水稻早抽穗主效QTL分子標記及其鑑定方法和應用與流程
2023-05-16 23:22:16 3
本發明涉及分子生物學領域，特別是一種水稻早抽穗主效QTL分子標記及其鑑定方法和應用。
背景技術：
：水稻作為我國乃至世界最重要的糧食作物之一，其產量的提高對於解決未來全球糧食問題具有十分重要的戰略意義。然而，現有的水稻品種大都存在著極強的地域和季節局限性，這在很大程度上影響了產量和品質等重要農藝性狀的進一步提高，因此改良水稻品種的地域和季節適應性，培育適應特定地區生態環境與栽培耕作制度的水稻新品種，成為當今稻作育種的主要目標之一。抽穗期是決定水稻品種地域和季節適應性的重要農藝性狀，對水稻品種的高產和穩產起重要作用，長期以來受到育種家的廣泛重視。水稻抽穗期主要由其感光性、感溫性和基本營養生長性決定(ChangTT,LiCC,VergaraBS.(1969)Euphytica,18:79-91；TsaiKH.(1985)RiceGenetNewslett,2:77-78；TsaiKH.(1986)In:RiceGenetics.InternationalRiceResearchInstitute,339-349)。由於不同地區的光溫條件存在很大差異，因此不同地區早熟水稻品種的改良必須要選擇不同類型的早抽穗QTL以適應當地的光溫條件。雖然目前水稻中已經克隆到不少與擬南芥開花期基因同源的基因，但它們對花期的調控機理存在著很大的差異；而且，雖然運用同源克隆的方法在水稻中獲得的早抽穗基因過量表達後也能使水稻獲得早抽穗的特性，但由於遺傳背景的差異，導致這些同源基因至今仍無法應用於早熟水稻新品種的培育過程。因此，挖掘水稻早抽穗基因，對培育適應華南雙季稻作區生態條件的早熟恢復系品種及其雜交組合、解決育種實踐中早熟與豐產難以兼顧的矛盾具有重要意義。在抽穗期基因的定位克隆研究方面，到目前為止，已經有大量抽穗期QTLs定位的報導，但通過圖位克隆的方法所挖掘的抽穗期QTL較少，迄今為止，只有Hd1，Hd6，Hd3a，Ehd1，Ehd2，Ghd7，DTH8和EL1(YanoM.etal.(2000)PlantCell,12:2473-2483；Takahashi,Y.etal.(2001)ProcNatlAcadSciUSA,98:7922-7927；KojimaS.etal.(2002)PlantCellPhysiol,43:1096–1105；DoiK.etal.(2004)GenesDev,18:926-936；MatsubaraK.etal.(2008)PlantPhysiol,148(3):1425-1435；XueWY.etal.(2007)NatGenet,40:761-767；WeiXJ.etal.(2010)PlantPhysiol,153:1747-1758；DaiC,XueHW.(2010)EmboJ,29(11):1916-1927)等基因是通過圖位克隆的方法克隆的，這些基因的克隆極大地促進了人們對水稻抽穗機理的理解。由於抽穗期QTL的挖掘，可以深化我們對水稻抽穗調控網絡的認識和理解，同時，其所獲得的分子標記還可以用於輔助選擇育種。由於分子標記輔助選擇(Marker-AssistedSelection，MAS)方法是對品種的基因型進行的選擇，不受環境的影響，因此MAS育種應用於對水稻早抽穗QTL的改良，必將有效的提升育種的效率。技術實現要素：本發明提供了一種水稻早抽穗主效QTL分子標記及其鑑定方法和應用，通過檢測與水稻早抽穗主效QTL分子標記，可以確定有無早抽穗基因導入到育種品系中，提高該性狀的選擇效率、加快育種進度。