一種提高小麥紋枯病抗性的方法
2023-05-17 06:27:21
專利名稱：：一種提高小麥紋枯病抗性的方法
技術領域：
：本發明涉及小麥育種和分子生物學領域，通過採用基因工程方法將天麻的抗真菌蛋白基因和防禦素基因導入常規小麥並表達，增加小麥的紋枯病抗性。
背景技術：
：小麥紋枯病，又稱麥尖眼點病(Wheatsharpeyespot)，是由禾穀絲核菌(RhizoctoniacerealisVanderhoeven)禾口立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn)弓l起的一種重要的世界性土傳真菌病害，早在1934年國外即有報導。1973年，我國也發現此病。20世紀80年代以來，隨著施肥水平的不斷提高，耕作制度的改變和感病品種的大面積推廣，紋枯病已成為我國長江流域麥區的主要病害，並逐漸蔓延到黃淮麥區，近年來以魯、豫、陝、蘇、皖等麥區發生較為嚴重(姚金保等，2007)。小麥紋枯病一般病田病株率為10-20%，重病田塊可達60-80%以上，由此造成的產量損失嚴重，輕的減產5-10%，重的減產40%，甚至顆粒無收，並且小麥紋枯病發病越早，損失越重(張會雲等，2007)。目前，我國小麥紋枯病的防治依然以化學防治為主，化學防治不僅增加農本，而且會造成環境汙染，化防的效果還直接受到施藥的時期、天氣等諸多環境因素的影響。培育並推廣小麥紋枯病抗病品種無疑是控制該病害最經濟和最有效的途徑。但多年的種質材料鑑定研究也發現，在已經篩選的近千份材料中，沒有發現對該病害免疫的小麥品種(系)，高抗的材料也較少。對主要紋枯病抗源的抗性遺傳和抗病QTL(數量性狀位點)分析結果表明，小麥紋枯病抗性是由主基因和微效基因共同作用的數量性狀，並且存在複雜的基因互作(湯顳等，2004;吳紀中等，2005;張小村等，2005;任麗娟等，2007)。由於遺傳方式的複雜，給常規育種帶來諸多困難，如周期性強、預見性差等，直接影響了小麥紋枯病抗性改良的進度。近年來，轉基因技術由於周期短、可用的抗性基因多、針對性強等優點，已經成為提高作物抗病能力的新手段。採用這一方法，來自於小麥近緣種中間偃麥草的乙烯反應因子(ERF)基因已經被導入小麥並獲得紋枯病抗性顯著提高的轉基因小麥植株(ChenLiang等，2008)。天麻抗真菌蛋白(Gastrodiaantifungalprotien，GAFP)位於天麻次生土央莖的表皮和皮層，對天麻次生塊莖阻抑蜜環菌侵染有關，離體抑菌實驗表明天麻抗真菌蛋白對多種真菌均有抑菌活性(胡忠等，1988)，該基因已經被克隆(http:〃麗w.ncbi.nlm.nih.gov/;GenBank:AF225410)。防禦素是一類廣泛存在於生物體內的富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽，其作用機理特殊帶正電荷的防禦素分子與帶負電荷的靶細胞膜接觸後，通過靶細胞膜產生的電動勢將形成疏水面的防禦素二聚體注入細胞膜，多個二聚體可形成跨膜離子通道，擾亂細胞膜通透性及細胞能量狀態，導致細胞膜去極化，呼吸作用受抑制以及細胞ATP含量下降，最終使靶細胞死亡；防禦素抗病毒作用則是通過與病毒外殼蛋白結合而導致病毒失去生物活性(童青春等，1999;龍晶等，2007)。防禦素的抗菌譜廣，不但對細菌、真菌、和被膜病毒有廣譜的毒殺效應，對某些惡性腫瘤細胞也有毒殺作用。來自於兔的防禦素NP-l已進行胺基酸序列測定(GenBank:AAB21588)。本發明採用基因工程方法將天麻抗真菌蛋白基因以及兔防禦素NP-l基因導入普通小麥，提高了小麥的紋枯病抗性。
發明內容本發明目的在於針對目前小麥紋枯病抗性種質資源貧乏狀況，採用轉基因方法將抗小麥紋枯病病原菌的天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因導入感紋枯病的小麥品種，從而提高小麥的紋枯病抗性。本發明目的是這樣實現的構建天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因的表達載體；採用基因槍方法將構建的表達載體導入受體小麥幼胚細胞；通過組織培養過程篩選，獲得轉基因待選植株；對待選植株進行PCR(聚合酶鏈式反應)分析，獲得整合併表達天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因的轉基因植株；對純合的轉基因植株後代株系進行紋枯病抗性鑑定，篩選並獲得紋枯病抗性提高的小麥轉基因株系。