幹擾素調節因子8（irf8）在腦卒中疾病中的應用的製作方法

2023-05-17 06:10:46

幹擾素調節因子8（irf8）在腦卒中疾病中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種IRF8基因在腦卒中疾病中的功能和應用，屬於基因的功能與應用領域。本發明以IRF8基因敲除小鼠和神經特異性IRF8轉基因小鼠為實驗對象，通過大腦中動脈缺血再灌注模型，結果表明與野生型C57小鼠對比，IRF8基因敲除小鼠腦袋梗死體積明顯增加，神經功能也明顯惡化，而神經特異性IRF8轉基因小鼠的梗死體積則明顯減少，且神經功能明顯好轉。這提示一種IRF8基因在腦卒中疾病中的功能，主要體現在IRF8基因具有保護神經系統功能的作用，特別是IRF8基因能夠保護腦卒中疾病的作用。針對IRF8的上述功能，提供IRF8在製備治療腦卒中疾病藥物中應用。
【專利說明】幹擾素調節因子8 (IRF8)在腦卒中疾病中的應用
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬於基因的功能與應用領域，特別涉及一種幹擾素調節因子8(interfer0nregulatory factor 8, IRF8)在腦卒中疾病中的應用。
[0003]【背景技術】[0004]缺血性腦卒中目前是全球主要致死致殘的疾病，目前組織纖溶酶原激活劑(tissue一typeplasminogenactivator, tPA)纖溶仍是治療缺血性腦血管病的主要治療方法，但伴隨的缺血再灌注會進一步加重缺血神經細胞損傷。研究表明，神經元保護策略可以在腦缺血損傷後較長時間內改善大腦功能，減少神經元細胞損失。凋亡是大腦缺血/再灌注過程中細胞死亡的基本機制之一，但其調控機制仍未完全闡明。因此，研究大腦缺血/再灌注時神經元細胞凋亡生存的分子機制，將有助於為神經元保護提供新的治療策略和方法。
[0005]大腦缺血再灌注損傷可以引起多種不同但相互重疊的信號通路，調控細胞存活或者死亡。神經元局灶性腦缺血時，梗死核心區絕大部分細胞均發生壞死(necrosis)，特徵是能量供應劇減導致細胞水腫、細胞器破裂及細胞不可逆的死亡。梗死核周邊低灌注腦組織稱為「缺血半暗帶」，由於其仍具有代謝活性，如果腦血流灌注得到改善，該區域細胞活性仍能恢復。因此挽救缺血半暗帶對於卒中後治療具有重要價值。儘管1996年起組織纖溶酶原激活劑(tPA)即批准用於缺血性腦卒中治療，迄今為止其仍然是美國藥監局(FDA)唯一審核通過的溶栓藥物。因為隨時間延長出血風險增加，tPA的治療時間窗僅為4.5小時；考慮到缺血性和出血性腦卒中在早期影像學不易鑑別，進一步延誤了患者接受tPA治療的機會。目前只有小於5%的缺血性腦卒中患者使用tPA溶栓治療。此外，研究發現腦組織如果長時間嚴重缺血缺氧，即使在後期恢復腦血流仍會對腦組織造成不可逆轉的損傷，因此當前仍迫切需要研究針對缺血缺氧和(或)再灌注所致病理生理學事件的治療策略。自20世紀90年代以來，研究保護神經和腦組織的治療策略一直是腦卒中治療的熱點，這些策略不僅可以延長tPA的治療時間窗，也可以減輕缺血再灌注誘導的腦組織損傷。多種神經保護藥物已在動物實驗中取得了令人振奮的結果，但是進入腦卒中3期臨床實驗後，絕大部分藥物均未取得預期效果，其首要失敗的原因之一是大部分已知神經保護機製作用於在卒中後4-6小時以內，而臨床實踐中很難在如此短暫是時間窗內實施治療，因此進一步闡明卒中發生後較長一段時間內促進或保護腦組織損傷的分子機制對於研究有效的卒中治療革巴點或者策略具有重要意義。
[0006]幹擾素調節因子(interferon regulatory factor, IRF)家族現已發現有10個成員，其組成為IRFl~IRF10。現有的研究提示，IRF家族成員參與了廣泛的生物學過程，主要涉及天然免疫和獲得性免疫反應，調控細胞生長及生存、凋亡和增殖，參與造血，抗腫瘤形成等。IRF8是幹擾素的共識別結合蛋白(interferon consensus sequence-bindingprotein, ICSBP)，是IRF家族的一員，作為一個轉錄因子，可以轉錄調控DNA從而發揮作用。IRF8首次被發現是在髓細胞和淋巴細胞中，已有研究表明IRF8在免疫調節和髓細胞分化中起著核心作用。多項研究表明，IRF8可能參與多發性硬化症、中樞神經系統炎性脫髓鞘疾病，周圍神經損傷等疾病。
[0007]

【發明內容】

