一種奇異變形桿菌菌株及其轉化大豆苷元生產s-雌馬酚的方法
2023-05-17 14:53:56
專利名稱：一種奇異變形桿菌菌株及其轉化大豆苷元生產s-雌馬酚的方法
技術領域：
本發明涉及一種奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)菌株(LH-52)及該菌株將大豆中富含的大豆苷元(daidzein)直接轉化為高活性植物雌激素S-雌馬酚(S-equol)的方法，屬於生物化工領域。
背景技術：
大豆異黃酮具有與雌激素雌二醇類似的結構，被廣泛稱為「植物雌激素(phytoestrogen)」。大量的研究發現以大豆苷元(daidzein)和染料木素(genistein)為主要成分的大豆異黃酮具有非常廣泛的生物學活性，除了雌激素樣作用外還具有抗氧化、調節細胞周期等功能。雌馬酚(equol)為大豆苷元的腸道菌代謝產物，相對於大豆苷元和染料木素而言，雌馬酚具有更高的雌激素活性和抗氧化活性。病理學研究表明equol在預 防乳腺癌，前列腺癌，骨質疏鬆症以及更年期綜合症方面有顯著療效。特別是作為雌二醇類似物，可以與雌激素受體結合，在治療更年期綜合症以及乳腺增生、乳腺癌等雌激素分泌失調疾病上有顯著療效。然而Lampe Jff, Karr SC, Hutchins AM等的研究表明，由於腸道菌群、飲食結構等的不同，大約只有309Γ45%的人群體內能產生equol，也就是說人類攝入大豆製品或者大豆異黃酮後，並非所有人都能在體內產生equol，對於非雌馬酚產生者而言攝入大豆製品或大豆異黃酮所產生的健康效應相對弱於雌馬酚產生者。因此研究雌馬酚的合成機制及篩選生產菌種，進一步合成高生物活性的雌馬酚對人類健康而言具有重要的意義。雌馬酹具有兩種不同的手性結構R-equol和S-equol,其中S_equol是生物天然合成的形態，與雌激素受體具有更強的結合力。S-equol對β_人體雌激素受體(β -Estrogen Receptor,簡稱β-ER)的親和力要比R-型雌馬酹高13倍、比消旋體雌馬酹(equol)高兩倍。雌馬酚的合成途徑目前主要有化學合成和生物合成兩種，其中化學方法合成的雌馬酚為外消旋體雌馬酚，而生物合成的雌馬酚全部為S-equol，因而生物合成法更適用於相關藥物和食品添加劑的生產。韓國專利PTC/KR2005/001285公布了一種能將二氫大豆苷元轉化為S-雌馬酚的革蘭氏陰性菌株Eggerthella Julong 732,但該菌株卻不能直接將大豆苷元轉化為S-雌馬酚。二氫大豆苷元是大豆苷元的加氫還原產物，目前雖然能以大豆苷元為原料通過化學氫轉移法進行合成，但價格昂貴。此外有文獻報導通過混合菌培養，先將大豆苷元轉化為二氫大豆苷元然後再使用Eggerthella Julong 732將二氫大豆苷元轉化為S-雌馬酚，但此方法混合菌的接種比例以及接種時機難以控制，並且培養條件苛刻，比較難以實現。國內專利CN 101338294B和CN 102021130A描述的不動桿菌AUH-JLM455以及雙酶梭菌菌株為嚴格厭氧菌，相比較而言本發明的奇異變形桿菌為兼性厭氧菌，培養條件更為粗放，更適合於工業化生產。
發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在於提供了一種奇異變形桿菌菌株LH-52及其轉化大豆苷元(daidzein)生產S-雌馬酚的方法。本發明解決了現有技術中存在的轉化製備S-雌馬酚難以實現的問題，提供一種能將潛手性化合物大豆苷元直接轉化為手性化合物S-雌馬酚的單一功能微生物菌株及其製備方法。相對於以往報導的嚴格厭氧雌馬酚轉化菌株以及混合菌轉化，本發明得到的奇異變形桿菌Proteus mirabilis LH-52菌株為兼性厭氧菌，更適合於工業生產。本發明為達到上述的目的，本發明採用如下技術方案—種奇異變形桿菌菌株LH-52,該LH-52菌株保藏於中國典型培養物保藏中心,保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏號為CCTCC M 2011390，保藏日期為2011年11月13日。所述的奇異變形桿菌Proteus mirabilis菌株LH-52的製備方法如下I.