在本發明中所述的構建天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因的表達載體是這樣實現的，以pAHC25(附圖一)為基礎質粒，採用限制性內切酶XbaI和Bgl1I對pAHC25質粒DNA進行部分酶切，切除質粒含有的bar基因，0.8%瓊脂糖電泳，回收9.1Kb左右DNA酶切大片段，與起始密碼子ATG前和終止密碼子TGA後分別添加XbaI和BglII酶切位點的兔防禦素NP-l基因(由GenBank:AAB21588胺基酸序列推導的DNA鹼基序列添加ATG起始密碼子和終止密碼子TGA，完整DNA序列見Seql)DNA片段，採用T4DNA連接酶16。C連接過夜(25ul反應體系含1XT4DNA連接酶緩衝液，質粒大片段0.3pmo1，兔防禦素NP_1基因片段0.03pmol，350uT4DNA連接酶，連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞(轉化方法參照《分子克隆實驗指南》第二版，P55-56頁，科學出版社，1992)，轉化後的大腸桿菌DH5a細胞懸液塗布含100mg/L氨苄青黴素的平板，對抗氨苄青黴素的陽性克隆進行擴增並提取質粒，採用測序和酶切的方法驗證連接的正確性，獲得的質粒命名為pAHC-NP;pAHC-NP質粒DNA採用限制性內切酶SmaI和SacI完全酶切，切除質粒含有的GUS基因，0.8%瓊脂糖電泳，回收7.3Kb左右DNA酶切大片段，再與起始密碼子ATG前和終止密碼子TGA後分別添加SmaI和SacI酶切位點的天麻抗真菌蛋白基因(GenBank:AF225410添加起始密碼子ATG和終止密碼子TGA，完整DNA序列見seq2)DNA片段採用T4DNA連接酶按上文連接條件進行連接，連接產物按上文方法轉化大腸桿菌，對抗100mg/L氨苄青黴素的陽性克隆進行擴增並提取質粒，採用測序和酶切的方法驗證連接的正確性，獲得的質粒命名為pAHC-NP-GAFP即為天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因的表達載體(見附圖二)。採用基因槍轉基因方法將構建的表達載體導入受體小麥幼胚細胞，通過愈傷誘導、植株再生獲得轉基因待選植株(參照周淼平等，小麥基因槍法轉化技術的改進，江蘇農業學報，1999，15(1):62-64);所述的受體小麥是指六倍體常規小麥；所述的幼胚是指開花後12-14天的幼胚。在本發明的應用中對待選植株進行分子檢測，獲得整合併表達天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因的陽性轉基因植株，陽性轉基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T5代轉基因純合株系；對T5代轉基因純合株系後代系進行紋枯病抗性篩選，獲得紋枯病抗性提高的轉基因植株。所述的分子檢測為PCR分析方法。PCR分析是指提取待選轉基因小麥及其後代的基因組DNA(脫氧核糖核酸)，以此為模板對天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因片段進行PCR擴增，能擴增出相應基因片段的植株為陽性轉基因植株。天麻抗真菌蛋白基因的PCR檢測引物為5'CTAGCACAAGGCGGCTACCTATTC3'和5'GCAGTGATTTCAGCATTTCCAACG3'，擴增條件95。C3分鐘；94。C1分鐘，62。C45秒，72。C30秒，共30個循環；最後72。C延伸5分鐘。擴增片段大小為305bp，檢測電泳圖見附圖3。兔防禦素基因的PCR檢測引物為5，ATGGTTGTTTGTGCATGTAG3，禾P5，CAACGACGACAACAAAGTGG3'，擴增條件95。C3分鐘；94。C1分鐘，60。C45秒，72。C30秒，共35個循環；最後72。C延伸5分鐘。擴增片段大小為104bp，檢測電泳圖見附圖4。紋枯病抗性鑑定是指採用具有較強致病力的紋枯病病原菌進行牙籤嵌入法接種(具體鑑定方法參照蔡士賓等，小麥抗紋枯病種質創新及QTL定位的初步研究，中國農業科學，2006，39(5):928-934)，根據病情指數判定其紋枯病抗性。