[0008]為解決上述現有技術的缺陷和不足，本發明的首要目的在於提供一種IRF8在製備治療神經系統疾病藥物中的應用。
[0009]本發明的另一目的在於提供一種IRF8在製備治療腦卒中疾病藥物中的應用。
[0010]本發明的目的通過下述技術方案實現:
本發明以IRF8基因敲除小鼠和神經細胞特異性IRF8轉基因小鼠為實驗對象，通過大腦中動脈缺血再灌注模型，結果表明與野生型C57小鼠對比，IRF8基因敲除小鼠腦袋梗死明顯加重，神經功能也明顯惡化，而神經細胞特異性IRF8轉基因小鼠的梗死體積則被抑制，且神經功能也好轉。這提示IRF8基因具有保護神經系統功能的作用，能保護腦缺血引起的神經損傷，為研究防治腦缺血的新藥和新策略提供了理論依據和臨床基礎。
[0011]一種IRF8基因在腦卒中疾病中的功能，主要體現在IRF8基因具有保護神經系統功能的作用，特別是IRF8基因能夠保護腦缺血疾病的作用。
[0012]針對IRF8基因的上述功能，提供IRF8在製備治療神經系統疾病的藥物中應用。
[0013]一種治療神經系統疾病的藥物，包含IRF8。
[0014]針對IRF8基因的上述功能，提供IRF8在製備治療腦卒中疾病藥物中應用。
[0015]一種治療腦卒中疾病的藥物，包含IRF8。
[0016]本發明的研究成果表明，IRF8- KO小鼠在大腦中動脈缺血再灌注引起的損傷中，小鼠梗死體積明顯加重，神經功能明顯惡化，神經細胞凋亡也明顯增加。證明IRF8基因在腦卒中疾病模型中有著重要的保護作用。
[0017]本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果: 1.本發明發現IRF8基因的新功能，即IRF8基因能夠保護腦卒中疾病的作用。
[0018]2.1RF8在保護腦卒中疾病中的作用，用於製備治療腦卒中疾病藥物。
[0019]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是神經特異性IRF8轉基因小鼠的構建及鑑定結果圖 A為神經特異性IRF8轉基因小鼠的構建圖；
B為神經特異性IRF8轉基因小鼠的鑑定結果圖；
圖2是WT和IRF8-K0小鼠的TTC染色結果圖。
[0021]A為TTC染色結果圖；
B為腦梗體積統計柱狀圖；
C為神經功能評分統計柱狀圖；圖3是IRF8-TG和NTG小鼠的TTC染色結果圖。
[0022]A為TTC染色結果圖；
B為腦梗體積統計柱狀圖；
C為神經功能評分統計柱狀圖；
圖4是WT和IRF8-K0小鼠的腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡情況測定結果圖。
[0023]圖A為Fluoro Jade B檢測顯示圖和統計結果圖；
圖B為TUNEL細胞凋亡圖和統計結果圖；
圖5是IRF8-TG和NTG小鼠的腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡情況測定結果圖。
[0024]圖A為Fluoro Jade B檢測顯示圖和統計結果圖；
圖B為TUNEL細胞凋亡圖和統計結果圖；
【具體實施方式】
[0025]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0026]實驗用動物及飼 養
實驗動物:選用11-12周齡、體重在25-30g，背景為雄性C57BL/6品系的野生型小鼠(WT，購自北京華阜康生物科技有限公司)、IRF8基因敲除小鼠(IRF8-K0，C57BL/6J背景，購自 EMMA,貨號 EM: 02414)、非轉基因小鼠(NTG, Neuron-specific Cre transgenic mice(CaMKII a -Cre;購自 Jackson Laboratory , Stock N0.005359))及神經特異性 IRF8 轉基因小鼠(IRF8-TG，由IRF8-flox轉基因小鼠和CaMKII a -Cre小鼠雜交得到，IRF8_flox轉基因小鼠由本實驗室自己構建，IRF8-flox轉基因小鼠的構建過程如下文中所述)。
[0027]飼養環境:所有實驗小鼠均飼養在武漢大學心血管病研究所SPF級實驗動物中心。小鼠專用飼料由中國軍事醫學科學院動物中心提供。飼養條件:室溫在22-24°C之間，溼度在40-70%之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水攝食。
