促紅細胞生成素在中風康復中的用途的製作方法

2023-05-16 23:08:51 1

專利名稱：促紅細胞生成素在中風康復中的用途的製作方法
技術領域：
本發明提供了不同劑量促紅細胞生成素(EPO)的給藥方案以促進局部缺血性發作如中風後的康復。
背景技術：
術語中風是指由於顱內或顱外血管的阻塞或破裂而引起腦功能的突發性損傷。其通常是在腦內或通往大腦的一根或多根血管破裂或被血栓、粥樣硬化斑塊或某些其它顆粒阻塞時發生。結果，導致大腦神經細胞缺氧並在數分鐘內死亡。死亡的腦細胞不能再生並被充滿液體的腔體所替代，這種被稱為梗塞。在中風中，一些腦細胞不可逆並迅速的死亡。其它細胞例如缺血灶周圍的那些，也可能遭受急性損傷並在數小時內處於免疫缺乏狀態(Compromised State)。本領域還可知，腦損傷在最初的局部缺血性發作後還可能持續數天。
由於病人通常在中風發作後不能迅速到達急診室，需要甚至在有時發作後的首次給藥時也有效的新療法。
概述本發明提供了局部缺血性發作後EPO的給藥方案以及對發作患者的治療方法。
本發明的一個實施方案就是用以促進局部缺血性發作後康復的促紅細胞生成素的給藥方案，包括給予所需患者治療有效量的EPO，其中在局部缺血性發作後的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量EPO，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量EPO。
本發明的另一個實施方案是治療局部缺血性發作患者的方法，包括給予所述患者治療有效量的EPO，其中在局部缺血性發作後的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量EPO，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量EPO。
在進一步的實施方案中，本發明提供了一種促進患者局部缺血性發作後功能恢復的方法，包括給予所述患者治療有效量的EPO，其中在局部缺血性發作後的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量EPO，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量EPO。
在另外一個方面，本發明還涉及在減少局部缺血性發作6小時之內最初接觸EPO的患者的梗塞面積的方法，包括給予患者每劑量大約1500IU/kg至大約4500IU/kg的EPO，其中在最初接觸EPO後的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量EPO，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量EPO。
在進一步的方面中，本發明還涉及抑制患者局部缺血性發作後CNS中的細胞凋亡或炎症，包括給予所述患者治療有效量的EPO，其中在局部缺血性發作後的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量EPO，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量EPO。
在本發明的某些優選實施方案中，在局部缺血性發作後的大約24小時給予第一劑量EPO。在本發明的另外一些優選實施方案中，在第一劑量後的大約24小時給予第二劑量。優選，在局部缺血性發作後的大約24小時給予第一劑量EPO，在局部缺血性發作後的大約48小時給予第二劑量。進一步而言，可以在局部缺血性發作後的大約20至大約60小時之內給予第三劑量EPO。優選，在第二劑量後的大約8至24小時之內給予第三劑量EPO。
本發明優選的實施方案包括給藥方案和治療方法，其中EPO的每次給藥包括皮下、肌內、靜脈或腹腔內注射EPO。
本發明優選的實施方案還包括給藥方案和治療方法，其中EPO的每次給藥劑量選自大約500IU/kg至大約10000IU/kg。在一個實施方案中，特別是減少局部缺血性發作6小時之內最初接觸EPO的患者的梗塞面積中，EPO的每次給藥劑量為大約1500IU/kg至大約4500IU/kg。優選，EPO的每次給藥劑量選自大約1800IU/kg至大約4000IU/kg。更優選，EPO的每次給藥劑量選自大約2000IU/kg至大約3000IU/kg。最優選，EPO的每次給藥劑量為大約2500IU/kg。在另一實施方案中，EPO的每次給藥劑量選自大約2500IU/kg至大約5000IU/kg。優選，至少一次EPO的給藥劑量為大約2500IU/kg。更優選，EPO的每次給藥劑量為大約2500IU/kg。
在本發明更優選的實施方案中，局部缺血性發作是中風。特別是，局部缺血性發作是CNS損傷如病灶性局部缺血性中風或急性局部缺血性中風。
本發明的實施方案進一步包括給藥方案和治療方法，其中促紅細胞生成素是長效EPO。
