微氣泡加快免疫反應的化學發光免疫檢測系統的製作方法

2023-05-17 18:16:41

專利名稱：微氣泡加快免疫反應的化學發光免疫檢測系統的製作方法
技術領域：
本發明為微氣泡加快的免疫反應結合由抗體修飾的樹脂微珠製成的新型免疫傳 感器而發展的化學發光免疫檢測系統，尤其是微氣泡加快免疫反應的快速免疫分析方 法；本傳感器還涉及用於單組分化學發光免疫分析的檢測系統。二、 背景技術免疫分析作為一種高選擇性和高靈敏度的分析方法，在臨床診斷、環境監測、食 品安全等領域得到了F!益廣泛的應用。免疫分析分為均相和異相免疫分析，後者因為 能獲得更高的靈敏度而被廣泛應用。化學發光分析也是近年來快速發展的分析技術， 其儀器便宜，操作簡便，環境友好，是目前最靈敏的分析技術之一，特別適合於痕量 物質的檢測。流動注射技術有重現性好，自動化程度高，分析速度快等優點，是實現 高通量分析最有效的手段之一。將後兩種技術與免疫分析聯用而發展起來的流動注射 化學發光免疫分析技術，是免疫分析領域近年來的研究熱點，並已經取得了令人矚目 的成果。異相免疫分析需要用一種載體去固定抗體或者抗原，然後進行免疫反應。理 想的免疫反應載體應當符合以下要求(l)載體表面必須有適當的功能基團，可與抗 原抗體發生共價鍵合反應；(2)表面鍵合方式不應當對抗原抗體的空間構型產生較大 影響，以保持其免疫活性；(3)載體應有較大比表面積，以提高其對抗原抗體的固定 量-,(3)載體表面應具有較強親水性，以減小非特異性吸附；(4)載體必須為剛性材 料，在載流連續衝擊的情況下仍能保持其物理形狀。異相免疫分析常用的載體包括尼 龍、殼聚糖、矽材料、玻璃微珠、磁珠和瓊脂糖等；但是這些材料存在要麼價格高、 或者非特異性吸附大、或者親水性差、或者機械性能不好、或者因為比表面積小而固定容量不夠等缺點，所以尋找一種理想的固定載體對異相免疫分析至關重要。在異相免疫分析中，溫育時間(即免疫反應速率)是制約免疫分析速度的瓶頸， 而免疫反應速率受傳質速率和免疫反應動力學控制。加熱可以加快免疫反應動力學， 但是這樣會增加分析成本和操作複雜性，並且加熱溫度過高會引起蛋白質的變性。因 此，通過加快傳質速率來縮短溫育時間引起人們的很大興趣。不同的方法己被用來加 快傳質速率，例如電場和磁場驅動、捕獲基質旋轉和低能微波等，但是這些方法需要 複雜或者特殊的裝置。
發明內容
本發明的目的是利用微氣泡加快免疫反應，結合流動注射分析技術，以抗體修 飾的樹脂微珠製成新型免疫傳感器，提供一種快速、靈敏、自動化的化學發光免疫分 析檢測系統。
本發明通過以下技術方案來實現.-
一種微氣泡加快免疫反應的化學發光免疫檢測系統包括溶液傳輸系統、微氣泡溫 育裝置、免疫傳感器、化學發光檢測器和計算機。傳輸系統由蠕動泵(P1， P2)、微量 注射泵(P3)、四根連接管和八通注射閥(V)組成；四根連接管通過多通道蠕動泵和微量 注射泵分別連接到八通注射閥和傳感器上；免疫傳感器置於化學發光檢測器上面；輸 液傳輸系統和化學發光檢測器均於計算機相連。樣品和酶標抗體形成的預溫育複合物 通過微量注射泵(P3)注入免疫傳感器；載流、衝洗液和再生液通過蠕動泵(P1)傳輸， 發光底物由蠕動泵(P2)混合後經過八通注射闊形成底物區帶，由載流將區帶載入免疫 傳感器，產生化學發光信號。
上述的多通道蠕動泵(P1， P2)的轉速、微量注射泵(P3)的注射速度和液體流速是可
調的，連接管與通氮氣的管道是分別是內徑0.8 mm和0.5 mm的聚四氟乙烯管。八通 注射閥可通過儀器所帶程序由計算機控制實現不同流路的切換。免疫傳感器由充滿抗 體修飾的羧基活化樹脂微珠的無色透明玻璃管(內徑1.6mm，長為4cm)製成。
上述的載流為0.01 M磷酸鹽緩衝液，pH 7.0;衝洗液為0.01 M磷酸鹽緩衝液，pH 7.0,含0.05%吐溫-20;再生液為0.1M胺基酸/鹽酸緩衝液，pH7.0;化學發光底物為 0.5 mmo1/1魯米諾，0.6 mmo1/1對碘苯酚和4 mmo1/1雙氧水。
