陽性，為既往感染。附圖1顯示了本發明實施例中對抗HEV IgG, IgM, IgA用流式微球技術進行檢測的結果圖，其結果能夠清晰檢測到並區分三種抗體，顯示本發明的檢測靈敏度和特異性。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保 護範圍。
權利要求
1.一種複合檢測戊型肝炎病毒抗體譜的試劑盒，其特徵在於，包括以下組分: a)捕獲微球，所述的捕獲微球為包被有不同HEV特異性抗原的聚苯乙烯微球，所述的HEV特異性抗原為HEV病毒基因組ORF 2和ORF 3重要抗原位點融合表達的戊肝抗原； b)螢光標記的三種二抗，其中三種二抗為針對人HEVIgG, IgM, IgA抗體的二抗，所述的三種二抗標記的螢光基團各不相同； c)磷酸緩衝液。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的a中HEV特異性抗原為人HEVIgG、IgM 和 IgA 抗原。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的a中聚苯乙烯微球為羧基表面微球。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的b中的三種二抗為羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊抗人IgA，螢光基團選自FITC，PE, PI, CY5，preCP、ECD中的三種。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的c中磷酸緩衝液的濃度0.01mol/L, pH7.4。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵 在於，所述的a中捕獲微球的製備方法為:將偶聯液、洗滌液、封閉/儲存液放置到室溫備用，所述偶聯液為NaH2PO4 0.lmol/L,pH6.2，所述洗滌液為PBS 0.01mol/L, pH7.4，所述封閉/儲存液為PBS+l%BSA+0.02% NaN3 ;①取微球用洗滌液衝洗；②加入活化緩衝液和EDC和NHS活化劑，混勻；③室溫下避光搖震；④向活化的微球中加入HEV特異性抗原，混勻；⑤室溫下避光搖振； 用洗滌液衝洗加入封閉液；⑧室溫下避光搖震；⑨將包被好的微球放在儲存液中4°C避光保存。
7.根據權利要求1-6任一所述的試劑盒在製備檢測戊型肝炎病毒抗體譜的檢測器械中的應用。
8.一種利用流式微球檢測技術複合檢測同一體系中戊型肝炎病毒抗體譜的方法,其特徵在於，包括以下步驟:a)捕獲微球的製備，所述的捕獲微球為包被有三種不同HEV特異性抗原的聚苯乙烯微球，所述的HEV特異性抗原為人IgG、IgM和IgA抗原； b)待檢樣品的處理:在同一反應器中，加入待檢樣品、捕獲微球、不同突光標記的三種二抗，孵育後形成微球-抗體-螢光二抗夾心複合物，其中三種二抗為針對人HEV IgG.1gM,IgA抗體的二抗； c)檢測和結果判讀:用流式細胞儀對經過孵育產生的微球複合物進行分析檢測，通過分析三種螢光信號結果可獲知待檢樣品的戊型肝炎病毒抗體譜。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述的b中的三種二抗為羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊抗人IgA，所述的螢光基團選自FITC，PE, PI, CY5，preCP、ECD中的三種。
10.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述的a中捕獲微球的製備方法為:將偶聯液、洗滌液、封閉/儲存液放置到室溫備用，所述偶聯液為NaH2PO4 0.lmol/L,pH6.2，所述洗滌液為PBS 0.01mol/L, pH7.4，所述封閉/儲存液為PBS+l%BSA+0.02% NaN3 ;①取微球用洗滌液衝洗；②加入活化緩衝液和EDC和NHS活化劑，混勻；③室溫下避光搖震；④向活化的微球中加入HEV特異性抗原，混勻；⑤室溫下避光搖振； 用洗滌液衝洗加入封閉液；⑧室溫下避光搖震；⑨將包被好的微球放在儲存液中4°C避光保存。
全文摘要
本發明涉及一種複合檢測戊型肝炎病毒抗體譜的試劑盒及其應用，包括以下組分a)捕獲微球；b)不同螢光標記的三種二抗；c)磷酸緩衝液。本發明還提供一種利用流式微球檢測技術複合檢測同一體系中戊型肝炎病毒抗體譜的方法。本發明優點在於克服傳統單種抗體檢測假陰性、假陽性率高的缺陷，提高檢測靈敏度和特異性；還可用於HEV病毒感染的分期；利用流式微球檢測技術，反應過程一步完成，可以提高檢測效率和自動化程度。
文檔編號G01N33/576GK103235120SQ20131013925
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月22日 優先權日2013年4月22日
發明者王奕江, 齊潔婷, 劉明霞, 王川, 張必新, 姚驊珊, 沈靖, 田茂生 申請人:蘇州華益美生物科技有限公司