附圖概述所附附示了本發明的一些方面。附圖概述如下附

圖1顯示了單天給藥對梗塞面積或功能性結果無效。方框-須線(Box-whisker)示意圖(A)和(B)表示了在發生阻塞時以及在阻塞後1小時給藥右啡烷和EPO，其與用載體治療的動物相比，對於減少7天(A)梗塞面積或改善(B)功能性結果無效；附圖2顯示了多天給藥促紅細胞生成素能減少梗塞面積並改善功能性結果。遭受中腦動脈閉塞(MCAO)的鼠在阻塞後0小時、24小時和48小時用EPO進行治療，其與用載體進行治療的動物相比，圖(A)顯示在2500IU/kg，梗塞面積有顯著的減少，和圖(B)顯示在2500和5000IU/kg，功能性結果有顯著的改善(*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001)；附圖3顯示了EPO的延緩性多天給藥改善功能性結果而不依賴於梗塞面積減少。在MCAO後6小時、24小時和48小時給藥EPO，是2500或5000IU/kg，對(A)梗塞面積都沒有影響；然而(B)這兩個劑量水平對功能性結果都有顯著的改善(*p＜0.05；**p＜0.01)；附圖4顯示了在阻塞一開始至晚至24小時給藥EPO均能改善功能性結果。在阻塞後推遲EPO的首劑量整整24小時，隨後在48小時給予第二劑量的給藥方案，在(A)減少梗塞面積上無效，但(B)具有顯著改善的功能性結果(*p＜0.01)。
發明詳述下述本發明實施例的目的不在於詳盡描述或將本發明限至如下詳述中所公開的具體實施例中。然而，所述的實施例能幫助本領域技術人員理解本發明原理和實踐。如果下文中沒有特別提及的話，以下說明書中參考的每份專利、公開的專利申請和公開出版物均全部引入作為參考文獻以用於任何和所有目的。
本發明提供了促進局部缺血性發作後康復的促紅細胞生成素的給藥方案，包括給予所需患者治療有效量的EPO，其中在局部缺血性發作後大約8至大約26小時內給予第一劑量EPO，隨後在第一劑量後大約8至大約26小時內給予第二劑量EPO。
如本文中所使用的，″局部缺血性發作″在患者中樞神經系統(CNS)中的血流和/或氧輸送暫時性或永久性減少時發生，並可能導致損傷如非灌注區域的壞死或梗塞。局部缺血性發作包括但不限於，急性CNS損傷如中風、外傷如外傷性腦或脊髓損傷、短暫腦缺血發作、梗塞、缺血-再灌注損傷、視網膜損害、及由於器官、組織或細胞移植或其它外科手術造成的局部缺血。具體而言，對於本發明的目的，局部缺血性發作是腦局部缺血性發作，尤其是顱血流的中斷。更具體而言，局部缺血性發作是中風，包括但不限於病灶性局部缺血性中風或急性局部缺血性中風。
如本文中所使用的，缺血-再灌注是指流至器官如大腦的血流被中斷，和隨後通常突然性的血流恢復。
來自急性局部缺血性中風的損傷是動態的。損傷在開始發作後將持續數天。多種機制導致神經細胞和支持細胞死亡區域的擴大，包括離子平衡的喪失、自由基損害、興奮性中毒、細胞凋亡和炎症(1)。在最初損傷後的幾星期至幾個月內重建和重塑機制是有效的，目的在於對已經發生的損害補償至某一程度(2)。所有造成損害和促進康復的事件提供了治療介入的機會。所需的治療是一種能阻斷引發細胞死亡的機制或增強康復或理論上兩者均可的方法。可能的治療候選者是屬於天然造血細胞因子促紅細胞生成素系列的具有紅細胞生成活性的分子。
近來，促紅細胞生成素由於其在非造血系統中的效果包括在神經系統(4)中的功能已經引起了相當的注意。當促紅細胞生成素受體被局限於神經元亞型以及星形膠質細胞和小膠質細胞(7，8)時，通過星形膠質細胞對缺氧(5，6)響應而在中樞神經系統(CNS)中局部產生並釋放促紅細胞生成素。這些細胞類型中促紅細胞生成素的功能仍不清楚，但它已經顯示出能阻斷體外編程性細胞死亡，由許多不同的刺激素包括穀氨酸鹽、缺氧(9)和血清撤除(10)誘導，表明其能通過阻斷細胞凋亡(11)促進細胞存活。除了促紅細胞生成素的神經保護作用，其被報導還可用於調節炎症(12)，即另一個中風治療的潛在靶點。進一步而言，促紅細胞生成素已經顯示出能減少動物CNS損傷模型，包括中風(14)、脊髓損傷(15)、外傷性腦損傷(14)和視網膜損害(16)模型中的損害，且近來顯示還具有缺血預適應(6)的保護效應。
促紅細胞生成素在CNS中的功能已經引起了相當的注意，特別歸功於其被報導的神經保護作用。促紅細胞生成素限制CNS損傷模型中的有關損害的能力與表明其具有在疾病過程中起到某些機制的潛力的數據相結合，使得促紅細胞生成素成為用於治療神經系統急性疾病包括中風的有吸引力的候選者。然而促紅細胞生成素引發這些保護效應的確切機制尚不清楚，促紅細胞生成素減少中風(10)、脊髓損傷(15)、和視網膜損傷(16)模型中的細胞凋亡的數據表明其阻斷細胞凋亡的能力是關鍵功能。假設細胞凋亡在最初局部缺血性發作後能持續數天，在損傷後的數天之內連續給藥促紅細胞生成素是必需的，以最佳化治療效果。然而迄今為止，沒有從事於該問題的臨床前研究，據報導在評估促紅細胞生成素治療局部缺血性中風(19)的導向性臨床研究中，促紅細胞生成素持續給藥超過數天的結果呈陽性。
