使用聚合酶鏈反應檢測鏈核盤菌屬種類的方法
2023-05-17 02:02:36 1
專利名稱：使用聚合酶鏈反應檢測鏈核盤菌屬種類的方法
技術領域：
本發明涉及聚合酶鏈反應試驗中的引物在檢測核果鏈核盤菌和Monilinia fructicola中的用途。使用這些引物能夠檢測真菌病原體的特定分離物並監測植物種群中疾病的發展情況。
植物疾病年復一年地使得農作物遭受相當大的損失，從而導致農場主的經濟損失且在世界許多地區使地方種群的營養儲備不足。殺真菌劑的廣泛應用已經對植物病原體的侵害提供了可觀的安全性。然而，儘管花費在殺真菌劑上的價值達10億美元，但是在1981年世界範圍內的農作物損失約佔農作物價值的10％(James，1981；Seed Sci. Technol.9679-685)。
疾病破壞過程的嚴重性取決於病原體的侵染性和宿主的反應。大多數植物繁殖過程的一個目的是增加宿主植物對疾病的抗性。一般來說，不同品種的病原體以可區分的方式與不同品種的相同農作物種類發生相互作用且許多來源的宿主抗性僅可預防特定的病原體品種。此外，某些病原體品種表現出疾病症狀的早期徵兆，而幾乎對農作物卻沒有損害。Jones和Clifford(1983；Cereal Disease，John Wiley)報導預計病原體的毒力形式在病原體種群中出現以作為對抗性進入宿主栽培品種的反應且由此對病原體種群進行監測是必不可少的。此外，存在幾個得到證實的對特定殺真菌劑具有抗性的真菌菌株進化的實例。早在1981年，Fletcher和Wolfe(1981；Proc.1981 Brit.CropProt.Conf.)主張24％來自春季大麥的白粉菌種群和53％來自冬季大麥的白粉菌種群在對殺真菌劑唑菌醇的反應中表現出明顯變化且這些種群的分布在不同品種之間改變，其中大部分敏感性品種還產生了最高發生率的低敏感性類型。在真菌對殺真菌劑的敏感性中的相似變化形式已經在下列品種中得到了證明小麥黴(還對唑菌醇)，葡萄孢黴(對苯菌靈)，核腔菌屬(對有機汞)，Pseudocercosporella(對MBC-型殺真菌劑)和Mycosphaerella fijiensis對僅提及的幾種三唑類(Jones和Clifford；Cereal Disease，John Wiley，1983)。
褐腐病是一種商用生長的櫻桃屬種類的主要的全球性疾病(1995；Compendium of Stone Fruit Diseases，Amer.Phytopath.Soc.Pp7-10)。隨地域的不同而變化的褐腐病可以由核果鏈核盤菌、M.fructicola和果生鏈核盤菌所導致。在北美尚未檢測到果生鏈核盤菌，而在歐洲尚未發現M.fructicola。已經在歐洲的梨果和核果上檢測到了果生鏈核盤菌，而核果鏈核盤菌是導致大多數明顯的農作物損害的原因。褐腐病可以因包括殺真菌劑花費在內的開花和椏枝枯萎以及果實腐爛而直接由農作物損失導致財政損失。
鑑於上述原因，確實存在對在感染過程早期鑑定病原體真菌特定品種的技術進行開發的需求。在疾病症狀在農作物不生長變得明顯之前，通過鑑定病原體的特定品種，農學家可以評價病原體在農作物品種中的進一步發育的可能作用，其中所述病原體品種已經得到鑑定，且如果認為這類應用是必不可少的，那麼農學家可以選擇合適的殺真菌劑。定義基因指的是編碼序列和相關的調節序列，其中編碼序列被轉錄成諸如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有義RNA或反義RNA這樣的RNA。調節序列的實例是啟動子序列、5』和3』非翻譯序列和終止序列。例如，可以存在的其它元件是內含子。同一性使用以動態編程算法為基礎的電腦程式測定序列同一性的百分比。在本發明範圍內優選的電腦程式包括設計成研究所有可得到的序列資料庫的BLAST(基礎局部序列對比檢索工具)檢索程序，而與問題是蛋白質還是DNA無關。該檢索工具的BLAST 2.0版(缺口BLAST)已經在國際網際網路上可以被公眾所得到(目前的網址是http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。它使用將局部定位為與總體排列相反的啟發式算法且由此能夠檢測僅共有分離區的序列之間的相關性。在BLAST檢索中指定的評分具有清楚的統計學分析。