為實現上述目的，本發明的技術方案為：一種水稻早抽穗主效QTL分子標記，命名為qHD8.3，所述分子標記分別是RM6670、M55、M07、M13和M15，其對應的引物分別是：RM6670：上遊引物：5'—TCCGTCGCTGCAAATTAGTCC—3'；下遊引物：5'—CCATGTACCTCTATAATGGCAAGACC—3'；M55：上遊引物：5'—CCATTTGGTAGGTCCATCTTACCC—3'；下遊引物：5'—CTCCCAAGTGAAGTGCTGTCTGG—3'；M07：上遊引物：5'—GGTGGTCTTGATTCCCTTGT—3'；下遊引物：5'—GAAACAGATCAGCCTCACTG—3'；M13：上遊引物：5'—ATATACAAGCGAACTCCTGT—3'；下遊引物：5'—TAAGTGCGATGAAACAATGA—3'；M15：上遊引物：5'—TGGCACCATCCTCATTGCTC—3'；下遊引物：5'—AGCGTCGTCAGATACATTGG—3'；以上所述的水稻早抽穗主效QTL分子標記的獲取方法，包括以下步驟：以DP30為供體親本，以秈稻品種9311為受體親本和輪迴親本，通過連續回交、自交並定向選擇，在BC4F2代獲得穩定遺傳的早抽穗染色體片段代換系CSSL13；再將代換系CSSL13與9311雜交，獲得F1雜交種，自交後獲得F2分離群體，選擇F2群體中抽穗期表現為早期或晚期的多個單株，分別種植成F2:3株系，選擇F2:3株系沒有分離的對應F2單株用於連鎖分析，獲得權利要求1所述的分子標記。本發明還提供了水稻早抽穗主效QTL分子標記在水稻早抽穗QTL的定位與克隆中的應用。以上所述的水稻早抽穗主效QTL分子標記鑑定方法，包括以下步驟：以待鑑定水稻材料全基因組DNA為模板，利用以上所述的分子標記RM6670、M55、M07、M13和M15對應引物中的一對或多對進行PCR擴增，對擴增產物進行檢測：(1)採用分子標記RM6670引物進行擴增，若擴增出177bp的擴增片段，則表明有早抽穗主效QTL的存在；(2)採用分子標記M55引物進行擴增，若擴增出177bp的擴增片段，則表明有早抽穗主效QTL的存在；(3)採用分子標記M07引物進行擴增，若擴增出166bp的擴增片段，則表明有早抽穗主效QTL的存在；(4)採用分子標記M13引物進行擴增，若擴增出43bp的擴增片段，則表明有早抽穗主效QTL的存在；(5)採用分子標記M15引物進行擴增，若擴增出131bp的擴增片段，則表明有早抽穗主效QTL的存在。其中，以上所述PCR的反應體系如下：以上所述PCR的反應條件為：94℃變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃60s，擴增35個循環，最後72℃終延伸10min。以上所述的分子標記鑑定方法，DNA擴增產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，並通過銀染顯色記錄擴增的DNA條帶。本發明的目的還在於提供了以上所述的分子標記鑑定方法在選育水稻早抽穗品種中的應用。本發明的有益效果為：(1)本發明發現了一種水稻早抽穗主效QTLqHD8.3分子標記，與先前報導的水稻早抽穗QTL例如Hd1，Hd6，Hd3a，Ehd1，Ehd2，Ghd7和DTH8等不同，豐富了人們對水稻抽穗調控網絡的認識和理解，也增加了水稻早抽穗基因資源的多樣性，為培育不同類型的早抽穗水稻品種提供了更多的選擇；(3)本發明通過水稻早抽穗主效QTLqHD8.3分子標記的發現，可加快該早抽穗QTLqHD8.3的克隆，並可將其應用於輔助選擇育種，便於及時的雜交轉育，加快育種進程；(2)本發明建立了一種水稻早抽穗主效QTLqHD8.3分子標記鑑定方法，可以準確、快速地鑑別帶有qHD8.3的早抽穗單株，提高該性狀的選擇效率，加快育種進度。附圖說明圖1是染色體片段代換系CSSL13的抽穗期表型；其中：圖1a：正常長日照條件下9311和CSSL13表型上的差異；圖1b：2014年早季統計9311和CSSL13各30株的抽穗期，計算平均值，A、B表示0.01水平下差異顯著；圖1c：2014年晚季統計9311和CSSL13各30株的抽穗期，計算平均值，C、D表示0.01水平下差異顯著。圖2是F2代單株抽穗期分布圖。圖3是分子標記引物(M07和M13)對F2代52個晚抽穗單株擴增的部分結果圖；其中，圖3a：分子標記引物M07對晚抽穗單株的擴增帶型；圖3b：分子標記引物M13對晚抽穗單株的擴增帶型，第10株是交換單株；圖4是水稻qHD8.3基因在第8染色體上的初步定位圖。