樣品的採集 取大鼠腸道盲腸5釐米內的腸道內容物，懸浮於生理鹽水中，過濾去除其中的固形物，然後取濾液200微升接種於新鮮滅菌的液體培養基中37°C厭氧活化培養24小時。其中所述的新鮮液體培養基配方為蛋白腖27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。2.樣品的抗生素抑制與特定功能菌株的分離篩選(I)樣品的抗生素抑制取100微升活化後菌株分別接種於新鮮滅菌並添加大豆苷元(終濃度為100微摩爾/升)以及分別對應以下一種抗生素(所述的抗生素採用諾氟沙星、土黴素、琥乙紅黴素、硫酸慶大黴素)的液體培養基內，於37°C培養4天後用高效液相色譜儀檢測是否有雌馬酚產生，從而得出結論為添加土黴素的一組有雌馬酚產生。其中所述的新鮮液體培養基配方為蛋白腖27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。(2)單一菌落的分離篩選用新鮮滅菌的液體培養基(所述的新鮮液體培養基配方為蛋白腖27.5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。)將添加土黴素組的菌群液進行梯度稀釋，分別稀釋為 10-1、10_2、10' 10_4、I O-5、10' 10' 10_8、10_9、ΙΟ—1。倍，再分別取 40微升上述稀釋倍數的微生物菌群稀釋液均勻塗布在預先準備好的固體培養基(上述液體培養基添加15克/升的瓊脂)上，將塗布微生物菌群稀釋液的固體培養基於37°C厭氧培養12小時之後，從固體培養基上挑取單菌落並劃線在斜面培養基上(培養基成分同上述固體培養基)，37°C厭氧培養18 24小時，同時對單菌落進行隨機編號。(3)具有轉化功能的單菌落篩選準備含100微摩爾/升大豆苷元並滅菌的新鮮液體培養基(所述的新鮮液體培養基配方為蛋白腖27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。)，分裝入10毫升的厭氧瓶內，分別接種入已編號的單菌落並於37°C培養4天，然後用高效液相色譜儀檢測，結論為有雌馬酚生成的對應單菌落即為具有轉化功能的單菌落。3.單一功能微生物菌種的純化培養、菌種初步鑑定與保藏(I)單菌落的純化培養
將篩選出的單一微生物菌落在固體培養基(上述液體培養基添加15克/升的瓊月旨)上反覆純化培養3次，確保菌落形態一致，將純化的單一菌株接種到已滅菌的液體培養基活化培養24小時，之後菌液添加30%甘油混合均勻並保藏在-83°C的超低溫冰箱內，並定期進行復壯培養和轉化活性測定。(2)對篩選出的單一功能微生物菌株進行菌種鑑定根據菌落及菌體形態、革蘭氏染色、常規生化鑑定以及16S rDNA基因測序等多項指標，將分離到的功能菌株LH-52初步鑑定為奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)菌株。本發明的奇異變形桿菌(Proteus mirabilis) LH-52具有以下微生物學特性I、形態學特徵在顯微鏡下觀察在液體培養基中培養的菌株時，菌體呈杆狀，具有運動能力，菌體長度3飛微米，革蘭氏染色陰性。 2、培養學特徵在37°C下，固體培養基中培養時，本發明菌株呈膜狀的白色乾燥菌落。3、生理特徵本發明的菌株是一種兼性厭氧菌，在35 37°C下顯示最佳生長能力，本發明的奇異變形桿菌(Proteus mirabilis) LH-52與奇異變形桿菌的生理生化特徵上的異同見表I。一種奇異變形桿菌菌株轉化大豆苷元生產S-雌馬酚的方法，包括以下步驟I)奇異變形桿菌菌株LH-52的培養將保藏號為CCTCC M 2011390的奇異變形桿菌菌株LH-52，37°C厭氧活化培養12 18小時後，接種於已滅菌的新鮮液體培養基。2)底物的加入採用大豆苷元(daidzein)作為底物；按照I : 100的接種量將步驟I)中菌液接種於含100微摩爾/升底物大豆苷元的滅菌液體培養基，繼續厭氧37°C培養4天，即可轉化底物為S-雌馬酚。3)代謝產物的分離純化將步驟2)中得到的培養物濃縮後用3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，合併萃取液並用旋轉蒸發儀蒸乾，然後加入100%純甲醇溶解，在半製備型高效液相色譜儀上可分離製備得到S-雌馬酚。