一種甘木通黃酮類成分的檢測方法及應用的製作方法

2023-05-16 23:26:06 1

專利名稱：一種甘木通黃酮類成分的檢測方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥技術領域，具體涉及中藥、飲片、提取物及製劑中黃酮類成分的檢測技術，特別是涉及一種甘木通藥材提取物中黃酮類成分的檢測方法及應用。
背景技術：
甘木通(Clematis filamentosa Dunn)俗稱眼蛇藥，為毛茛科絲鐵線蓮屬植物，主要分布在廣東、廣西、海南、雲南等地，在粵北乳源山區有較為豐富的野生資源，對心血管疾病(冠心病、高血壓)有顯著療效。甘木通中黃酮類化合物是其有效成分之一。以甘木通為原料生產的「冠心康片」臨床治療冠心病心絞痛、高血壓等療效突出。 冠心康片用於肝經有熱、肝陽上亢、脈絡瘀阻所致之頭痛眩暈、胸痺心痛、肢體麻木等症，還適用於防治心血管疾病，特別是冠心病和高血壓的治療，同時具有用量少、藥效長、無副作用等優點。現有的甘木通中黃酮類成分的檢測方法有以蘆丁為對照品建立標準曲線，以 75%乙醇為溶劑，在90°C加熱回流提取甘木通莖、葉中總黃酮類成分，用紫外分光光度法在波長510nm處測定總黃酮含量。但是這種應用紫外分光光度法檢測甘木通中黃酮類成分的檢測方法專屬性較差，不能反映本藥材黃酮類具體成分的含量。

發明內容
本發明的一個目的在於填補現有甘木通黃酮類成分檢測技術的不足，提供一種新的甘木通黃酮類成分的檢測方法。是一種利用甘木通藥材、總黃酮提取物或製劑指紋圖譜進行檢測的方法，並通過確定科學的檢測保證藥材、提取物、製劑的質量更加安全、可靠。本發明的另一個目的是提供所述方法的應用。本發明的目的通過以下技術方案予以實現本發明提供一種甘木通黃酮類成分的檢測方法，以含山柰素的甲醇溶液為對照品溶液，採用高效液相色譜法對供試品溶液中甘木通黃酮類成分進行定性和/或定量分析； 所述對照品溶液中每ImL甲醇含5 110 μ g山柰素。所述檢測條件為採用填充劑為十八烷基矽烷鍵合矽膠的色譜柱，流動相為甲醇與水(或緩衝鹽溶液)、甲醇與酸水、或乙腈與水(或緩衝鹽溶液)或乙腈與酸水的混合物；等度或梯度洗脫； 流速0. 1 1. 5mL/min ；檢測波長200 400nm ；進樣量1 20 μ L ；採用黃酮類標準品為內標或外標，進行黃酮類成分含量測定。本發明進一步提供更為優選的檢測條件為。18(Φ4· 6mmX250mm, 5 μ m)色譜柱；流速:0. 1 1. 5mL/min，柱溫20 50°C ；檢測波長200 400nm ；進樣量:1 20 μ L ；流動相乙腈(A)-O. 冰乙酸水溶液(B)，採用梯度洗脫Α 相梯度0 15min，13% ；15 30min，13%— 17% ；30 50min，17%— 22% ； 50 60min，22%— 27% ；60 75min，27%— 37%。
優選的檢測波長為3^nm、2Mnm或370nm。具體地，本發明所述供試品溶液的製備方法包括以下幾種步驟(1)所述供試品溶液通過以下方法製備得到取過三號篩的待測藥材粉末 1 50. Og,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為30 80 %乙醇5 500mL， 稱定重量，超聲提取0. 5 3.證，放冷，再稱定重量，用體積比濃度為30 80%乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，重複提取1 5次，合併提取液，減壓濃縮至無醇味，用水稀釋至5 150mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 5 150mL萃取2 5次，石油醚液棄去；水層繼續用 5 150mL乙酸乙酯萃取2 5次，合併乙酸乙酯液並減壓蒸乾，殘渣加甲醇溶解並定容至 10 250mL,過0. 22 0. 45 μ m微孔濾膜即得。或者，步驟(1)所述供試品溶液通過以下方法製備得到取過三號篩的藥材粉末 1 50. 