一種微氣泡加快免疫反應的化學發光免疫檢測系統，其具體分析步驟如下
(1) 將含抗原的待測樣品和辣根過氧化物酶標記的示蹤抗體加入溫育管內，通入氮 氣產生微氣泡，加快免疫反應，形成抗原酶標抗體複合物；
(2) 用微量注射泵(P3)將抗原-抗體複合物以0.025 mL/min通過免疫傳感器，在傳感 器內形成酶標免疫夾心複合物；
(3) 通過蠕動泵(P1)將衝洗液以2.0 mL/min流速通過免疫傳感器，洗去未結合免疫 試劑；同時，魯米諾-對碘苯酚混合液和雙氧水由蠕動泵(P2)分別以1.0mL/min流速混合產生100 |iL區帶，利用蠕動泵(P1)驅動載流以2.0mL/min注入免疫傳感器， 產生強烈的化學發光，記錄發光信號。由該信號可得到組分的濃度。
(4)測定完成後，依次將再生液和載流通過蠕動泵(P1)輸入免疫傳感器，使免疫 夾心複合物解離，再生免疫傳感器，以進入下一輪測定循環。
微氣泡加快免疫反應的流動注射化學發光免疫檢測系統的構成
本檢測系統的結構如圖1所示，共包括五個部分第一個部分是溶液傳輸系統，
該傳輸系統以兩個蠕動泵和一個微量注射泵產生傳質動力，以若干聚四氟乙烯管為傳
質連接管，以一個八通注射閥控制液流方向，把不同溶液注入免疫傳感器；第二部分 是微氣泡加快的溫育裝置；第三部分是免疫傳感器；第四部分是化學發光檢測器；第 五部分是計算機控制系統。
本檢測系統的工作原理-
本檢測系統基於微氣泡加快的免疫反應，結合由抗體修飾的樹脂微珠製成的新型 免疫傳感器，採用傳統的雙抗體夾心模式，可以快速、靈敏地進行流動注射化學免疫 分析。如圖2所示，以一種待測抗原為例，在免疫傳感器中固定待測物的抗體，將含 有待測物的樣品與辣根過氧化物酶標記的示蹤抗體加入小管內預溫育，通過微氣泡加 快免疫反應，形成抗原酶標抗體複合物；然後將該抗原酶標抗體複合物緩慢流過免疫 傳感器，形成雙抗體夾心複合物；隨後通入衝洗液洗去未結合的免疫試劑，通入酶的 發光底物(魯米諾、對碘苯酚和雙氧水混合溶液)，產生強烈的化學發光，記錄發光信 號，得到待測物的含量。
測定完成後，依次通入再生液和載流兩個循環，可使形成的免疫夾心複合物解 離，免疫傳感器獲得再生，進入下一個測定循環。
.分析過程中，所有溶液由蠕動泵和微量注射泵上連接管輸入分析系統，通過轉動八通注射 閥實現不同流路的切換，全過程由計算機進行程序化自動控制。
本檢測系統的測定原理
當待測樣品中存在擬測定的抗原物質時，待測抗原物質先與酶標抗體在微氣泡的 作用下進行快速的免疫反應，生成的複合物注入免疫傳感器形成雙抗體夾心複合物。 通入辣根過氧化物酶的化學發光底物(魯米諾、對碘苯酚和雙氧水混合溶液)，得到待測組分的化學發光信號，通過換算得到待測抗原的濃度。 本發明與現有技術相比，具有以下特點
本發明結合流動分析技術與化學發光檢測，利用微氣泡加快免疫反應，通過由抗 體修飾的樹脂微珠製成的新型免疫傳感器，進行快速免疫檢測。相對於檢測系統，具 有以下特點
(1) 操作簡單，全分析過程均在流動體系中完成，以計算機進行程序化自動控制， 手工操作極少，無需熟練操作人員。
(2) 微氣泡加快免疫反應，分析時間短，全過程包括加樣、溫育、衝洗、檢測與再 生僅需16分鐘，是目前最快速的免疫分析方法之一。
(3) 儀器設備簡單，成本低廉，整個分析系統由低值的蠕動泵、八通注射閥、聚四 氟乙烯管和化學發光檢測器組成。
(4) 免疫傳感器可以通入再生緩衝液進行反覆再生使用，與常規的免疫分析方法相 比，大大節約了昂貴的包被抗體，進一步降低了分析成本。
(5) 由於其檢測模式為極靈敏的酶催化的化學發光反應，本方法可測出底濃度的樣 品，滿足絕大多數的分析需求。