植物指的是任意植物、特別是種子植物。重組DNA分子使用重組DNA技術彼此連接的DNA序列的組合。序列表中序列的簡要描述SEQ ID NO1寡核苷酸引物ITSl。SEQ ID NO2寡核苷酸引物ITS2。SEQ ID NO3寡核苷酸引物ITS3。SEQ ID NO4寡核苷酸引物ITS4。SEQ ID NO5寡核苷酸引物JB668。SEQ ID NO6寡核苷酸引物JB669。SEQ ID NO7寡核苷酸引物JB670。SEQ ID NO8寡核苷酸引物JB671。SEQ ID NO9寡核苷酸引物JB672。SEQ ID NO10寡核苷酸引物JB673。SEQ ID NO11寡核苷酸引物JB674。
本發明提供了用於鑑定不同致病型植物病原體真菌的獨特DNA序列。本發明的一個目的是提供一種用於鑑定真菌病原體的寡核苷酸引物，其中所述的寡核苷酸引物選自由SEQ ID NOs5-11組成的組。本發明中還包括用於以擴增為基礎檢測真菌內轉錄間隔區DNA序列的寡核苷酸引物對，其中至少一種所述的引物是選自由SEQ ID NOs5-11組成的組的寡核苷酸引物。本發明還包括一對本發明的寡核苷酸引物，其中所述引物中的至少一種選自由SEQ ID NOs1-4組成的組。優選的是本發明的寡核苷酸引物對，其中所述的寡核苷酸引物對選自下列引物對SEQ ID NO6和SEQ ID NO7；SEQ ID NO6和SEQ IDNO4；SEQ ID NO5和SEQ ID NO4；SEQ ID NO5和SEQ ID NO7；SEQ ID NO1和SEQ ID NO7；SEQ ID NO9和SEQ ID NO7；以及SEQ ID NO9和SEQ ID NO4。更優選的是本發明的寡核苷酸引物對，其中將所述的引物對用於檢測核果鏈核盤菌和Moniliniafructicola，且其中所述的寡核苷酸引物對選自下列引物對SEQ IDNO6和SEQ ID NO7；SEQ ID NO6和SEQ ID NO4；SEQ ID NO5和SEQ ID NO4；SEQ ID NO5和SEQ ID NO7；以及SEQ ID NO1和SEQ ID NO7。更優選權利要求4所述的寡核苷酸引物對，其中將所述的引物對用於檢測核果鏈核盤菌，且其中所述的引物對選自下列引物對SEQ ID NO9和SEQ ID NO7；以及SEQ ID NO9和SEQ ID NO4。
本發明的進一步目的是提供一種用於檢測真菌病原體的方法，該方法包括下列步驟(a)從感染了病原體的植物葉中分離DNA；(b)使用至少一種權利要求1的引物使所述的DNA進行聚合酶鏈反應擴增；和(c)通過目測觀察所述聚合酶鏈反應擴增的產物來檢測所述的真菌病原體。
優選的是一種本發明的方法，其中所述的真菌病原體選自核果鏈核盤菌和Monilinia fructicola。
本發明包括一種用於檢測真菌病原體的方法，該方法包括下列步驟(a)從感染了病原體的植物葉中分離DNA；(b)使用所述的DNA作為用一對權利要求4的引物進行的聚合酶鏈反應中的模板擴增所述病原體的部分內轉錄間隔區序列；和(c)通過目測觀察內轉錄的間隔區序列擴增部分來檢測所述的真菌病原體。
優選的是本發明的方法，其中所述的真菌病原體選自核果鏈核盤菌和Monilinia fructicola。
一種具體的實施方案涉及一種用於檢測真菌病原體的診斷試劑盒，它包括本發明的引物。本發明還包括一種用於檢測真菌病原體的診斷試劑盒，它包括本發明的引物對。
本發明涉及鑑定不同致病型植物病原體真菌的方法。本發明提供了在不同真菌致病型之間表現出變異性的內轉錄間隔區(ITS)DNA序列。將這類DNA序列用於本發明的方法中，此時可以將它們用於使引物參與以聚合酶鏈反應(PCR)為基礎的診斷試驗。這些引物在DNA模板由特定真菌致病型提供的PCR反應中生成獨特片段且由此可以將這些引物用於在疾病症狀發作前鑑定在宿主植物材料中存在或不存在特定的致病型。
在一個優選的實施方案中，本發明提供了用於檢測核果鏈核盤菌的ITS衍生的診斷用引物。在另外一個優選的實施方案中，本發明提供了用於檢測核果鏈核盤菌和Monilinia fructicola的ITS衍生的診斷用引物。
本發明為評價特定農作物品種-病原體菌株相關性中的潛在危害和謹慎應用各種變化的可得到的殺真菌劑提供了可能性。此外，可以將本發明用於提供關於在延伸地域內特定病原體品種的發育和傳播的詳細信息。本發明提供了一種特別適合於具有長潛伏期疾病的檢測方法。