0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為30 80%乙醇5 500mL， 稱定重量，微波提取三次，第一次功率560 500w，提取時間10 20min ；放冷，再稱定重量，用體積比濃度為30 80 %乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，重複提取3次，第二次功率 500 400w，提取時間10 20min ；第三次功率400 350w，提取時間10 20min ；合併提取液，減壓濃縮至無醇味，用水稀釋至5 150mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 5 150mL 萃取2 5次，石油醚液棄去；水層繼續用5 150mL乙酸乙酯萃取2 5次，合併乙酸乙酯液並減壓蒸乾，殘渣加甲醇溶解並定容至10 250mL，過0. 22 0. 45 μ m微孔濾膜，即得。或者，步驟(1)所述供試品溶液通過以下方法製備得到取過三號篩的待測藥材粉末1 50. 0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為30 80%乙醇5 500mL，稱定重量，索氏回流提取0. 5 3.證，放冷，再稱定重量，用體積比濃度為30 80% 乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，重複提取1 5次，合併提取液，減壓濃縮至無醇味，用水稀釋至5 150mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 5 150mL萃取2 5次，石油醚液棄去；水層繼續用5 150mL乙酸乙酯萃取2 5次，合併乙酸乙酯液並減壓蒸乾，殘渣加甲醇溶解並定容至10 250mL,過0. 22 0. 45 μ m微孔濾膜，即得；或者，步驟(1)所述供試品溶液通過以下方法製備得到取過三號篩的藥材粉末 1 50. Og,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水5 500mL，稱定重量，加水煎煮兩次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，合併濾液，濃縮至適量，加入乙醇使含醇量達65 70%， 靜置，濾過，濾液濃縮至無醇味，用水稀釋至5 150mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 5 150mL萃取2 5次，石油醚液棄去；水層繼續用5 150mL乙酸乙酯萃取2 5次，合併乙酸乙酯液並減壓蒸乾，殘渣加甲醇溶解並定容至10 250mL，過0. 22 0. 45 μ m微孔濾膜，即得。通過有效性評價，本發明所述檢測方法的專屬性、準確度、精密度、重複性、穩定性、測定範圍以及耐用性較好。本發明所述的檢測方法，其中優選在326nm、2Mnm或370nm波長下山奈素對照的色譜圖的保留時間與峰面積，再使用matlab 7. 1進行編程，將不同波長下的色譜圖中相同組分按最大峰面積覆蓋融合。本發明所述的檢測方法，可應用於檢測提取方法相同或相近的含有甘木通組成的任何一種提取物、製劑、飲片或藥材；所述製劑包括顆粒劑、膠囊、片劑、丸劑、軟膠囊劑、滴丸劑等。與現有技術相比較，本發明具有以下有益效果(1)本發明建立了高效液相指紋圖譜檢測黃酮類成分含量的方法，與現有檢測方法相比較，專屬性良好，能準確反映甘木通黃酮類具體某成分的含量。(2)本發明首次採用高效液相色譜法對甘木通中黃酮類成分中的12個共有峰進行了分離，並以山奈素為內標，建立了甘木通中黃酮類成分定性以及定量分析的科學方案， 提高了藥材、製劑、提取物的檢測標準，從而有效確保了含甘木通的品種均一、穩定、有效、 可控，保證了工藝的規範化和質量的穩定一致。(3)本發明提供的檢測方法，其優點是簡便、穩定、精密度高、重現性好、易於掌握， 能從色譜的整體特徵面貌上把握甘木通藥材、飲片、其提取物和製劑的品種和質量情況。


