一種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取幹細胞的方法

2023-05-17 07:44:41

專利名稱：一種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取幹細胞的方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學技術領域，特別是涉及一種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離
提取幹細胞的方法。
背景技術：
目前國際上從人類骨髓、臍帶血中分離細胞的方法很多，本申請人也申 請了兩項專利技術，如《骨髓臍帶血幹細胞體外分離試劑盒及其應用方法》(申請 號200710137781.9)禾P《一 種有核細胞體外分離試劑盒及其應用方法》(申請號 200610106875. 5)。這些技術為從人體骨髓和胎兒分娩後的臍帶血中獲取幹細胞提供了技 術保障，為幹細胞的臨床應用開闢了廣闊的前景。 但是近年來的研究發現人胎盤和臍帶不僅僅是血中含有大量的幹細胞，而且 在實體組織中也含有大量的成體幹細胞ACS(adult stem cell)，如間充質幹細胞MSC、 (mesenchymal stem cell)、多會g成體幹細胞MAPC(multipotent adult progenitor cell)、多能成體祖細胞USSC(unrestricted somatic stem cell)、內皮祖細胞 EPC (endothelialprogenitor cell)、月旨肪_衍生幹細胞ASC (adipose__derived stern cell)，脂肪幹細胞FSC(fat stem cells)、成纖維幹細胞(fibroblasts stemcell)、造血幹 細胞HSC (hematopoietic stem cell)等。 一直以來，在胎兒分娩後，胎盤和臍帶就成廢物。 從這些廢棄的實體組織中收集提取成體幹細胞，將會對成體幹細胞的臨床應用和研究提供 豐富的幹細胞來源。 近年來科學家們也發現脂肪組織中除含有豐富的脂肪幹細胞(FSC)以外， 還含有成纖維幹細胞(fibroblasts stem cell)、間充質幹細胞(MSC)，造血幹細胞 HSC (hematopoietic stem cell)等成體幹細胞(ACS)。脂肪組織中幹細胞的種類與數量僅 次於骨髓組織，是人體的第二大儲存幹細胞的組織。在臨床上採集骨髓和採集腹部的脂肪， 兩者相比，採集脂肪病人更容易接受，相比痛苦也小一點。還有近年來美容和減肥的吸脂手 術後可獲得大量的脂肪，將這些脂肪中的幹細胞分離提取再利用也是一個非常好的途徑。
胎盤、臍帶及脂肪組織儘管結構不同、組織種類不同，但都是實體組織。雖然兩種 組織儲存的成體幹細胞的種類和數量方面有差異，但是存在於組織中細胞池(也叫壁龕、 集落)的存在形式是相同的，所以可用同一種獲取的方法獲得。 目前，儘管已經有從胎盤臍帶組織中提取間充質幹細胞的方法，也有從胎盤臍帶 組織中獲取營養層幹細胞的方法，但都是實驗室技術，距離產品的產業化還有很長一段距 離；第二，這些方法只能獲取單一種類的幹細胞，不能有效保留全部的成體幹細胞/祖細 胞；第三由於是實驗室技術沒有操作規範的和產品質量要求，在臨床推廣應用時無法保證 生物安全性和質量控制。

發明內容
本發明的目的在於克服上述現有技術的缺陷，提供一種可在臨床推廣應用，方便可靠，安全有效的從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取幹細胞的方法，該方法可獲得成體組
織中所有的幹細胞。 本發明的技術方案為 本發明不僅實現了從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取所有幹細胞，而且實現了工業化生產，使醫生在臨床上方便、安全、規範地獲取成體幹細胞，像用藥一樣地使用成體幹細胞治療病人的疾病，解決臨床上很難獲取成體幹細胞的瓶頸，推廣細胞治療技術。本發明的方法簡單可靠，操作規範，安全有效，避免交叉汙染，規範操作，能夠保證質量控制的產