本發明還提供了用於實施本發明的試劑盒。該試劑盒特別應用於鑑定真菌病原體核果鏈核盤菌和Monilinia fructicola。
本發明提供了用於鑑定不同致病型植物病原體真菌的獨特DNA序列。特別地，可以將所述的DNA序列用作用於鑑定真菌致病型的以PCR為基礎的分析的引物。本發明的DNA序列包括特定真菌病原體核糖體RNA基因區的內轉錄間隔區(ITS)序列以及來源於能夠鑑定特定病原體的這些區的引物。可以將這些來自病原體種或屬中的不同致病型的ITS DNA序列用於鑑定那些特定的成員，其中所述的病原體種或屬在不同種或屬中的成員之間改變。
生物醫學研究人員已經使用了以PCR為基礎的技術一段時間並且已經適度成功地檢測了受感染動物組織中的病原體。然而，僅在最近以來才將這項技術用於檢測植物病原體。已經使用對病原體線粒體基因組具有特異性的序列的PCR檢測了受感染小麥中存在的Gaumannomyces graminis(Schlesser等，1991；Applied and Environ.Microbiol.57553-556)，而隨機擴增的多態DNA(即RAPD)標記能夠區分許多品種的Gremmeniella abietina、即針葉樹中Scleroderris蛀孔的原因。美國專利號5,585,238(將該文獻的全部內容引入本文作為參考)描述了來源於殼針孢屬、假尾孢屬和球腔菌屬菌株核糖體RNA基因區的ITS序列的引物且其用於使用以PCR為基礎的技術鑑定這些真菌分離物。此外，美國申請順序號08/722,187(將該文獻的全部內容引入本文作為參考)描述了來源於鐮孢屬菌株核糖體RNA基因區的ITS序列的引物且其用於使用以PCR為基礎的技術鑑定這些真菌分離物。此外，美國專利申請順序號08/742,023(將該文獻的全部內容引入本文作為參考)描述了來源於尾孢屬、長蠕孢屬、球梗孢屬和柄鏽菌屬菌株核糖體RNA基因區的ITS序列的引物且其用於使用以PCR為基礎的技術鑑定這些真菌分離物。
核糖體基因因其高拷貝數而適合用作分子探針靶物。儘管成熟rRNA序列之間存在高度保守性，但是非轉錄和轉錄間隔區序列通常難以保守且由此適合作為檢測近來進化趨異的靶序列。真菌rRNA基因以單位形式組織化，它們各自編碼18S(小亞單位)、5.8S和28S(大亞單位)的三種成熟亞單位。這些亞單位被約300bp的兩種內轉錄間隔區ITS1和ITS2分隔開(White等，1990；見PCR方案，編輯Innes等；315-322頁)。此外，轉錄單位被非轉錄間隔區序列(NTSs)分隔開。ITS和NTS序列特別適合於檢測不同真菌病原體的特定致病型。
本發明的DNA序列來自不同植物病原體核糖體RNA基因區的內轉錄間隔區序列。來自病原體種或屬中不同致病型的ITS DNA序列在不同數量的種或屬中改變。一旦測定了病原體的ITS序列，則可以將這些序列與其它ITS序列進行序列對比。在這種方式中，引物可以來源於ITS序列。即，可以以含有真菌病原體中序列具有最大差異的ITS序列中的區為基礎設計引物。可以將這些序列和以這些序列為基礎的引物用於鑑定特定病原體。
來源於ITS序列的有代表性的寡核苷酸引物的序列以SEQ IDNOs1-11來描述。這些序列應用於以PCR為基礎的所關注病原體的鑑定。
在PCR分析中使用本發明引物序列的方法在本領域中是眾所周知的。例如，參見美國專利號4,683,195和4,683,202以及Schlesser等，1991；Applied and Environ.Microbiol.57553-556。另外參見Nazar等(1991；Physiol.and Molec.Plant Pathol.391-11)，它使用PCR擴增以利用棉黃萎輪枝孢和大麗花輪枝孢ITS區中的差異且由此區分這兩個種；而Johanson和Jeger(1993；Mycol.Res.97670-674)使用類似技術區分了香蕉病原體Mycosphaerellafijiensis和芭蕉生球腔菌(Mycosphaerella musicola)。