具體實施方式下面結合實施實例，對本發明作進一步說明，但本發明的實施方式並不局限於以下實施例。實施例1：分子標記的篩選和定位(一)早抽穗染色體片段代換系CSSL13的構建與代換片段分析以9311為受體親本、廣西普通野生稻DP30為供體親本，通過連續回交、自交並定向選擇，在BC4F2代獲得的穩定遺傳的早抽穗染色體片段代換系CSSL13。根據gramene網站(http://www.gramene.org/)公布的SSR標記以及水稻秈梗序列差異自行設計的STS標記，對親本DP30和9311間進行多態性檢測，一共檢測到408對表現出明顯多態性的標記，利用這408對多態性分子標記對CSSL13進行代換片段分析，結果表明，CSSL13共含有5個供體親本DP30的代換片段，分別位於第1、2、3、8、和11號染色體上，其餘背景均來自9311(表1)，這些代換片段的存在可能是造成其抽穗期變異的原因。表1CSSL13的代換片段及其長度編號染色體代換片段長度(kb)SL11RM486-RM11865-RM3151778SL22RM7423-M9-RM13429-RM19206765SL33M11-RM15288-RM4113850SL48RM6670-M55-M07-M13-M155713SL511M230-RM66801792(二)代換系CSSL13的光溫反應特性分析在南寧正常短日照(南寧早季)和正常長日照(南寧晚季)的大田條件下，CSSL13分別比受體親本9311提早抽穗14.2d(圖1a、圖1b)和13.8d(圖1c)，t測驗分析表明，CSSL13與9311之間的抽穗期差異皆達到了極顯著水平。這表明CSSL13早抽穗的特性可能對光照和溫度不敏感。經過光照培養箱嚴格的長日照與短日照、高溫與低溫處理(分別以E1和E2處理表示)，如表2所示，結果表明CSSL13和9311之間的抽穗期差異分別為14.5d、14.8d、14.0d和13.0d，差異皆達到了極顯著水平(表2)，進一步表明了qHD8.3是一個對光溫不敏感的早抽穗QTL。表2代換系材料CSSL13和9311在不同環境條件下的抽穗期天數註：E1：高溫長日照環境；E2：遮光處理，10h光照/14h黑暗；E3：白天32℃，夜晚27℃，12h光照/12h黑暗；E4：白天25℃，夜晚20℃，12h光照/12h黑暗。a:表示0.05水平下差異不顯著(三)CSSL13/9311的F2分離群體的構建與遺傳分析(1)利用早抽穗染色體片段代換系CSSL13與受體親本9311雜交，獲得F1雜交種，種植F1雜交種，自交獲得F2分離群體，用於遺傳分析。(2)對F2分離群體進行早抽穗鑑定根據田間調查記錄結果繪圖，結果表明，在F2分離群體的412個單株中，抽穗期為76～100d，如圖2所示，呈現明顯的雙峰分布。以92d為界，把群體分為早抽穗和晚抽穗兩大類。早抽穗的單株有297株，晚抽穗的單株有115株。經分析表明，早抽穗和晚抽穗的單株數目符合3:1的分離比例(X2c＝0.94<X20.05,1＝3.841)，這表明CSSL13早抽穗特性受一對顯性主效核基因控制。(3)qHD8.3分子標記連鎖分析及初步定位從F2分離群體的412個單株中，選取100株早抽穗單株和100株晚抽穗單株，分別單株收種和種植，對這些單株的F2:3株系進行後裔檢測，最終篩選出抽穗期穩定遺傳的76個早抽穗單株和52個晚抽穗單株用於目標基因的初步定位。