自然或天然的促紅細胞生成素是能通過調節紅系前體細胞(3)的分化、增殖和存活來控制紅細胞生成的30-kDa糖蛋白。如本文中所使用及在權利要求中所定義的，術語″EPO″應包括那些通過天然促紅細胞生成素受體介導具有刺激紅細胞生成能力的多肽和蛋白。術語″EPO″包括自然或天然的促紅細胞生成素以及重組人促紅細胞生成素(r-HuEPO)。還包括在術語EPO範圍之內的有促紅細胞生成素類似物、促紅細胞生成素同種型、擬促紅細胞生成素、促紅細胞生成素片斷、促紅細胞生成素混和蛋白、融合蛋白寡聚體和上述多聚體、上述同系物、上述糖基化模式變體、上述擬肽和突變蛋白、以及進一步包括不管是通過合成或工業製造方法，包括但不限於，重組(無論是產自cDNA還是基因組DNA)、合成、轉基因和基因活性方法獲得的那些，以及進一步包括含上述列舉物小修飾體的那些促紅細胞生成素分子。設計和合成如本領域普通技術人員公知的擬肽的方法，記載於美國專利Nos.4,833,092、4,859,765中；4,853,871和4,863,857所公開的內容在此均全部引入作為參考並用於所有目的。另外，具有紅細胞生成活性的多肽和蛋白、具有促進紅細胞生成能力的小分子也包括在術語EPO的範圍之內，例如，具有促紅細胞生成素活性的化合物，如通過上遊激活反應刺激促紅細胞生成素產生的分子。
特別優選的EPO分子是能刺激哺乳動物紅細胞生成的那些。促紅細胞生成素的具體實例包括α-紅細胞生成素(EPREX、ERYPO、PROCRIT)、新紅細胞生成刺激蛋白(NESPTM、ARANESPTM和α-darbepoetin)如專利申請EP640619中記載的重組人促紅細胞生成素(Epoetin)的高糖基化類似物。其它預期的EPO分子也在本發明範圍之內包括人促紅細胞生成素類似物(如記載於國際專利申請WO 99/66054中的人血清白蛋白融合蛋白)、記載於國際專利申請WO 99/38890中的促紅細胞生成素突變體、產自記載於美國專利5,688,679中的人促紅細胞生成素基因ApaI限制性片斷的ω-促紅細胞生成素、記載於國際專利申請WO 99/11781和EP1064951中的經改變的糖基化人促紅細胞生成素、記載於WO 98/05363、WO 01/76640或美國專利5,643,575中的PEG結合的促紅細胞生成素類似物。經修飾用於內源性人促紅細胞生成素表達的細胞系的具體實例記載於國際專利申請WO 99/05268和WO 94/12650中。通常優選的EPO形式是純化的重組人EPO(r-HuEPO)，普遍以商標EPREX、ERYPO、PROCRIT或ARANESPTM製造和銷售。本段中所有提及的每份專利和公開的專利申請的全部內容均在此引入作為參考並用於任何和所有目的。
EPO的長效形式也是被預期的並可能優選成為本發明某些實施方案中用作給藥區段中第二和第三次接觸給藥。如本文中所使用的，″長效EPO″包括具有增長的循環半衰期的EPO緩釋組合物和製劑，典型的通過修飾如減少免疫原性和清除率獲得，並且EPO被包裹在高分子微球中。″長效EPO″的實例包括但不限於，記載於PCT公開WO2002049673(Burg et al.)中的具有聚乙二醇(PEG)的促紅細胞生成素共軛物，記載於PCT公開WO 02/32957(Nakamura et al.)中的PEG-修飾的EPO，記載於PCT公開WO 94/28024(Chyi etal.)中的具有紅細胞生成活性和具有至少一種與非抗原性聚合物共價連接的經氧化的碳水化物部分的糖蛋白共軛物和其它使用SCM-PEG、SPA-PEG和SBA-PEG製得的PEG-EPO。這些公開的專利申請的全部內容均在此全部引入作為參考並用於所有目的。
優選的聚乙二醇部分是甲氧基聚乙二醇(mPEG)部分。該部分優選使用甲氧基聚乙二醇類的琥珀醯亞胺酯衍生物加入。優選的甲氧基聚乙二醇類的琥珀醯亞胺酯衍生物的實例包括下式的羧甲基化聚乙二醇(SCM-PEG)的琥珀醯亞胺酯， (R是C1-8烷基；n是整數)SCM-PEG下式的聚(乙二醇)丙酸(SPA-PEG)的琥珀醯亞胺酯衍生物，其中R是C1-8烷基；n是整數，(R-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2-CO-OSu)；和下式的聚(乙二醇)丁酸(SPA-PEG)的琥珀醯亞胺酯衍生物，其中R是C1-8烷基；n是整數(R-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2CH2-CO-OSu)。
製備SCM-PEG、SPA-PEG和SBA-PEG的方法是本領域公知的。例如，授予Harris等的美國專利No.5672662記載的PEG酸的活性酯類和具有單個丙酸或丁酸部分而沒有其它酯鏈的相關聚合物。SCM-PEG的製備記載於，如Veronese等的(1989)，Journal ofControlled Release，110145-54中。