本發明的ITS DNA序列可以通過本領域中公知的方法克隆自真菌病原體。一般來說，用於從真菌分離物中分離DNA的方法是公知的。參見Raeder Broda(1985)，Letters in Applied Microbiology217-20；Lee等(1990)，Fungal Genetics Newsletter 3523-24；以及Lee和Taylor(1990)見PCR方案A Guide to Methodsand Applications，Innes等(編輯)；282-287頁。
在各病原體組中比較公開的ITS序列以便確定序列差異百分比，這種序列差異百分比可能用於在PCR中測試以區分不同的種和/或菌株。根據序列差異的鑑定合成大量引物並將其在PCR擴增中進行測試。用於PCR擴增測試的模板首先是純化的病原體DNA且隨後是分離自受感染宿主植物組織的DNA。因此，能夠鑑定診斷用即鑑定一種特定病原體種或菌株而非相同病原體的另一個種或菌株的引物對。另外將引物用於所述種中高度保守的區以便開發屬特異性引物和鑑定導致特定疾病的任意幾種真菌病原體的引物。例如，將引物開發成可檢測核果鏈核盤菌和M.fructicola。
優選的引物組合能夠區分受感染宿主組織、即預先已經感染了特定病原體種或菌株的宿主組織中的不同的種或菌株。本發明提供了符合用於核果鏈核盤菌和M.fructicola標準的許多引物組合。以真菌ITS區中的序列差異為基礎設計本發明的引物。序列之間最少為一個鹼基對的差異就可使判別引物的設計成為可能。可以將為特定真菌DNA的ITS區設計的引物與成為核糖體DNA編碼區內保守序列區的引物組合使用以便擴增種特異性PCR片段。一般來說，引物應具有的理論解鏈溫度約為60℃-約70℃以便達到良好的敏感性且應不具有明顯的二級結構和引物組合之間的3』重疊序列。引物一般與至少約5-10個連續的ITS1或ITS2核苷酸鹼基具有序列同一性。在優選的實施方案中，無論如何，引物具有約5-30個核苷酸鹼基的長度。
本發明本身便利地有助於含有實施所述方法必不可少的成分的「試劑盒」的製備方法。這類試劑盒可以包括區室化以容納局限在其中的一種或多種諸如管或小瓶這樣容器的載體。這些容器之一可以裝有未標記或可檢測標記的DNA引物。如果必要，標記的DNA引物可以以凍幹形式或在合適的緩衝液中存在。一種或多種容器中可以裝有用於PCR反應的一種或多種酶或試劑。這些酶可以以其自身形式或混合物形式、凍幹形式或在合適的緩衝液中存在。
最後，該試劑盒中可以裝有實施本發明技術必不可少的所有其它成分，諸如緩衝液、提取試劑、酶、移液管、平板、核酸、三磷酸核苷、濾紙、凝膠物質、轉移物質、放射自顯影源等。
下列實施例表明了可以用於下列目的的典型實驗方案合適引物序列的選擇、選擇和診斷功效引物的測試和應用這類引物檢測疾病和真菌分離物。提供這類實施例用於解釋目的而非起限定作用。
實施例本文所用的標準重組DNA和分子克隆技術在本領域中是眾所周知的且記載在下列文獻中J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)；和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)；和Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，由Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。
實施例1真菌分離物和基因組真菌DNA的提取參見表1列舉的所用的真菌分離物及其來源。使真菌生長在接種了來自PDA(馬鈴薯右旋糖瓊脂)培養物的菌絲體片段的150ml馬鈴薯右旋糖肉湯中。在28℃下的定軌振蕩器上將培養物培養7-11天。另一方面，直接從PDA平板上分離菌絲體。通過離心沉澱菌絲體且然後將其在液氮中研磨並使用Lee和Taylor的方案提取總基因組DNA(1990；見PCR方案A Guide to Methods and Applications，Innes等(編輯)；282-287頁)。
表1測試用分離物的來源
1美國典型培養物保藏中心，Rockville，Maryland，USA2Novartis Crop Protection，Research Triangle Park，NorthCarolina，USA實施例2從杏仁組織中提取DNA如下從杏仁植物部位中提取DNA大塊浸解法(1)將杏仁花或等分的杏仁置於Bioreba(Reinach，Switzerland)大容量塑膠袋(目錄#490100)中。將植物組織稱重、將裝有葉的塑膠袋減去包裝重量(塑膠袋重量)。