(6) 由於採用了自動化的流動分析技術，使分析的重現性比傳統的手工操作方法大
為提高，有利於制定相關標準。
四

圖1.微氣泡加快免疫反應的流動注射化學發光免疫檢測系統的結構示意圖
Pl、 P2為蠕動泵；P3為微量注射泵；V為八通注射閥
圖2.微氣泡加快免疫反應的流動注射化學發光免疫檢測系統原理示意圖
五具體實施例方式
實施例l:基於抗體修飾樹脂微珠的傳感器製備。
該傳感器具體製備過程如下取50毫克樹脂微珠在20%的乙醇溶液中溶脹，用
pH5.5的活化緩衝液2-(N-嗎啡啉)乙磺酸衝洗三次，重新分散到該活化緩衝液中，然 後加入30毫克碳二亞胺(EDC)和30毫克N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，室溫攪拌活化2小時，用偶聯緩衝液(pH7.0磷酸鹽緩衝)衝洗三次，加入200微升的單克隆抗體，室溫緩慢攪拌2小時，4。C下冰箱放置24小時，然後用1%的牛血清蛋白封閉24小時，用偶聯緩衝液徹底清洗。最後將抗體修飾的樹脂微珠填充入4釐米長的無色透明玻璃管(內徑1.6mm)中，製得該免疫傳感器。
實施例2:結合附圖1對微氣泡加快免疫反應的流動注射化學發光免疫檢測系統進一步說明
微氣泡加快免疫反應的流動注射化學發光免疫檢測系統包括溶液傳輸系統、微氣
泡加快的溫育裝置、免疫傳感器、化學發光檢測器和計算機。四根內徑為0.8mm的聚四氟乙烯連接管將多通道蠕動泵(P1， P2)、微量注射泵(P3)、八通注射閥和傳感器連接起來，樣品和酶標抗體在微氣泡作用下，快速免疫反應，形成的預溫育複合物通過微量注射泵(P3)傳輸通過免疫傳感器流出，載流、衝洗液和再生液通過蠕動泵(P1)傳輸，發光底物由蠕動泵(P2)混合後經過八通注射閥注射通過免疫傳感器，免疫傳感器置於化學發光檢測器上面；輸液傳輸系統和化學發光檢測器均於計算機相連。
實施例3:化學發光免疫分析方法
所有分析步驟由計算機進行程序化自動控制。再生液為0.1 M胺基酸/鹽酸緩衝液，pH2.0;衝洗緩衝液為含0.05。/o吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩衝液，pH7.0;化學發光底物為0.5 mmo1/1魯米諾、4 mmo1/1雙氧水與0.6 mmo1/1對碘苯酚的混合溶液。具
體分析過程如下
(1) 將含有抗原的待測樣品和辣根過氧化物酶標記的示蹤抗體加入溫育管內，通入
氮氣產生微氣泡，在微氣泡作用下，室溫溫育10min。
(2) 用微量注射泵(P3)將抗原抗體複合物以0.025 mL/min通過免疫傳感器。
(3) 通過蠕動泵(Pl)將衝洗液以2.0mL/min流速通過免疫傳感器，洗去未結合免疫試劑，同時，魯米諾-對碘苯酚和雙氧水通過蠕動泵(P2)分別以LOmL/min流速混合產生100 ^tL區帶，利用蠕動泵(P1)驅動載流以2.0 mL/min注入免疫傳感器，產生強烈的化學發光，記錄發光信號。由該信號可得到組分的濃度。
(4) 測定完成後，以2.0mL/min流速通入再生液再生免疫傳感器。
(5) 以2.0mL/min流速通入載流調節免疫傳感器，進入下一輪測定循環。實施例4:以一種重要的腫瘤標記物甲胎蛋白(AFP)為例，說明該微系統的應
用
用鼠單克隆抗甲胎蛋白抗體修飾羧基活化樹脂微珠，以牛血淸蛋白封閉殘餘活性
位點，將樹脂微珠填充到長4cm內徑1.6mm的無色透明玻璃管中，製成免疫傳感器。AFP的示蹤抗體為辣根過氧化物酶標記的鼠單克隆AFP抗體。
具體流程如下，向溫育管中加入30微升樣品、30微升示蹤抗體，通入氮氣產生微氣泡，在微氣泡作用下，室溫溫育10min。將溫育液緩慢通過免疫傳感器，然後衝洗免疫傳感器1分鐘。注入辣根過氧化物酶底物，產生化學發光，收集信號。檢測完成後，分別通入再生液和載流，再生和平衡傳感器。檢測一系列標準溶液的信號，得到AFP的標準曲線。再利用標準曲線和檢測樣品測得的化學發光信號，得到臨床血樣中該腫瘤標記物的濃度。