SPA-PEG包括mPEG-SPA(甲氧基-PEG-琥珀醯亞胺丙酸酯)。SBA-PEG包括mPEG-SBA(甲氧基-PEG-琥珀醯亞胺丁酸酯)。活性聚合物如SBA-PEG和SPA-PEG，均商業可得並可得自如ShearwaterPolymers，Inc.，Huntsville，Alabama，U.S.A。
SCM-PEG(R-(OCH2CH2)n-O-CH2-CO-OSu；R是C1-8烷基；n是整數)包括羧甲基化的PEG(mPEG-SCM)的甲氧基-PEG-琥珀醯亞胺酯。根據Greenwald et al.的報導，SCM-PEG″與蛋白反應可形成穩定的醯胺，但也報導了tl/2水解[Shearwater Polymers，Huntsville，AL，Jan 1996 catalog，p 46]在pH8時＜1分鐘，從而最小化了其在含水溶液中用於蛋白修飾的有效性...″(Bioconjugate Chem.，7(6)，638-641，1996)。
現在，SCM-PEG通常可以由如Delmar Chemicals，Inc，Quebec，Canada合成。
SCM-PEG、SPA-PEG和SBA-PEG主要與賴氨酸的伯氨基和N-氨基末端反應。SCM-PEG5K、SPA-PEG和SBA-PEG5K分別與EPO的反應顯示如下，其中OSu代表n-羥基琥珀醯亞胺，和m是1-4，n是整數
為了研究促紅細胞生成素可能對於CNS的急性損傷包括中風的治療是有效的，並且還可能抑制對遲發神經毒性如細胞凋亡和炎症的響應過程的假說，申請人試驗了一些給藥方案，目的在於最佳化促紅細胞生成素在病灶性局部缺血性中風中的活性。申請人在本文中顯示了在數天內倍劑量給藥能使患永久性中腦動脈閉塞的鼠的梗塞面積減少並改善功能性結果。另外，促紅細胞生成素的延緩給藥，甚至是在阻塞後的大約24小時給藥，也能改善功能性結果而不依賴於梗塞面積的減少。申請人已經發現促紅細胞生成素以2500IU/kg的多天給藥方案對於改善遭受MCAO鼠的結果是最有效的。在這些研究中，所發現的梗塞面積的減少相對小些(30％)，由於壞死被認為是造成病灶性局部缺血性中風(20)的永久性模型中梗塞量的細胞死亡的基本方法，因此不必驚訝於具有抗細胞凋亡作用機制的分子。
因而，本發明提供了一種治療患者局部缺血性發作的方法，包括給予所需患者治療有效量的促紅細胞生成素，其中在局部缺血性發作後的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量促紅細胞生成素，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量促紅細胞生成素。優選，對局部缺血性發作患者的治療包括促進局部缺血性發作造成的任何後果如神經學損害或梗塞的康復。在一個方面，局部缺血性發作的康復通過梗塞面積的減少來表示。在另一個方面，局部缺血性發作的康復通過患者功能性結果的改善來表示，如來自由行為評分系統評估的一個或多個分數的改善。本發明所提供的治療結果可通過使用本領域公知的評定方法進行評估，包括但不限於醫學成像系統如核磁共振成像(MRI)、CTA(計算機斷層血管造影術)和CT掃描(計算機斷層攝影術)、神經學試驗、須觸試驗和足錯試驗(19)。
本發明還提供了抑制患者局部缺血性發作後CNS中細胞凋亡或炎症的方法，包括給予所需患者治療有效量的促紅細胞生成素，其中在局部缺血性發作後的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量促紅細胞生成素，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量促紅細胞生成素。
結果證明促紅細胞生成素的早期給藥是必需的，以獲得梗塞面積的減少。如果治療在阻塞後6小時開始的話就無效了。特別是，在阻塞一開始、24小時和48小時時以2500IU/kg的劑量給予多天劑量的促紅細胞生成素會導致減少30％的梗塞面積，而這些沒有在5000IU/kg或1250IU/kg的劑量水平上發現。因此，本發明提供了一種減少在局部缺血性發作6小時之內最初接觸促紅細胞生成素的患者的梗塞面積的方法，包括給予所述患者每劑量在大約1500IU/kg至大約4500IU/kg之內的促紅細胞生成素，其中在最初接觸促紅細胞生成素的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量促紅細胞生成素，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量促紅細胞生成素。
如本文中所使用的，術語″接觸″是指單次劑量、重複的個人劑量或在單次給藥後儘可能相對持續給藥，如長效EPO，用法如含EPO的透皮貼劑或EPO植入物的植入。