(2)每重量份(g)小麥組織加入等體積(ml)的Muller提取緩衝液(0.1％w/v Tween-80；0.04M Tris-Cl，pH7.7；0.15M NaCl；0.1％w/v BSA-Pentex級分V；0.01％w/v疊氮化鈉；200mM EDTA)。使用設定在70的Bioreba Homex 6勻漿器浸漬該組織。將所述組織研磨至纖維狀為止。
(3)將提取汁液等分入冰上的微量離心管。
(a)將濃縮的提取物煮沸5分鐘。
(b)將煮沸的提取物置於冰上。將煮沸的提取物微量離心5分鐘。
(c)由來自微量離心的提取物dH2O溶液製成1∶2、1∶5、1∶10和1∶50的上清液稀釋液。
(d)在冰上將稀釋的提取物儲存至備用。
實施例3聚合酶鏈反應擴增使用來自Perkin-Elmer/Cetus的GeneAmp試劑盒(Norwalk，CT；部件號N808-0009)、應用下列物質來進行聚合酶鏈反應50mM KCl；2.5mM MgCl2；10mM含有各自為200μM的dTTP、dATP、dCTP和dGTP的Tris-HCl(pH8.3)；50pmol各引物；2.5個單位的Taq聚合酶以及10ng的基因組DNA或1μl稀釋成終體積為50μl的杏仁提取物。在Perkin-Elmer 9600或9700型熱循環儀上使反應進行30-40個循環，每個循環由94℃下15秒、50℃-70℃下15秒和72℃下45秒組成。通過使10μl各PCR樣品上1.0％瓊脂糖凝膠並進行電泳來分析產物。
實施例4寡核苷酸的合成和純化例如，由整合DNA技術(Coralville，IA)或Midland CertifiedReagent Company(Midland，Texas)來合成寡核苷酸(引物)。
實施例5種特異性引物的選擇用來自GenBank(National Center for BiotechnologyInformation，Bethesda，Maryland)表的核果鏈核盤菌和M.fructicola ITS區序列AF010500、AF010503、AF010504、Z73777和Z73784進行多重序列對比。使用核果鏈核盤菌(Z73784)、M.fructicola(Z73777)、油菜核盤菌(Z73799)和灰葡萄孢(B.cinera)(U21817)進行第二次序列對比。以對進行序列對比的序列的分析為基礎、按照實施例4合成諸如下表2中所示的那些寡核苷酸引物。將引物用於在真菌種中含有最大序列差異的區。還將引物用於兩種鏈核盤菌屬種中高度保守的區以嘗試開發屬特異性引物。
此外，合成公開的核糖體基因特異性引物ITS1、ITS2、ITS3和ITS4(White等，1990；見PCR方案；編輯Innes等，315-322頁)用於與對ITS區具有特異性的引物一起進行測試。
表2為真菌檢測設計的引物1.引物模板引物引物序列18S rDNA ITS1 5』TCCGTAGGTGAACCTGCGG3』(SEQ ID NO1)5.8S rDNA ITS2 5』GCTGCGTTCTTCATCGATGC3』(SEQ ID NO2)5.8S rDNA ITS3 5』GCATCGATGAAGAACGCAGC3』(SEQ ID NO3)25S rDNA ITS4 5』TCCTCCGCTTATTGATATGC3』(SEQ ID NO4)M.fructicola JB6685』GTATGCTCGCCAGAGGATAAT3』(SEQ ID NO5)核果鏈核盤菌 JB6695』GTATGCTCGCCAGAGAATAAT3』(SEQ ID NO6)核果鏈核盤菌 JB6705』ATAGACTCAATACCAAGCTGT3』(SEQ ID NO7)/M.fructicolaM.fructicola JB6715』TATGCTCGCCAGAGGATAATT3』(SEQ ID NO8)核果鏈核盤菌 JB6725』TATGCTCGCCAGAGAATAATC3』(SEQ ID NO9)M.fructicola JB6735』GGTTTTGGCAGAAGCACACT3』(SEQ ID NO10)核果鏈核盤菌 JB6745』GTTTTGGCAGAAGCACACC3』(SEQ ID NO11)實施例6對純化真菌基因組DNA的引物特異性的測定按照實施例3、使用不同的引物組合(表3)進行PCRs以嘗試擴增單一特異性片段。由根據所關注的各真菌菌株的小與大核糖體DNA亞單位之間的ITS區設計的引物生產特異性PCR擴增產物。