圖1波長下對照品山奈素的色圖譜；圖2326nm波長下樣品的色圖譜；圖3326nm波長下樣品中添加內標山奈素的色圖譜；圖4326nm波長下甘木通總黃酮的色圖譜；圖5指紋圖譜各共有指紋峰；圖6254nm波長下甘木通總黃酮的色圖譜；圖7370nm波長下甘木通總黃酮的色圖譜。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例詳細說明本發明。實施例1Waters 600高效液相色譜儀，紫外檢測器、柱溫箱；色譜柱用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑=XBridge Shield RP18 6_X 250_，5 μ m)。乙腈(色譜純，美國默克公司)，超純水；其它試劑為分析純。1、供試品溶液的製備取甘木通藥材粉末(過三號篩)5. 0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為80 %的乙醇50mL，稱定重量，加熱回流1. 5h，放冷，再稱定重量，用80%乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，用水稀釋至15mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 15mL萃取2次，石油醚液棄去；水層繼續用15mL乙酸乙酯萃取 2次，合併乙酸乙酯液並減壓蒸乾，殘渣加甲醇溶解並定容至IOOmL,過0. 45 μ m微孔濾膜， 即得供試品溶液。2、內標溶液的製備精密稱取山柰素對照品適量，用甲醇配製成每ImL含11. 2μ g 的內標溶液。3、進行高效液相色譜測定參照中國藥典2010版一部附錄VI D進行測定。流動相梯度流動相乙腈(A)-O. 冰乙酸水溶液(B)，採用梯度洗脫A相梯度:0 15min， 13% ；15 30min，13%— 17% ；30 50min，17%— 22% ；50 60min，22%— 27% ；60 75min, 27%- 37% ；流速1. OmL/min ；檢測波長326nm ；進樣量20 μ L，理論塔板數計算，應不低於3000 ；
4、方法學考察，其中包括專屬性、準確度、精密度、重複性、穩定性及線形範圍。4. 1內標物的選擇用內標溶液、樣品溶液，按照上述色譜條件測試，結果樣品HPLC圖譜中在與內標液山奈素HPLC圖譜中相同保留時間處未出現色譜峰，樣品中加入內標液HPLC圖，樣品中與山奈素相鄰的峰達到很好分離，見附圖1 5所示。如附圖5所示，有13個共有峰，各特徵峰以13號峰(RT = 72. 59)為參照峰，相對保留時間分別為0.067,0. 126,0. 135,0. 204， 0. 314,0. 361，0. 420,0. 436,0. 578,0. 589,0. 845，1. 00。在 326nm 波長下測得山奈素的保留時間是72. 59，峰面積分別是524684，樣品中對應的峰是13號。採用相同的方法分別在 254nm和370nm波長下檢測甘木通總黃酮，檢測得到的色圖譜見附圖6和附圖7所示。附圖中橫坐標代表出峰時間(分鐘)，縱坐標代表峰的高度。4. 2內標溶液線性關係考察精密稱取山奈素對照品適量，加甲醇製成每Iml含11. 2 μ g的溶液，精密吸取2、4、 8、12、16、20 μ 1，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以山奈素峰面積值為Y，進樣量為χ( μ g)，進行線性回歸，得線性方程=Y = 2328. 4X-4947. l，r = 0. 9999。結果表明，山柰素在22. 4 22^g的範圍內呈良好線性關係。見表1所示。表1內標物線性關係實驗數據