權利要求
1. 本發明涉及一種微氣泡加快免疫反應的化學發光免疫檢測系統。該系統包括溶液傳輸系統、微氣泡溫育裝置、免疫傳感器、化學發光檢測器和計算機。傳輸系統由蠕動泵(P1，P2)、微量注射泵(P3)、四根連接管和八通注射閥(V)組成；四根連接管通過多通道蠕動泵和微量注射泵分別連接到八通注射閥和傳感器上；免疫傳感器置於化學發光檢測器上面；輸液傳輸系統和化學發光檢測器均於計算機相連。樣品和酶標抗體形成的預溫育複合物通過微量注射泵(P3)注入免疫傳感器；載流、衝洗液和再生液通過蠕動泵(P1)傳輸，發光底物由蠕動泵(P2)混合後經過八通注射閥形成底物區帶，由載流將區帶載入免疫傳感器，產生化學發光信號。
2. 根據權利要求1所述的檢測系統，其特徵在於所述的免疫傳感器由充滿抗體 修飾的羧基活化樹脂微珠的無色透明玻璃管制成。
3. 根據權利要求1所述的檢測系統，其特徵在於所述的八通注射閥可以通過儀 器所帶程序由計算機控制實現不同流路的切換，所有液體流速是可調的。
4. 根據權利要求1所述的檢測系統，其特徵在於所述的載流為0.01M磷酸鹽緩 衝液，pH7.0;衝洗液為0.01 M磷酸鹽緩衝液，pH7.0,含0.05%吐溫-20;再生液為 0.1 M胺基酸/鹽酸緩衝液，pH 7.0;化學發光底物為0.5 mmol/l魯米諾，0.6 mmo1/1 對碘苯酚和4 mmo1/1雙氧水。
5. 根據權利要求1所述的檢測系統，其特徵在於所述的微氣泡溫育裝置將氮氣 通入溫育管產生微氣泡，加快兔疫反應。
6. —種微氣泡加快免疫反應的化學發光免疫檢測系統，其具體分析步驟如下(1) 將含抗原的待測樣品和辣根過氧化物酶標記的示蹤抗體加入溫育管內，通入氮 氣產生微氣泡，加快免疫反應，形成抗原酶標抗體複合物；(2) 用微量注射泵(P3)將抗原-抗體複合物以0.025 mL/min通過免疫傳感器，在傳感 器內形成酶標免疫夾心複合物；(3) 通過蠕動泵(P1)將衝洗液以2.0 mL/min流速通過免疫傳感器，洗去未結合免疫 試劑；同時，魯米諾-對碘苯酚混合液和雙氧水由蠕動泵(P2)分別以1.0 mL/min 流速混合產生100 nL區帶，利用蠕動泵(P1)驅動載流以2.0 mL/min注入免疫傳 感器，產生強烈的化學發光，記錄發光信號。由該信號得到組分的濃度。(4) 測定完成後，依次將再生液和載流通過蠕動泵(P1)輸入免疫傳感器，使免疫夾 心複合物解離，再生免疫傳感器，以進入下一輪測定循環。
全文摘要
一種微氣泡加快免疫反應的化學發光免疫檢測系統。該系統包括溶液傳輸系統、微氣泡溫育裝置、免疫傳感器、化學發光檢測器和計算機。傳輸系統由蠕動泵(P1，P2)、微量注射泵(P3)、連接管和八通注射閥(V)組成；免疫傳感器由充滿抗體修飾的羧基活化樹脂微珠的無色透明玻璃管制成，並置於化學發光檢測器光窗上方。將待測樣品和酶標抗體加入溫育管後，通入氮氣產生微氣泡，加快免疫反應，減少預溫育時間，並用微量注射泵將溫育複合物注入免疫傳感器，形成夾心免疫複合物。用蠕動泵(P1)通入衝洗液，洗淨未結合的過量抗體後，由蠕動泵(P2)注入一體積的辣根過氧化物酶的化學發光底物，爾後蠕動泵(P1)通入載流將底物區帶載入免疫傳感器，產生化學發光信號，由信號強度檢測樣品濃度。檢測完成後由蠕動泵(P1)通入再生液，可再生免疫傳感器進行下一個分析流程。該檢測系統成本低、快速、靈敏度高、重現性和精密度好，適合於環境監測、臨床診斷、和食品安全等領域。
文檔編號G01N21/76GK101545901SQ20081002442
公開日2009年9月30日 申請日期2008年3月24日 優先權日2008年3月24日
發明者楓 嚴, 楊佔軍, 鞠熀先 申請人:江蘇省腫瘤醫院;南京大學