表3ITS衍生的診斷PCR引物引物特異性5』引物 3』引物擴增片段的大約大小核果鏈核盤菌 JB669(SEQ ID NO6) ITS4(SEQ ID NO4) 433bp/Moniliniafructicola核果鏈核盤菌 JB672(SEQ ID NO9) ITS4(SEQ ID NO4) 473bp核果鏈核盤菌/M. JB668(SEQ ID NO5) ITS4(SEQ ID NO4) 498bpfructicola核果鏈核盤菌/M. JB669(SEQ ID NO6) JB670(SEO ID NO7) 448bpfructicola核果鏈核盤菌 JB672(SEQ ID NO9) JB670(SEQ ID NO7) 438bp核果鏈核盤菌/M. JB668(SEQ ID NO5) JB670(SEO ID NO7) 357bpfructicola核果鏈核盤菌/M. ITS1(SEO ID NO1)JB670(SEQ ID NO7) 512bpfructicola實施例7對受真菌感染的植物組織的引物特異性和與其它真菌病原體的交叉反應性的測定如實施例2中所述從明顯感染和未感染的杏仁樹部位中分離總基因組DNA。如實施例3中所述進行PCRs以測試諸如表3中所列的那些引物組合對來自杏仁組織的DNA的作用。如實施例1中所述獲得純化的真菌基因組DNAs並如實施例3中所述使用診斷引物測定PCR。對其它真菌DNA種類和分離物測試診斷引物與其發生交叉反應的能力。有代表性的實驗結果如下核果鏈核盤菌/M.fructicola特異性引物組合JB669(SEQ ID NO6)和JB670(SEQ ID NO7)由來自表1中所列的所有核果鏈核盤菌和M.fructicola分離物和來自鏈核盤菌屬種類感染的杏仁組織的DNA中擴增了256bp的片段。該引物組合既沒有從健康杏仁組織中也沒有從來自下列表1中所列的常見杏仁病原體的純化基因組DNA中擴增診斷用片段C.acutatum、桃瘡痂病、油菜核盤菌、盤長孢狀刺盤孢和灰葡萄孢。使用下列核果鏈核盤菌/M.fructicola特異性引物組合獲得了類似的診斷結果JB669(SEQ ID NO6)和ITS4(SEQ ID NO4)、JB668(SEQ ID NO5)和ITS1(SEQ ID NO4)、ITS1(SEQ IDNO1)和JB670(SEQ ID NO7)、JB668(SEQ ID NO5)和JB670(SEQ ID NO7)。
引物JB672(SEQ ID NO9)和JB670(SEQ ID NO7)由來自核果鏈核盤菌分離物#32671、#66106和#9953的DNA中擴增了255bp的片段。這些引物沒有從來自下列表1中所列的常見杏仁病原體的純化基因組DNA中擴增M.fructicola、C.acutatum、桃瘡痂病、油菜核盤菌、盤長孢狀刺盤孢和灰葡萄孢。使用核果鏈核盤菌特異性引物組合JB672(SEQ ID NO9)和ITS4(SEQ ID NO4)獲得了類似的診斷結果。
儘管已經參照具體的實施方案描述了本發明，但是顯然許多變化形式、修改和其它實施方案也是可行的；且由此應將所有這類變化形式、修改和實施方案看作屬於本發明的範圍。
序列表110Novartis AG120使用聚合酶鏈反應檢測鏈核盤菌屬種類的方法130PB/5-30846/RTP 2094140US09/258,9671411999-03-0116011170PatentIn 2.0版210121119212DNA213人工序列220223人工序列描述寡核苷酸4001tccgtaggtg aacctgcgg 19210221120212DNA213人工序列220223人工序列描述寡核苷酸4002gctgcgttct tcatcgatgc 20210321120212DNA213人工序列220223人工序列描述寡核苷酸4003gcatcgatga agaacgcagc 20210421120212DNA213人工序列220223人工序列描述寡核苷酸4004tcctccgctt