所述步驟I)和步驟2)中的液體培養基配方為蛋白腖27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。代謝產物的手性純度檢測將培養物萃取液蒸乾後，用100%純甲醇溶解，在Daicel OJ-H手性柱上進行檢測，檢測條件如下A相為正己烷，B相為異丙醇，A:B=70:30，檢測器波長280nm。對比外消旋標準品以及S-雌馬酚標準品的HPLC圖譜確定產物的手性，並計算對映體過量值(％e. e)。本發明的有益效果是本發明解決了現有技術中存在的轉化製備S-雌馬酚難以實現的問題，提供一種能將潛手性化合物大豆苷元直接轉化為手性化合物S-雌馬酚的單一功能微生物菌株及其製備方法。相對於以往報導的嚴格厭氧雌馬酚轉化菌株以及混合菌轉化，本發明得到的奇異變形桿菌Proteus mirabilis LH-52菌株為兼性厭氧菌,更適合於工業生產。
本發明的奇異變形桿菌LH-52菌株已於2011年11月13日在中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC M 2011390 ；表I是本發明奇異變形桿菌菌株LH-52與奇異變形桿菌的生理生化特徵比較表；圖I為本發明實施例中大鼠腸道分離菌株LH-52轉化大豆苷元為S-雌馬酚的代謝過程圖；圖2為本發明實施例中大鼠腸道分離菌株LH-52轉化大豆苷元的發酵萃取液的HPLC圖譜；圖3為本發明實施例中大豆苷元與雌馬酚標準品的HPLC圖譜；圖4為本發明實施例中大鼠腸道分離菌株LH-52轉化大豆苷元代謝產物的質譜圖；
圖5為本發明實施例中外消旋雌馬酚和大豆苷元的混合標準品手性柱HPLC圖譜；圖6為本發明實施例中S-雌馬酚標準品手性柱HPLC圖譜；圖7為本發明實施例中發酵萃取液手性柱HPLC圖譜。
具體實施例方式下面通過附圖和具體實施對本發明做進一步說明，但並不意味著對本發明保護範圍的限制。本實施例的一種奇異變形桿菌菌株LH-52,該LH-52菌株於保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏號為CCTCC M 2011390，保藏日期為2011年11月13日。所述的奇異變形桿菌Proteus mirabilis菌株LH-52的製備方法如下I.樣品的採集取大鼠腸道盲腸5釐米內的腸道內容物，懸浮於生理鹽水中，過濾去除其中的固形物，然後取濾液200微升接種於新鮮滅菌的液體培養基中37°C厭氧活化培養24小時。其中所述的新鮮液體培養基配方為蛋白腖27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。2.樣品的抗生素抑制與特定功能菌株的分離篩選( I)樣品的抗生素抑制取100微升活化後菌株分別接種於新鮮滅菌並添加大豆苷元(終濃度為100微摩爾/升)以及分別對應以下一種抗生素(所述的抗生素採用諾氟沙星、土黴素、琥乙紅黴素、硫酸慶大黴素)的液體培養基內，於37°C培養4天後用高效液相色譜儀檢測是否有雌馬酚產生，通過液相色譜圖比對，得出結論為添加土黴素的一組有雌馬酚產生。其中所述的新鮮液體培養基配方為蛋白腖27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2.5克/升。(2)單一菌落的分離篩選用新鮮滅菌的液體培養基(所述的新鮮液體培養基配方為蛋白腖27.5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。)將添加土黴素組的菌群液進行梯度稀釋，分別稀釋為 10-1、10_2、10' 10_4、I O-5、10' 10' 10_8、10_9、10_10 倍，再分別取 40微升上述稀釋倍數的微生物菌群稀釋液均勻塗布在預先準備好的固體培養基(上述液體培養基添加15克/升的瓊脂)上，將塗布微生物菌群稀釋液的固體培養基於37°C厭氧培養12小時之後，從固體培養基上挑取單菌落並劃線在斜面培養基上(培養基成分同上述固體培養基)，37°C厭氧培養18 24小時，同時對單菌落進行隨機編號。