具體實施方式
實施例1
試劑盒組成 1、沉澱劑5%羥乙基澱粉，0.4%葡萄糖酸鈣的水溶液，ra值為7.4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。 2 、泛影酸鈉-聚蔗糖400# : 5 %聚蔗糖400#等，12. 5 %泛影酸鈉的混合液，密度1. 077-1. 080， PH值為7. 4±0. 2。 3、細胞保養液磷酸緩衝液，ra值為7. 4±0. 2。4、膠原酶II或III或IV50-100mg或0. 25%胰蛋白酶10ml。 5、試劑盒同時配有一次性滅菌的組織粉碎桶、粉碎機刀頭、蔡氏過濾器、50ml矽化離心管，10ml和25ml移液管、細胞轉移管組成的一個組合包裝。採用吸塑盒密封的一次性使用的包裝。採用Y射線消毒或是環氧乙烷消毒。每一套試劑盒配一套一次性用品。
上述的l-3條試劑配製後經過12rC高壓滅菌35分鐘，分別存放試劑盒中，測試細菌內毒素《0. 5EU/ml，2 8t:保存和運輸，膠原酶分裝後與上述試劑一起保存。
取新鮮胎盤和臍帶一個稱量以後，按重量與細胞保養液以4 : l的比例放到組織粉碎桶，以6000轉/分4分鐘粉碎，加入膠原酶1支混勻後，放置到37°C ±0. 5t:的水浴箱中30分鐘。 用蔡氏漏鬥過濾後按體積4 : l加入沉澱劑，混勻後靜置20-30分鐘，收取上清夜，離心力1100Xg離心5分鐘，除去上清夜，加到泛影酸鈉-聚蔗糖400"夜體上面(雞尾酒加法)。用離心力650Xg離心30分鐘，吸取細胞層，用細胞保養液清洗3次。進行細胞計數和細胞存活率檢測後即可使用。
細胞存活率>96%; 細胞收集率為200g胎盤臍帶組織收集細胞總數應為2. 5-4. 9X 108。 上述濃度為質量濃度，其操作方法為質量規範方法，其產品的包裝組合為實用技
術組合。 實施例2
試劑盒組成 1、沉澱劑7%羥乙基澱粉，0. 2%葡萄糖酸鈣的水溶液，ra值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。 2 、泛影酸鈉-聚蔗糖400# : 6 %聚蔗糖400#等，10 %泛影酸鈉的混合液，密度
41. 077-1. 080， PH值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。
3 、細胞保養液、磷酸緩衝液。 4、膠原酶II或III或IV50-100mg或0. 25%胰蛋白酶10ml。 5、試劑盒同時配有一次性滅菌的組織粉碎桶、粉碎力頭、蔡氏過濾器、50ml矽化離
心管，10ml和25ml移液管、細胞轉移管組成的一個組合包裝。採用吸塑盒密封的一次性使
用的包裝。採用Y射線消毒或是環氧乙烷消毒。每一套試劑盒配一套一次性用品。 上述的1-3條試劑配製後經12rC高壓滅菌35分鐘。測試細菌內毒素《0. 5EU/
ml，分別存放試劑盒中，2 8t:保存和運輸，膠原酶分裝後與上述試劑一起保存。 取新鮮胎盤和臍帶一個稱量以後，按重量與細胞保養液以3 : l的比例放到組織
粉碎桶，以6000轉/分4分鐘粉碎，加入膠原酶1支混勻後，放置到37°C ±0. 5t:的水浴箱
中30分鐘。 具體操作方法同實施例l。 細胞收集率為200g胎盤臍帶組織收集細胞總數應為2. 5-4. 9 X 108。 上述濃度為質量濃度，其操作方法為質量規範方法，其產品的包裝組合為實用技
術組合。 實施例3
試劑盒組成 1、沉澱劑5%羥乙基澱粉，0. 4%葡萄糖酸鈣的水溶液，ra值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。 2、泛影酸鈉_聚蔗糖400# :5%聚蔗糖400#等，12. 5 %泛影酸鈉的混合液，密度1. 077-1. 080， PH值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。
3 、細胞保養液磷酸緩衝液。 4、膠原酶II或III或IV50-100mg或0. 25%胰蛋白酶10ml。 5、試劑盒同時配有一次性滅菌的組織粉碎桶、粉碎力頭、蔡氏過濾器、50ml矽化離