[0028]【實施例1】神經特異性IRF8轉基因小鼠的構建 IRF8-flox轉基因小鼠構建信息:
轉基因載體構建信息:用上遊引物，即5 』 -CCAGATTACGCTGATTGTGACCGGAACGGCGGGCG-3』 (SEQ ID N0.1);下遊引物，5 』-AGGGAAGATCTTGATTTAGACGGTGATCTGTTGAT-3 』 (SEQID N0.2)，擴增小鼠 IRF8 全長基因(NCBI, Gene ID: 15900, NM_008320.3)，把cDNA插入pCAG-CAT-LacZ載體，這個載體包含一個CMV增強子和一個雞的P -actin基因(CAG，chicken ^ -actin gene)的啟動子，並且連接到氯黴素乙醯轉移酶基因(CAT，chloramphenicol acetyl transferase), 1xP 位點位於 CAT 兩側。神經細胞 IRF8 的表達由CAG啟動子驅動得到(圖1A)。 IRF8-f 1xed老鼠:將構建的pCAG-1RF8-CAT_LacZ載體通過顯微注射構造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到IRFS-floxed轉基因小鼠。神經元特異性IRF8轉基因小鼠通過IRF8-flox小鼠和CaMKII a -Cre小鼠雜交繁殖得到。
[0029]轉基因小鼠通過剪尾巴取基因組DNA，使用PCR鑑定，PCR鑑定引物信息為:檢測正向引物 5』- CCAGATTACGCTGATTGTGACCGGAACGGCGGGCG -3』 (SEQ ID N0.3)，檢測反向引物 5』- AGGGAAGATCTTGATTTAGACGGTGATCTGTTGAT-3』 (SEQ ID N0.4)。通過蛋白質印跡法(Western Blot )實驗鑑定不同轉基因鼠腦袋中IRF8蛋白的表達量:提取不同轉基因鼠腦組織蛋白，通過聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，驗證IRF8過表達(圖1B)
我們構建了幾株神經特異性IRF8轉基因小鼠(IRF8-TG)。為了反映病理生理狀態下IRF8的改變，我們選擇了 IRF8-TG5小鼠，Western Blot及定量分析顯示，其腦組織中IRF8表達量約為正常組織10.5倍。
[0030]【實施例2】小鼠腦梗死模型(I/R)獲得
1.實驗動物分組:雄性C57BL/6品系野生型小鼠、IRF8基因敲除小鼠及腦袋特異性IRF8轉基因小鼠和非轉基因小鼠，通過大腦中動脈缺血再灌注建立腦梗死模型(I/R)。隨機分為8組，每組10隻小鼠:C57BL/6品系野生型小鼠假手術組(WT SHAM)及I/R術組(WTI/R)、IRF8基因敲除小鼠假手術組(K0 SHAM)及I/R術組(K0 I/R)、非轉基因小鼠假手術組(NTG SHAM)及I/R術組(NTG I/R)、神經元特異性IRF8轉基因小鼠假手術組(TG SHAM)及 I/R 術組(TG I/R)。
[0031]2.線栓法腦梗死I/R手術採用小鼠大腦中動脈缺血再灌注(middle cerebralartery Ischemia Reperfusion)模型操作流程:
(1)抓取小鼠，使用3%異氟烷麻醉小鼠，8%硫化鈉脫去頸部的鼠毛，顱頂鼠毛用手術剪迅速剪掉，3%活力碘消毒頸部及顱頂皮2次，75%酒精脫碘I次；
(2)在小鼠的顱頂部位橫向切口，暴露顱骨，用鑷子輕輕剝離顱骨表面的結締組織。將雷射都卜勒血流儀的光纖探頭用生物膠固定在前因後方2_，左側5_的部位；
(3)將小鼠仰臥固定， 頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜，分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。在ECA 遠心端用8-0線結紮，ECA近心端處掛線備用。用微動脈夾暫時夾閉ICA、CCA ;然後在ECA遠心端結紮和近心端掛線中間剪一小口，將線栓由剪口送入到CCA，並將ECA近心端的掛線在剪口處打一活結，鬆緊度以線栓可自由進出但略帶摩擦感為宜，再松ICA動脈夾，將線栓送入ICA，從血管分叉處開始算距離，當插入深度在9-llmm左右至血流下降遇阻力停。這時將繞在ECA近心端處活結輕輕系牢拴線，整個過程必須維持小鼠的肛溫在37±0.5°C ；