(3)具有轉化功能的單菌落的篩選準備含100微摩爾/升大豆苷元並滅菌的新鮮液體培養基(所述的新鮮液體培養基配方為蛋白腖27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。)，分裝入10毫升的厭氧瓶內，分別接種入已編號的單菌落並於37°C培養4天，然後用高效液相色譜儀檢測，通過液相色譜圖比對，得出的結論為有雌馬酚生成的對應單菌落即為具有轉化功能的單菌落。3.單一功能微生物菌種的純化培養、菌種初步鑑定與保藏( I)單菌落的純化培養 將篩選出的單一微生物菌落在固體培養基(上述液體培養基添加15克/升的瓊月旨)上反覆純化培養3次，確保菌落形態一致，將純化的單一菌株接種到已滅菌的液體培養基活化培養24小時，之後菌液添加30%甘油混合均勻並保藏在_83°C的超低溫冰箱內，並定期進行平板劃線分離復壯培養以及用高效液相色譜對菌株轉化活性進行測定。(2)對篩選出的單一功能微生物菌株進行菌種鑑定根據菌落及菌體形態、革蘭氏染色、常規生化鑑定以及16S rDNA基因測序等多項指標，將分離到的功能菌株LH-52初步鑑定為奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)菌株。本發明的奇異變形桿菌(Proteus mirabilis) LH-52具有以下微生物學特性I、形態學特徵在顯微鏡下觀察在液體培養基中培養的菌株時，菌體呈杆狀，具有運動能力，菌體長度3飛微米，革蘭氏染色陰性。2、培養學特徵在37 °C下，固體培養基中培養時，本發明菌株呈膜狀的白色乾燥菌落。3、生理特徵本發明的菌株是一種兼性厭氧菌，在35 37°C下顯示最佳生長能力，本發明的奇異變形桿菌(Proteus mirabilis) LH-52與奇異變形桿菌的生理生化特徵上的異同見表I。本實施例的一種奇異變形桿菌菌株轉化大豆苷元生產S-雌馬酚的方法，包括以下步驟I)將保藏號為CCTCC M 2011390的奇異變形桿菌菌株LH-52用接種環將2 3環奇異變形桿菌菌株Proteus mirabilis LH-52接種在10毫升滅菌的新鮮液體培養基中，37°C厭氧活化培養12 18小時；所述的新鮮液體培養基配方為蛋白腖27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。2)底物的加入採用大豆苷元(daidzein)作為底物；按照I : 100的接種量接種於含100微摩爾/升底物大豆苷元的滅菌液體培養基，繼續37°C厭氧培養4天；即可轉化底物為S-雌馬酚。3)代謝產物的分離純化將步驟2)中得到的培養物濃縮後用3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，合併萃取液並用旋轉蒸發儀蒸乾。加入100%純甲醇溶解，在半製備型高效液相色譜儀上可分離製備得到S-雌馬酌·。A.代謝產物S-雌馬酚的製備
將上述步驟得到的S-雌馬酚培養液蒸乾後的粗提品溶解在100%甲醇中，過O. 22 μ m尼龍濾膜後，在高效液相色譜上進行分離，最終得到8. 3毫克的S-雌馬酚純品(純度>95%)。本發明中使用依利特P230型高效液相色譜儀，所用製備柱為Angilent 5 μ m C18色譜柱(250X9. 4mm)，選用甲醇和水作為流動相，HPLC分離製備時，A液為甲醇，B液為水，A B=55 45，流動相流速為2毫升/分，檢測器波長設置為280納米。B.代謝產物的結構鑑定(I)根據代謝產物與標準品雌馬酚在高效液相色譜儀上的保留時間初步確定代謝產物為雌馬酚。如圖I所示，其為大鼠腸道分離菌株LH-52轉化大豆苷元為雌馬酚的過程圖。如圖2所示，其為大鼠腸道分離菌株LH-52轉化大豆苷元的發酵萃取液的HPLC圖