心管，10ml和25ml移液管、細胞轉移管組成的一個組合包裝。採用吸塑盒密封的一次性使
用的包裝。採用Y射線消毒或是環氧乙烷消毒。每一套試劑盒配一套一次性用品。 上述的1-3條試劑配製後經過12rC高壓滅菌35分鐘，分別存放試劑盒中，測試細
菌內毒素《0. 5EU/ml，2 8t:保存和運輸，膠原酶分裝後與上述試劑一起保存。 取新鮮的脂肪組織，按重量與細胞保養液以4 : l的比例放到組織粉碎桶，以3000
轉/分2分鐘粉碎，加入膠原酶1支混勻後，放置到37°C ±0. 5t:的水浴箱中30分鐘。 用蔡氏漏鬥過濾後按體積4 : l加入沉澱劑，混勻後靜置20-30分鐘，收取上清
夜，離心力1100Xg離心5分鐘，除去上清夜，加到泛影酸鈉-聚蔗糖400ft液體上面(雞尾
酒加法)。用離心力650Xg離心20分鐘，吸取細胞層，用細胞保養液清洗3次。進行細胞計
數和細胞存活率檢測後即可使用。 細胞存活率>96%。 細胞收集率為350g吸取的脂肪組織收集細胞總數應為1 X 108。 上述濃度為質量濃度，其操作方法為質量規範方法，其產品的包裝組合為實用技
術組合。 實施例4
試劑盒組成 1、沉澱劑7%羥乙基澱粉，0. 2%葡萄糖酸鈣的水溶液，ra值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。 2 、泛影酸鈉-聚蔗糖400# : 6 %聚蔗糖400#等，10 %泛影酸鈉的混合液，密度1. 077-1. 080， PH值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。
3、細胞保養液磷酸緩衝液。 4、膠原酶II或III或IV50-100mg或0. 25%胰蛋白酶10ml。 5、試劑盒同時配有一次性滅菌的組織粉碎桶、粉碎力頭、蔡氏過濾器、50ml矽化離
心管，10ml和25ml移液管、細胞轉移管組成的一個組合包裝。採用吸塑盒密封的一次性使
用的包裝。採用Y射線消毒或是環氧乙烷消毒。每一套試劑盒配一套一次性用品。 上述的1-3條試劑配製後經12rC高壓滅菌35分鐘。測試細菌內毒素《0. 5EU/
ml，分別存放試劑盒中，2 8t:保存和運輸，膠原酶分裝後與上述試劑一起保存。 取新鮮的脂肪組織，按重量與細胞保養液以4 : 1的比例放到組織粉碎桶中，以
3000轉/分2分鐘粉碎，加入膠原酶1支混勻後，放置到37°C ±0. 5°C的水浴箱中30分鐘。 具體應用方法同實施例l。 細胞存活率>96%。 細胞收集率為350g吸取的脂肪組織收集細胞總數應為1 X 108。 上述濃度為質量濃度，其操作方法為質量規範方法，其產品的包裝組合為實用技
術組合。 實施例5
試劑盒組成 1、沉澱劑7%羥乙基澱粉，0. 2%葡萄糖酸鈣的水溶液，ra值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。 2 、泛影酸鈉-聚蔗糖400# : 6 %聚蔗糖400#等，10 %泛影酸鈉的混合液，密度1. 077-1. 080， PH值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。
3、細胞保養液磷酸緩衝液。 4、膠原酶II或III或IV50-100mg或0. 25%胰蛋白酶10ml。 5、試劑盒同時配有一次性滅菌的組織粉碎桶、粉碎力頭、蔡氏過濾器、50ml矽化離
心管，10ml和25ml移液管、細胞轉移管組成的一個組合包裝。採用吸塑盒密封的一次性使
用的包裝。採用Y射線消毒或是環氧乙烷消毒。每一套試劑盒配一套一次性用品。 上述的1-3條試劑配製後經12rC高壓滅菌35分鐘。測試細菌內毒素《0. 5EU/
ml，分別存放試劑盒中，2 8t:保存和運輸，膠原酶分裝後與上述試劑一起保存。 取新鮮的脂肪組織，按重量與細胞保養液以2.5 : l的比例放到組織粉碎桶中，以
3000轉/分2分鐘粉碎，加入膠原酶1支混勻後，放置到37°C ±0. 5°C的水浴箱中30分鐘。 具體應用方法同實施例1 。 細胞存活率>96%。 細胞收集率為350g吸取的脂肪組織收集細胞總數應為1 X 108。 上述濃度為質量濃度，其操作方法為質量規範方法，其產品的包裝組合為實用技