(4)從線栓進入腦血管至血流下降遇阻力停時開始計時，45min後先鬆開ECA近心端處活結，將線栓拔出，並將ECA近心端處活結紮緊，迅速鬆開CCA處動脈夾，並將ECA近心端結紮(Sham組在從線栓進入腦血管至血流下降遇阻力時抽出線栓)。注意觀察血流恢復情況，選擇血流下降75%以上，血流恢復達70%以上的小鼠納入實驗；
(5)縫合小鼠頸部及頭部皮膚，並用活力碘消毒傷口。手術結束後，將小鼠放在溫箱中，箱溫維持在28 °C，給水和飼料至取材。
[0032]【實施例3】腦梗死模型(I/R)小鼠腦梗死體積測定
腦缺血/再灌注損傷嚴重程度的評估指標主要包括大腦梗死體積和神經功能評分，這些指標均與缺血/再灌注損傷嚴重程度正相關。
[0033](I)分別在手術後24h，72h取材前進行神經功能及形為學評分；
基於Berderson神經功能評分改進方法(9分制):
0分:無神經受損的症狀；
I分:提尾時對側前肢蜷曲，或者不能完全到達患側前肢；
2分:提尾時對側肩膀內收；
3分:平推:向對側推動時阻力下降；4分:可自發的向各個方向運動，但在脫尾巴時只向對側轉彎；
5分:自發運動時轉圈或只向對轉；
6分:無自主運動,只在刺激時運動；
7分:無自主運動,刺激時也無運動；
8分:與腦缺血有關的死亡。
[0034](2)抓取小鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，剪開小鼠胸腔，剪破心臟放血；
(3)體積分數75%酒精消毒後頸部皮膚，剪開後頸部皮膚，暴露頭及頸部，從頸椎處剪斷頸髓，分離除去後頸部肌肉，眼科剪縱向剪開腦幹小腦外顱骨，用紋齒鉗剝開顱骨，分離大腦表面的硬腦膜，避免硬腦膜劃傷腦組織。取腦時從延髓開始，小心分離顱底組織，避免損傷大腦；
(4)將取下的腦組織放入裝有PBS的培養皿中潤洗，用紗布吸乾PBS，將腦組織放入Imm小鼠腦模，置於_20°C冰箱凍存(不超過4h);
(5)腦組織2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloricej,TTC)染色:從_20°C冰箱取出腦組織，立即切成Imm厚的切片，包括前囟前方切4片，後方切3片，共切7片。將切片立即置於10mL2% TTC溶液的血清瓶中，37°C恆溫孵育lOmin。不時翻動切片，使組織均勻染色。正常腦組織染色後呈鮮紅色，而梗死區呈蒼白色；
(6)腦組織固定:將燒杯裡的腦組織及溶液一同轉入做好標記的杯中，棄去TTC溶液，用10%中性福馬林溶液固定腦組織切片，24h後拍照並用IPP軟體分析；
(7)腦梗體積計算:梗死體積％=(對側大腦半球體積-梗死側未梗死體積)/ (對側大腦半球體積X2) X 100% ；
總梗死體積為各自7張腦片結果數據之和。
[0035]TTC染色結果如圖2所示，經過I/R缺血45min再灌注24小時後IRF8-K0小鼠梗死體積較野生型小鼠增加；且這種惡化作用在I/R術後72小時仍然持續，而神經功能評分在I/R術後24小時、72小時均加重。
[0036]如圖3所示，經過I/R缺血45min再灌注24小時後IRF8-TG小鼠梗死體積較野生型小鼠明顯減輕；且這種保護作用在I/R術後72小時仍然持續，而神經功能評分在I/R術後24小時和72小時均減輕。
[0037]實施例4.腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡情況測定
1.腦組織冰凍切片製備
1)實驗小鼠按50mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉；
2)開胸暴露心臟，用注射針頭穿刺如左心室，同時剪開右心房；
3)用0.lmol/1PBS (pH7.4)IOOmmHg壓力灌流至肝臟變蒼白後，用4%多聚甲醛灌流15min ；
4)開顱迅速取出小鼠大腦，室溫4%多聚甲醛後固定6-8h；
5)切除腦組織的嗅球和小腦，再延正中線將大腦分為先後兩個部分，用先前的固定液再固定15min ；
6)隨後浸沒於含30%蔗糖的磷酸鹽 緩衝液中，4°C冰箱沉底過夜；
7)30%蔗糖與OCT按1:1混合後，倒適量到包埋框中，將前一步的組織取出，在紗布上吸去液體後在該包埋框中浸泡一會兒，再將其轉入到先已加入2滴OCT的另一個包埋框中，調整組織的位置，使其正好位於包埋框的正中；
8)將盛組織的包埋框，移入乾冰中，儘量使其處於水平位，稍待一會兒後，繼續加入OCT，浸沒組織一定的高度，待OCT凝固後，將其儲存於_80°C的冰箱中；