attgatatgc 20210521121212DNA213人工序列220223人工序列描述寡核苷酸4005gtatgctcgc cagaggataat21210621121212DNA213人工序列220223人工序列描述寡核苷酸4006gtatgctcgc cagagaataa t 21210721121212DNA213人工序列220223人工序列描述寡核苷酸4007atagactcaa taccaagctgt 21210821121212DNA213人工序列220223人工序列描述寡核苷酸4008tatgctcgcc agaggataat t 21210921121212DNA213人工序列220223人工序列描述寡核苷酸4009tatgctcgcc agagaataat c 212101021120212DNA213人工序列220223人工序列描述寡核苷酸40010ggttttggca gaagcacact 202101121119212DNA213人工序列220223人工序列描述寡核苷酸40011gttttggcag aagcacacc 19
權利要求
1.一種用於鑑定真菌病原體的寡核苷酸引物，其中所述的寡核苷酸引物選自由SEQ ID NOs5-11組成的組。
2.一對用於以擴增為基礎檢測真菌內轉錄間隔區DNA序列的寡核苷酸引物，其中至少一種所述的引物是選自由SEQ ID NOs5-11組成的組的寡核苷酸引物。
3.權利要求2的寡核苷酸引物對，其中所述引物中的至少一種選自由SEQ ID NOs1-4組成的組。
4.權利要求2的寡核苷酸引物對，其中所述的寡核苷酸引物對選自下列引物對SEQ ID NO6和SEQ ID NO7；SEQ ID NO6和SEQ ID NO4；SEQ ID NO5和SEQ ID NO4；SEQ ID NO5和SEQ ID NO7；SEQ ID NO1和SEQ ID NO7；SEQ ID NO9和SEQ ID NO7；以及SEQ ID NO9和SEQ ID NO4。
5.權利要求4的寡核苷酸引物對，其中將所述的引物對用於檢測核果鏈核盤菌和Monilinia fructicola且其中所述的寡核苷酸引物對選自下列引物對SEQ ID NO6和SEQ ID NO7；SEQ ID NO6和SEQ ID NO4；SEQ ID NO5和SEQ ID NO4；SEQ ID NO5和SEQ ID NO7；以及SEQ ID NO1和SEQ ID NO7。
6.權利要求4的寡核苷酸引物對，其中將所述的引物對用於檢測核果鏈核盤菌且其中所述的寡核苷酸引物對選自下列引物對SEQ IDNO9和SEQ ID NO7；以及SEQ ID NO9和SEQ ID NO4。
7.一種用於檢測真菌病原體的方法，該方法包括下列步驟(a)從感染了病原體的植物葉中分離DNA；(b)使用至少一種權利要求1的引物使所述的DNA進行聚合酶鏈反應擴增；和(c)通過目測觀察所述聚合酶鏈反應擴增的產物來檢測所述的真菌病原體。
8.權利要求7的方法，其中所述的真菌病原體選自核果鏈核盤菌和Monilinia fructicola。
9.一種用於檢測真菌病原體的方法，該方法包括下列步驟(a)從感染了病原體的植物葉中分離DNA；(b)使用所述的DNA作為用一對權利要求4的引物進行的聚合酶鏈反應中的模板擴增所述病原體的部分內轉錄間隔區序列；和(c)通過目測觀察內轉錄間隔區序列的擴增部分來檢測所述的真菌病原體。
10.權利要求10的方法，其中所述的真菌病原體選自核果鏈核盤菌和Monilinia fructicola。
11.一種用於檢測真菌病原體的診斷試劑盒，它包括權利要求1的引物。
12.一種用於檢測真菌病原體的診斷試劑盒，它包括權利要求2的引物對。
全文摘要
本發明涉及聚合酶鏈反應試驗中的引物在檢測真菌病原體、特別是核果鏈核盤菌和Monilinia fructicola中的用途。使用以PCR為基礎的技術將特定的引物鑑定為用於鑑定真菌病原體、特別是核果鏈核盤菌和Monilinia fructicola。
文檔編號C12Q1/68GK1342207SQ00804493
公開日2002年3月27日 申請日期2000年2月28日 優先權日1999年3月1日
發明者J·J·貝克, C·V·派瑞 申請人:辛根塔參與股份公司