進樣體積(μ 1)248121620進樣量(μ g)22. 444. 889. 6134. 4179. 2224峰面積49556991062001453092694108275182564. 3樣品與內標物峰面積比值與樣品含量線性關係考察取甘木通藥材粉末(過三號篩)5. Og,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為80%的乙醇50mL，稱定重量，加熱回流1. 5h，放冷，再稱定重量，用80 %乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，用水稀釋至15mL，每次加入石油醚(60 900C ) 15mL萃取2次，石油醚液棄去；水層繼續用15mL乙酸乙酯萃取2次，合併乙酸乙酯液並減壓蒸乾，殘渣加甲醇溶解並定容至25mL，分別精密量取5、4、3、2、ImL置IOmL量瓶中，加甲醇至刻度，過0. 45 μ m微孔濾膜，得各供試樣品溶液。各供試樣品分別與濃度為11. 2 μ g/mL的內標溶液按1:1(體積比)均勻混合， 按照測定方法進樣，計算樣品中12號峰與13號峰(山奈素)的面積比值，以及供試樣品取樣量(mL)/10的比值，對兩個比值進行線性回歸，得回歸方程為Y = 1. 9056Χ+0. 0066 (r = 0. 9999)；實驗表明樣品中黃酮類成分以12號峰計，與內標物山奈素的峰面積比與樣品中 12號峰含量呈良好的線性關係。4. 4精密度試驗取內標溶液連續測定六次，結果6次測定圖譜中對照品的峰保留時間和峰面積的 RSD均小於2%，證明儀器精密度良好。表2對照品HPLC精密度數據表
權利要求
1.一種甘木通黃酮類成分的檢測方法，其特徵在於是以含山柰素的甲醇溶液為對照品溶液，採用高效液相色譜法對供試品溶液中甘木通黃酮類成分進行定性和/或定量分析； 所述檢測條件為C18 (φ 4. 6 讓 X25(toim，5ym)色譜柱；流速0. 1 1. 5mL/min，柱溫20 50 °C ；檢測波長200 400nm;進樣量1 20yL;流動相乙腈(A)-O. 冰乙酸水溶液(B)，採用梯度洗脫A 相梯度0 15min，13% ；15 30min，13%— 17% ；30 50min，17%— 22% ； 50 60min，22%— 27% ；60 75min，27%— 37% ；所述對照品溶液是每ImL甲醇含5 110 μ g山柰素的溶液。
2.根據權利要求1所述的甘木通黃酮類成分的檢測方法，其特徵在於步驟(1)所述供試品溶液通過以下方法製備得到取待測藥材粉末，經加水煎煮或乙醇提取得到提取液，再經石油醚萃取後取水層，水層用乙酸乙酯萃取得到的萃取液蒸乾而得殘渣，殘渣加甲醇溶解並定容後過微孔濾膜，製得供試品溶液。
3.根據權利要求2所述的甘木通黃酮類成分的檢測方法，其特徵在於所述乙醇提取是索氏回流提取、超聲提取或微波提取。
4.根據權利要求1所述的甘木通黃酮類成分的檢測方法，其特徵在於所述檢測波長為 326nm>254nm^ 370nmo
5.一種權利要求1、2、3或4所述檢測方法的應用，其特徵在於應用於檢測提取方法相同或相近的含有甘木通組成的提取物、製劑、飲片或藥材中黃酮類成分。
6.根據權利要求5所述檢測方法的應用，其特徵在於所述製劑為顆粒劑、膠囊、片劑、 丸劑、軟膠囊劑或滴丸劑。
全文摘要
本發明公開了一種甘木通黃酮類成分的檢測方法及應用。本發明以含山柰素的甲醇溶液為對照品溶液，採用高效液相色譜法對配製好供試品溶液中甘木通黃酮類成分進行定性和/或定量分析。本發明可應用於檢測提取方法相同或相近的含有甘木通組成的提取物、製劑、飲片或藥材中黃酮類成分的檢測，陰性無幹擾，具有較強的專屬性和良好的重現性，可有效確保含甘木通的製劑品種均一、穩定、有效、可控，保證了工藝的規範化和質量的穩定一致。
文檔編號G01N30/88GK102426207SQ201110350669
公開日2012年4月25日 申請日期2011年11月8日 優先權日2011年11月8日
發明者鄧亞利 申請人:華南農業大學