術組合。
6
本發明的具體實施方式
不限於上述實施例所提供的方式,
權利要求
一種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取幹細胞的方法，其工藝步驟為首先將胎盤、臍帶或脂肪組織與細胞保養液按2.5～4∶1的重量比混合放入組織粉碎桶中，以3000-6000轉/分的轉速粉碎2-4分鐘，然後加入膠原酶充分混勻，放置到37℃±0.5℃的水浴箱中孵育20-30分鐘，用200目過濾器過濾，按組織懸液量的25％-40％比例加入沉澱劑，混勻後靜置10～30分鐘，吸取上清液，用1100Xg的離心力離心3～5分鐘，除去上清液，將濃縮的細胞加入到泛影酸鈉-聚蔗糖400#的液體上，用離心力650Xg離心10-30分鐘，收取中間10-15ml的細胞層，用細胞保養液清洗3-4次，將收集的細胞計數，檢測細胞存活率≥95％時，即可以供臨床使用。
2. 按照權利要求1所述的從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取幹細胞的方法，其特徵在於將上述分離提取幹細胞的所有試劑細胞保養液、膠原酶、沉澱劑和泛影酸鈉_聚蔗糖400#分開保存於同一個試劑盒中，每一套試劑盒與一套一次性用品配套作為一次分離提取的器具。
3. 按照權利要求1或2所述的從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取幹細胞的方法，其特徵是所述的細胞保養液為磷酸緩衝液，ra值為7. 4±0. 2。
4. 按照權利要求1或2所述的從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取幹細胞的方法，其特徵是所述的膠原酶為膠原酶11、膠原酶III或膠原酶IV。
5. 按照權利要求1或2所述的從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取幹細胞的方法，其特徵是所述的沉澱劑是指由5-7%的羥乙基澱粉、甲基纖維素或羧甲基澱粉與0. 2-0. 4%葡萄糖酸鈣組成的水溶液，ra值為7. 4±0. 2。
6. 按照權利要求1或2所述的從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取幹細胞的方法，其特徵是所述的泛影酸鈉_聚蔗糖400#，其密度為1. 077-1. 080， PH值為7. 4±0. 2。
7. 按照權利要求2所述的從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取幹細胞的方法，其特徵是所述一套一次性用品是由一次性滅菌的組織粉碎桶、粉碎力頭、蔡氏過濾器、50ml矽化離心管、10ml和25ml移液管和細胞轉移管組成的一個組合包裝。
全文摘要
本發明涉及一種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取幹細胞的方法，其工藝步驟為首先將胎盤、臍帶或脂肪組織與細胞保養液按2.5～4∶1的重量比混合放入組織粉碎桶中，粉碎後加入膠原酶混勻，在37℃左右條件下孵育，過濾，加入沉澱劑，靜置後吸取上清液，離心，除去上清液，將濃縮的細胞加入到泛影酸鈉-聚蔗糖400#的液體上，再離心，收取中間10-15ml的細胞層，用細胞保養液清洗，將收集的細胞計數，檢測細胞存活率≥95％時，即可以供臨床使用。本發明不僅實現了從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取所有幹細胞，而且實現了工業化生產，使醫生在臨床上方便、安全、規範地獲取成體幹細胞，像用藥一樣地使用成體幹細胞治療病人的疾病，解決臨床上很難獲取成體幹細胞的瓶頸，推廣細胞治療技術。
文檔編號C12N5/074GK101693884SQ20091011752
公開日2010年4月14日 申請日期2009年10月21日 優先權日2009年10月21日
發明者王懷林, 王沁怡 申請人:王沁怡;王懷林;