9)用冰凍切片機的標準程序切5u m的冰凍切片備用。
[0038]2.TUNEL試劑盒染色檢測凋亡。
[0039]用TUNEL試劑盒染色檢測凋亡。(TUNEL試劑盒:ApopTag? Plus In SituApoptosis Fluorescein Detection Kit (S7111, Chemicon)):
1)將冰切組織切片置於(pH7.4)1%的多聚甲醛中，室溫固定水解10分鐘；
2)PBS洗兩次，每次5 min ；
3)置於預冷的乙醇:乙酸(2:1)溶液中，-20°C浸泡5分鐘，去除多餘液體，但注意不要乾燥；
4)PBS洗兩次，每次5 min ；
5)濾紙小心吸去多餘液體，立即在切片上按75uL/5 cm2直接加入平衡緩衝液，室溫孵育 1-5 min ；
6)濾紙小心吸去多餘液體，立即在切片上按55u 1/5 cm2直接加入TdT酶反應液，置於避光保溼盒中作用I h (陰性對照加入不含TdT酶的反應液)；
7)將切片置於終止/洗滌緩衝液中，輕輕搖動15sec，室溫孵育10 min;此時準備適量抗地高辛抗體，預熱至室溫，注意避光；
8)PBS洗三次，每次I min ；
9)濾紙小心吸去多餘液體，直接在切片上按65uL/5 cm2加入抗地高辛抗體，室溫下於避光保溫溼盒中作用I h；
10)PBS洗四次，每次2 min ；
11)SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (Invitrogen ,S36939)封片；
12)螢光鏡下觀察，拍照。若需保存，於暗溼盒中4°C保存。在螢光顯微鏡下觀察，拍照，計數凋亡神經元細胞。(若需保存，於暗溼盒中4°C保存)
3.FJB (Fluoro Jade B)染色
1)將冰切組織切片在烘箱中烘乾I小時；
2)1% Na0H+80% 無水乙醇 5min ；
3)70%無水乙醇2min ；
4)dd H2O 2min ；
5)Flouro jade B 稀釋液(AG310, Millipore, Billerica, MA),室溫避光 20min ;
6)dd H2O Imin 洗 3 次;
7)在烘箱中烘片5-10min；
8)二甲苯處理2-3min ；
9)封片，拍照。
[0040]腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡情況測定結果見圖4、圖5。圖4是IRF8-K0小鼠和野生型小鼠I/R術後24小時腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡情況。Fluoro Jade B染色(A)和TUNEL染色(B)檢測細胞凋亡，結果顯示IRF8-K0小鼠神經元細胞凋亡率均比野生型小鼠增加，進一步提示IRF8與神經元細胞缺血/再灌注時死亡相關。同樣圖5是IRF8-TG小鼠和NTG小鼠I/R術後24小時腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡情況，FluoroJade B染色(A)和TUNEL染色(B)結果顯示IRF8-TG小鼠神經元細胞凋亡率均比NTG小鼠降低。這些結果表明，促進IRF8表達可以改善腦組織缺血/再灌注損傷，且可能與神經元細胞凋亡密切相關。
[0041]我們的研究成果表明，IRF8 KO小鼠在大腦中動脈缺血再灌注引起的損傷中，我們發現IRF8敲除後，小鼠梗死體積顯著增加，神經功能明顯惡化，神經細胞凋亡也明顯增多。證明IRF8基因在腦卒中疾病模型中有著重要的保護作用。
[0042]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方 式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.1RF8在製備治療神經系統疾病藥物中的應用。
2.一種治療神經系統疾病的藥物，其特徵在於:包含IRF8。
3.1RF8在製備治療腦卒中疾病藥物中的應用。
4.一種治療腦卒中疾病的藥物，其特徵在於:包含IRF8。
【文檔編號】A61K38/17GK103784974SQ201410031606
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】李紅良, 郭森, 盧燕雲, 蔣曦, 向梅, 張曉東 申請人:武漢大學