另外，申請人現在驚奇的發現當在損傷後大約24小時時給藥EPO，對遭受永久性MCAO的鼠有顯著的功能性改善。因而，本發明進一步提供了一種促進患者局部缺血性發作後功能康復的方法，包括給予所述患者治療有效量的EPO，其中在局部缺血性發作後的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量EPO，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量EPO。
在本發明的一個相關實施例中，EPO能以第三劑量給藥患者。第三劑量優選局部缺血性發作後的大約20小時至大約60小時之內給予。其中第三劑量可以在第二劑量後的大約8小時至大約24小時之內給予。
如本文中使用的，術語″功能恢復″是指患者在局部缺血性發作後的行為改善。動物的功能恢復可以被評估，例如，使用經改良的Hernandez-Schallert足錯試驗(18)，其中將動物放置在配有0.5cm直徑金屬柱，柱間隔為2cm的網格上，觀察2分鐘，在此期間記錄它們前後肢落下通過間隔的次數。人體的功能恢復可以通過用於測量基本神經系統功能如運動強度、感覺和協調，認知功能如記憶、語言和方向辨別能力，和功能性能力如基本的日常生活自理能力和儀器操作能力的儀器來評估。基本神經系統功能的恢復可用儀器如NIH strokeScale(NIHSS)(31)測量，認知功能的恢復可以通過神經心理測驗如Boston命令試驗、Trail-making試驗和California語言學習試驗來測量，日常生活自理能力可以通過儀器如ADCS/ADL(Alzheimer′s病臨床研究/日常生活自理能力)測量器或Bristol日常生活自理能力測量器來測量，所有試驗在本領域均是公知的。
如本文中所使用的延緩性給藥的示例，不會導致梗塞面積的減少。對於該發現的一種可能性解釋就是TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色法不能精確的表示梗塞區域。為了證明這種可能性，對代表性動物切片以進行一種更廣泛的形態學分析方法與TTC分析法相比較。在TTC染色邊緣內沒有檢測到完整的神經元(數據顯示無)，從而表明該現象對我們的觀察是不負責任的。因而，通過抑制遠離梗塞區的區域內延緩性細胞凋亡或可能通過增強內源性重建或重塑發生，EPO的延緩性給藥改善了功能而不依賴於梗塞區域面積的減少。
如上提及的，細胞凋亡可能在局部缺血性損傷後持續發生數天。延緩性細胞凋亡發生在局部缺血性半影中，並導致最終的梗塞量(21，22)。其還發生在遠離梗塞區的區域內，最可能是由於供給神經元的營養缺失因而缺乏給梗塞區域的關鍵投影。由於EPO已經顯示出對神經元總體(10，23)是有營養的，對於延緩性EPO給藥的可能解釋就是阻止解剖學上位於距梗塞區域某段距離的神經元的延緩性細胞凋亡。這些神經元總體的不足可用於解釋我們行為評估中所觀察到的功能性行為的保護作用。
不能排除另外一種解釋，即EPO通過支持所述重建和重塑機制如神經突生長、突觸形成、突觸強化或暴露而增強了功能恢復過程。這種功能中的改善早至7天時就已經發現而非新長途功能連接的建立，然而兩種報導表明至少一種可塑性的開端通過7天就已顯而易見了。Kawamate et al.(24)檢查了病灶型局部缺血性中風的鼠模型中基本成纖維細胞生長因子(bFGF)的效應和Stroemer et al.(25)查看了在類似模型中的d-苯丙胺治療，觀察到用藥物治療在功能性行為中有改善但並不伴隨梗塞面積的減少。值得注意的是，在這些研究中雖然對動物的觀察達兩個月，然而通過7天行為改善就已經是顯著的了。
免疫組織化學分析顯示了這些研究中神經突萌發增強的證據，其決定於生長相關蛋白43(GAP43)表達的增加，在阻塞後的第3天達到最高。之前EPO已經顯示出促進神經突萌發(26)。收集這些數據，表明在損傷後的最初幾天內某些修復過程被抑制，並且EPO可以作用於這些早期過程中以增強功能恢復。其他的組織再生過程如暴露或突觸強化能在相當短的時期內發生，但是EPO對這些事件的影響還沒有顯現。
本領域普通技術人員能容易的決定不同情況下給藥的適宜量和方法。任何給藥劑量段的任何具體接觸量中EPO的給藥量是沒有限制的，已經證明EPO的給藥只要基本上沒有毒性效應，每次接觸、劑量段或多天給藥方案中EPO的任何量都可以給藥。也就是說，要是不用於其他的目的就不必要對其進行限制，常規治療方針表明患者接受每劑量治療有效量EPO為大約500IU/kg至大約10000IU/kg。優選，患者接受每劑量EPO量為大約1250IU/kg至大約5000IU/kg。更優選，患者接受每劑量EPO量為大約2500IU/kg。如上述提及的，EPO的給藥可以以任何本領域已知的或新發展的給藥方式。
本發明期望EPO的多種給藥途徑可用於本發明的實踐中。優選，每劑量EPO可以以所期望的使患者儘可能快接觸EPO的方式來給藥。也就是說，期望多種給藥途徑，包括但不限於靜脈給藥、皮下給藥、肌內或腹腔內給藥。就口服製劑的有效性來講，所述的給藥途徑也是值得考慮的而且特別適於本文中所記載的第二次或隨後的EPO給藥。