-i'Tfe P曰。如圖3所示，其為混合標準品大豆苷元和雌馬酚的HPLC圖譜。由圖2和圖3所示，本實施例製備的雌馬酚保留時間為13. 881分鐘，標準品雌馬酚的保留時間為13. 829分鐘，可以初步確定為本實施例製備的產品為雌馬酚。(2)代謝產物的質譜測定(ESI-TOF MS)如圖4所示，菌株LH-52轉化大豆苷元的代謝產物的質譜表明，該代謝產物的分子離子峰為m/z 241 [Μ-ΗΓ，這與雌馬酚的分子量(C15H14O3)相一致。(3)代謝產物的核磁共振圖譜大鼠腸道分離菌株LH-52轉化大豆苷元的代謝產物的核磁共振氫譜和碳譜與以往報導的雌馬酚的氫譜和碳譜基本一致，具體結果如下1H NMR (500MHz, CDCl3) δ 7. I 2 (d, 9. OHz, 2Η) , 6. 95 (d, 8. OHz, 1Η),6. 82 (d, 8. OHz，2Η)，6. 40 (dd, 2. 5Ηζ, 9. OHz，I H)，6. 37 (d, 2. 5Hz, 1Η)，4. 30 (dd, 10. OHz, 2. 5Hz, 1Η)，3. 97 (t, 10. 5Hz, 1Η)，3. 17 (m, 1Η)，2. 94 (m, 2Η)。13C 匪R(125MHz, CDCl3) δ 155. 1，154. 9，154. 5，133. 6，130. 4，128. 6，128. 6，115. 6，115. 6，114. 4，108. 0,103. 2,71. 1,37. 9,31. 8。C.代謝產物雌馬酚手性徵測定如圖6所示為S-雌馬酚標準品的手性柱HPLC圖譜，圖5為外消旋雌馬酚和大豆苷元的混合標準品手性柱HPLC圖譜，圖7為培養萃取液的HPLC圖譜，S-雌馬酚的保留時間為18. 657分鐘，對應的R-雌馬酚保留時間為23. 397分鐘，大豆苷元的保留時間為14. 973分鐘，培養萃取液在14. 562分鐘和18. 531分鐘處出現2個峰，根據峰面積計算得到產物雌馬酚的對映體過量值(％e. e.)為100%。本實施例解決了現有技術中存在的轉化製備S-雌馬酚難以實現的問題，提供一種能將潛手性化合物大豆苷元直接轉化為手性化合物S-雌馬酚的功能微生物菌株及其製備方法。相對於以往報導的嚴格厭氧雌馬酚轉化菌株以及混合菌轉化，本發明得到的奇異變形桿菌Proteus mirabilis LH-52菌株為兼性厭氧菌,更適合於工業生產。表I
權利要求
1.一種奇異變形桿菌菌株，其特徵在於該菌株保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2011390，保藏日期為2011年11月13日。
2.一種如權利要求I所述的奇異變形桿菌菌株轉化大豆苷元生產S-雌馬酚的方法，其特徵在於包括以下步驟 1)奇異變形桿菌菌株的培養將奇異變形桿菌菌株，37°C厭氧活化培養12 18小時後，接種於已滅菌的液體培養基。
2)底物的加入採用大豆苷元(daidzein)作為底物；按照I: 100的接種量將步驟I)中菌液接種於含100微摩爾/升底物大豆苷元的滅菌液體培養基，繼續厭氧37°C培養4天，即可轉化底物為S-雌馬酚。
3)代謝產物的分離純化將步驟2)中得到的培養物濃縮後用3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，合併萃取液並用旋轉蒸發儀蒸乾。加入100%純甲醇溶解，在半製備型高效液相色譜儀上可分離製備得到S-雌馬酚。
3.如權利要求2所述的一種奇異變形桿菌菌株轉化大豆苷元生產S-雌馬酚的方法，其特徵在於所述步驟I)和步驟2)中的液體培養基配方為蛋白腖27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。
全文摘要
本發明公開了一種奇異變形桿菌菌株，該菌株保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2011390，保藏日期為2011年11月13日；以及利用奇異變形桿菌菌株轉化大豆苷元生產S-雌馬酚的方法。本發明解決了現有技術中存在的轉化製備S-雌馬酚難以實現的問題，提供一種能將潛手性化合物大豆苷元直接轉化為手性化合物S-雌馬酚的單一功能微生物菌株及其製備方法。相對於以往報導的嚴格厭氧雌馬酚轉化菌株以及混合菌轉化，本發明得到的奇異變形桿菌Proteus mirabilis LH-52菌株為兼性厭氧菌，更適合於工業生產。
文檔編號C12N1/20GK102925378SQ20121014674
公開日2013年2月13日 申請日期2012年5月11日 優先權日2012年5月11日
發明者肖美添 申請人:華僑大學