利用篩選出來的具有遺傳背景的多態性分子標記對這些抽穗期穩定遺傳的單株進行連鎖分析，結果發現，qHD8.3和8號染色體上的分子標記RM6670和M15存在連鎖，兩標記處各出現11和5株交換單株，且標記M15上的5株交換單株和標記RM6670上的11株都不相同，表明目標基因可能位於標記RM6670和M15之間；為進一步縮小並明確目標基因的位置，繼續利用標記RM6670和M15之間的三對分子標記M55、M07和M13，對穩定遺傳的早、晚抽穗單株進行PCR擴增並電泳檢測，結果表明，在分子標記M55、M07和M13也分別有6株、2株、1株交換單株，而且分子標記M55上的6株交換單株包含在分子標記RM6670的11株交換單株內，分子標記M07上的2株交換單株包含在分子標記M55的6株交換單株內，分子標記M15上的5株交換單株包含了分子標記M13上的1株交換單株，並且和分子標記RM6670、M55、M07上的交換單株不重複，證實了該基因位於第8染色體上，並且定位於分子標記M07和M13之間，如圖3a所示，分子標記引物M07對晚抽穗單株的擴增帶型，第20株是交換單株，如圖3b所示，分子標記引物M13對晚抽穗單株的擴增帶型，第10株是交換單株；結合圖4所示，物理距離約為1.6Mb。上述連鎖分析和初步定位過程，所採用的DNA提取方法和PCR反應條件分別為：A.用常規的CTAB法提取供體親本、受體親本和F2分離群體各單株的DNA；B.PCR的反應體系如下：PCR反應條件為：94℃變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃60s，擴增35個循環，最後72℃終延伸10min。DNA擴增產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，通過銀染顯色記錄擴增的DNA條帶。由上述過程可以看出利用這些與早抽穗主效QTLqHD8.3的分子標記可以有效地開展早抽穗QTL分子標記輔助選擇育種；同時可以利用大的分離群體，加快對早抽穗QTL的精細定位與圖位克隆。(四)F2:3株系後代篩選分析利用獲得的分子標記M07和M13，在F2:3株系後代中篩選了76個雜合單株構建F3定位群體，雜合單株分單株收穫種植，每個株系均出現了抽穗期表型的分離，且早抽穗和晚抽穗單株的分離比符合3:1的比例，其篩選準確率達到100％。說明利用qHD8.3新基因的分子標記M07和M13進行水稻抽穗期的標記輔助選擇是有效的。(五)結果分析上述結果表明，利用RM6670、M55、M07、M13和M15可對水稻早抽穗主效QTL進行分子標記，其對應的引物如表3：表3定位的引物及其序列實施例2分子標記鑑定方法以待鑑定水稻材料全基因組DNA為模板，利用以上所述的分子標記RM6670、M55、M07、M13和M15對應引物中的一對或多對進行PCR擴增，對擴增產物進行檢測。(一)用常規的CTAB法提取供體親本、受體親本和F2分離群體各單株的DNA；(二)PCR的反應體系如下：PCR反應條件為：94℃變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃60s，擴增35個循環，最後72℃終延伸10min。DNA擴增產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，通過銀染顯色記錄擴增的DNA條帶。(三)結果分析(1)採用分子標記RM6670引物進行擴增，若擴增出177bp的擴增片段，則表明有早抽穗主效QTL的存在，若能擴增出168bp的擴增片段，則表明有親本9311的擴增片段；(2)採用分子標記M55引物進行擴增，若擴增出177bp的擴增片段，則表明有早抽穗主效QTL的存在，若能擴增出169bp的擴增片段，則表明有親本9311的擴增片段；(3)採用分子標記M07引物進行擴增，若擴增出166bp的擴增片段，則表明有早抽穗主效QTL的存在，若能擴增出150bp的擴增片段，則表明有親本9311的擴增片段；(4)採用分子標記M13引物進行擴增，若擴增出43bp的擴增片段，則表明有早抽穗主效QTL的存在，若能擴增出52bp的擴增片段，則表明有親本9311的擴增片段；(5)採用分子標記M15引物進行擴增，若擴增出131bp的擴增片段，則表明有早抽穗主效QTL的存在，若能擴增出117bp的擴增片段，則表明有親本9311的擴增片段。基於上述5個分子標記來檢測水稻品種，可驗證是否含有早抽穗主效QTL的存在，可進行早抽穗水稻品種的選育，從而加快育種進度。當前第1頁1 2 3