對受益於給藥方案的患者不作特別的限制，可以包括人和動物患者，優選哺乳動物患者。
如下的實施例用於舉例說明本發明，但不能解釋為對它的限制。通過參考隨後所列的數據和例子可以更好的理解本發明，但是本領域技術人員能容易的理解它們僅僅是作為本發明的例證，完整的描述記載於它們隨後的權利要求中。
實施例1材料和方法動物和MCAO外科手術操作中所用的動物經Johnson Johnson Institutional AnimalCare和Use Committee認可。體重在290g和320g之間的雄性斯普拉-道來氏(Sprague-Dawley)大鼠(Charles River Laboratories，Raleigh，NC)被分別關在溫度可控的環境之內，經過12小時(6:00-18:00)光的明暗循環，並給予食物和水ad libidum。用2.5％異氟烷麻醉動物，並使其體溫維持在37℃。根據Zimmerman etal.(17)中所記載的進行永久性MCAO。簡單的說，在腹側前開個切口使左右頸總動脈(CCA)直觀可見。使用4-0結紮絲線對右CCA進行永久性阻塞。進行開顱手術，在前1mm和側3-4mm形成卵圓孔以看見右大腦中動脈(MCA)。隨後，通過燒灼豆紋動脈的遠端將MCA永久性阻塞。隨後使用動脈瘤夾將左CCA短暫性阻塞1小時。在阻塞後，用外科縫合線將切口縫合，將布比卡因(0.25％)塗於切口部位。在加溫燈下，動物從麻醉中甦醒。
24小時後，用神經學試驗、須觸試驗和足錯試驗對鼠進行評估。如表1中所示，在阻塞後對遭受MCAO的鼠的損傷嚴重度評估24小時。完成三種試驗神經學評估、須觸試驗和足錯試驗(19)。得分超出預定參數的鼠被判定具有太輕或太嚴重的缺陷，並被排除進行進一步的分析。神經學得分為0或須觸得分≥1和足錯得分≤2(無損傷)的動物或神經學得分≥2(嚴重損傷)的動物被排除進行進一步的分析。
7天後分析動物的梗塞面積和功能性結果。
表1.用於評估損傷的行為評分系統

藥物和給藥將酒石酸右啡烷(Sigma Chemicals)溶於濃度為25mg/ml的EPO載體中(4.38mg/ml NaCl，1.lmg/ml NaH2PO4，1.6mg/ml Na2HPO4，5.0mg/ml甘氨酸，0.3mg/ml溶於蒸餾水中的Tween80，Ph6.9)。在載體溶液中將重組人促紅細胞生成素(Epoetin alfa)稀釋至最終濃度。所有藥物均通過三種給藥方案之一以1ml/kg的量由尾靜脈靜脈給藥(i.v.)1)單天給藥方案-在左CCA阻塞之前(0小時)迅速給藥載體、右啡烷(25mg/kg)或EPO(5000IU/kg)，隨後在1小時後在血流恢復後迅速給予第二劑量。
2)多天給藥方案-在0小時給藥載體或EPO(5000IU/kg，2500IU/kg或1250IU/kg)，在之後的24小時和48小時給予隨後的劑量。
3)延緩性多天給藥方案-在阻塞後6小時、24小時和48小時給藥載體或EPO(5000IU/kg或2500IU/kg)，或在阻塞後24小時或48小時給藥。
梗塞面積的測定7天後將動物處死，將大腦移出並置於冰凍PBS中。使用腦基質(Kent Scientific)將大腦切成2mm厚的部分，隨後用2％2，3，5-氯化三苯四唑染色，腦部分用與立體顯微鏡相連的CCD照相機成像，用計算機輔助設備測定梗塞面積。將所有部分的梗塞量相結合用以得到絕對梗塞量。還測定了相對梗塞量(絕對梗塞量/腦半球總量)。
行為分析使用經改良的Hernandez-Schallert足錯試驗(18)評估動物的功能康復。在該試驗中，將動物放置在配有0.5cm直徑金屬柱，柱間隔為2cm的網格上。對動物觀察2分鐘，記錄它們前後肢落入間隔的次數。
統計分析使用Kruskal-Walis試驗進行治療組的非參數分析，隨後通過該分析比較治療組和載體對照組。
結果外科結果229隻遭受MCAO的動物用於這試驗。其中28隻在第7天分析前死亡，4隻被排除用於在24小時的評估(參見材料和方法和表1)。在研究中，為了對照梗塞面積和梗塞位置，具有皮下受累(n-21)梗塞的動物被排除分析。體重或體溫不同的治療組之間沒有統計學差異。
單天給藥方案EPO的單天給藥方案用於減少梗塞量和改善功能性結果的能力已經被試驗。當在阻塞後7天分析時，用右啡烷(25mg/kg)或EPO(5000IU/kg)治療的動物相比較於用載體治療的，在梗塞量或功能性結果上沒有顯示出差異(附圖1)。當在阻塞後24小時分析時，右啡烷減少了梗塞量(未顯示數據)。
多天給藥方案試驗在阻塞時和阻塞後24小時和48小時給予EPO多天劑量的效果。以2500IU/kg的EPO多天治療將導致絕對梗塞面積(附圖2A)和具有統計學意義(p＜.05)的相對梗塞面積(數據未顯示)均減少30％。而在5000IU/kg或1250IU/kg的劑量水平上均不能觀察到梗塞面積的減少。行為分析顯示，與用載體治療的動物相比，5000IU/kg時功能恢復顯著改善61％，在2500IU/kg時為65％(分別為p＜.01和p＜.001，附圖2B)。EPO在1250IU/kg時對功能性結果無效。
延緩性多天給藥方案已知在中風發生後將中風患者迅速送入急救室通常是不現實和不可能的。本發明證明了在輔助中風康復中EPO治療的延緩發生是有效的。在本發明中，阻塞後EPO的最初劑量被延緩了6小時，隨後在24小時和48小時給藥。對於6小時的治療延緩，無論是5000IU/kgEPO劑量還是2500IU/kg EPO劑量都不能導致梗塞面積(附圖3)的顯著減少。意料不到是，在5000IU/kg和2500IU/kg的劑量水平下，其功能分相對於載體分別增加了46％(p＜.05)和56％(p＜.01)。當第一天的給藥劑量被清除，在損傷後的24小時和48小時給藥，也能觀察到類似的結果(附圖4)即相對於載體，其在5000IU/kg(49％)和2500IU/kg(68％)梗塞面積沒有減少，在功能性結果上顯著改善。
與用載體治療的動物相比，EPO的多天給藥方案減少了梗塞面積並改善了功能性結果。延緩EPO的最初劑量至梗塞後24小時對於改善功能性結果是有效的，但不能減少梗塞面積。單天給藥方案對於梗塞面積或功能性結果均無效。
這些工作支持了先前報導的EPO在急性局部缺血性中風動物模型中的有效性。而且，這些數據證明了能延長有效的用於EPO改善功能性結果的治療時間窗，並證明了當考慮EPO用於神經系統疾病的治療時該給藥方案是重要的。
然而上述說明僅教導了本發明的原理，其中的實施例用於舉例說明，能理解的是本發明的實踐包括了所有通常的變化、改變和/或修飾，它們均包括在如下權利要求及其等同體的範圍之內。
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權利要求
1.一種用於促進局部缺血性發作後康復的促紅細胞生成素的給藥方案，包括給予所需患者治療有效量的EPO，其中在局部缺血性發作後的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量EPO，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量EPO。
2.權利要求1的給藥方案，其中在局部缺血性發作後大約24小時給予第一劑量EPO。
3.權利要求2的給藥方案，其中在第一劑量後的大約24小時給予第二劑量。
4.權利要求1的給藥方案，進一步包括在局部缺血性發作後的大約20小時至大約60小時之內給予患者第三劑量EPO。
5.權利要求4的給藥方案，其中在第二劑量後的大約8至24小時之內給予第三劑量EPO。
6.上述權利要求任一的給藥方案，其中至少一次劑量的EPO是通過皮下、肌內、靜脈或腹腔內途徑給藥。
7.上述權利要求任一的給藥方案，其中EPO的每次給藥劑量選自大約500IU/kg至大約10000IU/kg。
8.權利要求7的給藥方案，其中EPO的每次給藥劑量選自大約2500IU/kg至大約5000IU/kg。
9.權利要求7的給藥方案，其中EPO的每次給藥劑量為大約2500IU/kg。
10.上述權利要求任一的給藥方案，其中局部缺血性發作是中風。
11.權利要求10的給藥方案，其中至少一次EPO的給藥劑量為大約2500IU/kg。
12.權利要求11的給藥方案，其中EPO的每次給藥劑量為大約2500IU/kg。
13.上述任一權利要求的給藥方案，其中促紅細胞生成素是長效EPO。
14.一種治療局部缺血性發作患者的方法，包括給予所述患者治療有效量的EPO，其中在局部缺血性發作後的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量EPO，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量EPO。
15.權利要求14的方法，其中在局部缺血性發作後大約24小時給予第一劑量EPO。
16.權利要求15的方法，其中在第一劑量後的大約24小時給予第二劑量。
17.權利要求14的方法，進一步包括在局部缺血性發作後的大約20小時至大約60小時之內給予患者第三劑量EPO。
18.權利要求16的方法，其中在第二劑量後的大約8至24小時之內給予第三劑量EPO。
19.權利要求14-18的方法，其中EPO的每次給藥包括通過皮下、肌內、靜脈或腹腔內注射EPO。
20.權利要求14-18任一的方法，其中EPO的每次給藥劑量選自大約500IU/kg至大約10000IU/kg。
21.權利要求20的方法，其中EPO的每次給藥劑量選自大約2500IU/kg至大約5000IU/kg。
22.權利要求21的方法，其中EPO的每次給藥劑量為大約2500IU/kg。
23.權利要求14-18任一的方法，其中局部缺血性發作是中風。
24.權利要求23的方法，其中至少一次EPO的給藥劑量為大約2500IU/kg。
25.一種促進患者局部缺血性發作後功能恢復的方法，包括給予所述患者治療有效量的EPO，其中在局部缺血性發作後的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量EPO，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量EPO。
26.權利要求25的方法，其中在局部缺血性發作後大約24小時給予第一劑量EPO。
27.權利要求26的方法，其中在第一劑量後的大約24小時給予第二劑量。
28.權利要求25的方法，進一步包括在局部缺血性發作後的大約20小時至大約60小時之內給予患者第三劑量EPO。
29.權利要求28的方法，其中在第二劑量後的大約8至24小時之內給予第三劑量EPO。
30.權利要求28-32任一的方法，其中EPO的每次給藥包括通過皮下、肌內、靜脈或腹腔內注射EPO。
31.權利要求28-32任一的方法，其中EPO的每次給藥劑量選自大約500IU/kg至大約10000IU/kg。
32.權利要求31的方法，其中EPO的每次給藥劑量選自大約2500IU/kg至大約5000IU/kg。
33.權利要求32的方法，其中EPO的每次給藥劑量為大約2500IU/kg。
34.權利要求28-32任一的方法，其中局部缺血性發作是中風。
35.權利要求34的方法，其中至少一次EPO的給藥劑量為大約2500IU/kg。
36.權利要求35的方法，其中EPO的每次給藥劑量為大約2500IU/kg。
37.一種減少在局部缺血性發作6小時之內最初接觸EPO的患者的梗塞面積的方法，包括給予患者每劑量大約1500IU/kg至大約4500IU/kg的EPO，其中在最初接觸EPO後的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量EPO，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量EPO。
38.權利要求37的方法，其中在局部缺血性發作後大約24小時給予第一劑量EPO。
39.權利要求38的方法，其中在第一劑量後的大約24小時給予第二劑量。
40.權利要求37的方法，進一步包括在局部缺血性發作後的大約20小時至大約60小時之內給予患者第三劑量EPO。
41.權利要求40的方法，其中在第二劑量後的大約8至24小時之內給予第三劑量EPO。
42.權利要求37-41任一的方法，其中EPO的每次給藥包括通過皮下、肌內、靜脈或腹腔內注射EPO。
43.權利要求37-41任一的方法，其中EPO的每次給藥劑量選自大約1800IU/kg至大約4000IU/kg。
44.權利要求43的方法，其中EPO的每次給藥劑量選自大約2000IU/kg至大約3000IU/kg。
45.權利要求44的方法，其中EPO的每次給藥劑量為大約2500IU/kg。
46.權利要求37-41任一的方法，其中局部缺血性發作是中風。
47.權利要求46的方法，其中至少一次EPO的給藥劑量為大約2500IU/kg。
48.權利要求47的方法，其中EPO的每次給藥劑量為大約2500IU/kg。
49.一種抑制患者局部缺血性發作後CNS中的細胞凋亡或炎症的方法，包括給予所述患者治療有效量的EPO，其中在局部缺血性發作後的大約8小時至大約26小時之內給予第一劑量EPO，隨後在第一劑量後的大約8小時至大約26小時之內給予第二劑量EPO。
50.權利要求49的方法，其中在局部缺血性發作後大約24小時給予第一劑量EPO。
51.權利要求50的方法，其中在第一劑量後的大約24小時給予第二劑量。
52.權利要求51的方法，進一步包括在局部缺血性發作後的大約20小時至大約60小時之內給予患者第三劑量EPO。
53.權利要求52的方法，其中在第二劑量後的大約8至24小時之內給予第三劑量EPO。
54.權利要求49的方法，其中EPO的每次給藥包括通過皮下、肌內、靜脈或腹腔內注射EPO。
55.權利要求49的方法，其中EPO的每次給藥劑量為大約2500IU/kg。
56.權利要求49的方法，其中局部缺血性發作是中風。
57.權利要求56的方法，其中至少一次EPO的給藥劑量為大約2500IU/kg。
58.權利要求57的方法，其中EPO的每次給藥劑量為大約2500IU/kg。
全文摘要
本發明證明了EPO在促進患者局部缺血性發作後康復中的有效性。本發明還證明了在治療局部缺血性中風中最初使用EPO的機會的期限要長於先前所知道的。
文檔編號C07K14/505GK1764470SQ200480008333
公開日2006年4月26日 申請日期2004年3月26日 優先權日2003年3月27日
發明者M·戈爾德, M·J·倫茨, K·J·羅德斯, N·蒂魯馬萊, F·法雷爾, L·喬利菲 申請人:詹森藥業有限公司