具體做法如下將長1.OcM左右的牙籤水浸30分鐘後，鋪於燒杯底部，加入適量PDA培養基，經高溫溼熱滅菌後，接種具有較強致病力的紋枯菌菌絲塊，25t:恆溫培養30天，待菌絲密集布滿短牙籤表面。小麥拔節期將經上述方法處理的牙籤嵌入到小麥植株貼近地面的基部第12葉鞘之間，每株系接種15個莖稈，噴霧保溼7天。於小麥乳熟期調查紋枯病發病情況，計算病情指數，根據病情指數判定小麥植株的紋枯病抗性。病情嚴重度判定標準如下0級無病症；1級葉鞘有典型的紋枯病病斑，但不侵莖；2級病菌侵人莖稈，病斑寬度環莖不超過莖稈周長的1/2;3級病菌侵人莖稈，莖稈上病斑環莖寬度在1/2-3/4莖稈周長之間；4級病菌侵人莖稈，莖稈上病斑繞莖稈3/4以上，或莖稈已軟腐；5級枯孕穗或枯白穗。病情指數按以下公式計算病情指數=[(E各級病株數X各級代表值)/(總株數X最高級代表值)]X100紋枯病抗性判定標準病情指數《20為"高抗"；20<病情指數《50為"抗病"；50<病情指數《80為"感病"；80<病情指數《100為"高感"。本發明的優點在於與常規的種質培育方法相比，選取的目的基因對紋枯病病原菌的生長有抑制作用，針對性強；由轉化植株到純合的轉基因株系時間短並且對受體親本的重要農藝性狀影響小，培育的周期短、減少對重要農藝性狀選育所需的人工經驗的依賴性。圖lpAHC25的示意圖圖2天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因的表達載體pAHC-NP-GAFP的示意圖圖3部分轉基因待選植株天麻抗真菌蛋白基因的PCR檢測的電泳圖，其中1:未轉基因揚麥158對照。2:質粒pAHC-NP-GAFP。12:DNA分子量標準，條帶從上到下分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。3-11，13-24:轉基因待選植株。其中4-6，8-11，13-18，20-24為轉天麻抗真菌蛋白基因的陽性植株。圖4為部分轉基因待選植株兔防禦素基因的PCR檢測的電泳圖，其中CK+:質粒pAHC-NP-GAFP。CK—:未轉基因揚麥158對照。1-16:轉基因待選植株。其中1，3-6，10-15為轉兔防禦素基因的陽性植株。具體實施方式實施例1:以pAHC25為基礎質粒，採用限制性內切酶XbaI和BglII對pAHC25質粒DNA進行部分酶切，切除質粒含有的bar基因，O.8%瓊脂糖電泳，回收9.1Kb左右DNA酶切大片段，與起始密碼子ATG前和終止密碼子TGA後分別添加XbaI和BglII酶切位點的兔防禦素NP-1基因(由GenBank:AAB21588胺基酸序列推導的DNA鹼基序列添加ATG起始密碼子和終止密碼子TGA，完整DNA序列見seql)DNA片段，採用T4DNA連接酶16。C連接過夜(25ul反應體系含lXiy)NA連接酶緩衝液，質粒大片段O.3pmol，兔防禦素NP-l基因片段0.03pmol，35uT4DNA連接酶，連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞(轉化方法參照《分子克隆實驗指南》第二版，P55-56頁，科學出版社，1992)，轉化後的大腸桿菌DH5a細胞懸液塗布含100mg/L氨苄青黴素的平板，對抗氨苄青黴素的陽性克隆進行擴增並提取質粒，採用測序和酶切的方法驗證連接的正確性，獲得的質粒命名為pAHC-NP;pAHC-NP質粒DNA採用限制性內切酶SmaI和SacI完全酶切，切除質粒含有的GUS基因，0.8%瓊脂糖電泳，回收7.3Kb左右DNA酶切大片段，再與起始密碼子ATG前和終止密碼子TGA後分別添加SmaI和SacI酶切位點的天麻抗真菌蛋白基因(GenBank:AF225410添加起始密碼子ATG和終止密碼子TGA，完整DNA序列見seq2)DNA片段採用T4DNA連接酶按上文連接條件進行連接，連接產物按上文方法轉化大腸桿菌，對抗100mg/L氨苄青黴素的陽性克隆進行擴增並提取質粒，採用測序和酶切的方法驗證連接的正確性，獲得的質粒命名為pAHC-NP-GAFP即為天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因的表達載體(見附圖二)。以揚麥158為受體，採用基因槍法，將天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因同時導入揚麥158幼胚細胞，通過愈傷誘導、植株再生獲得轉基因待選植株(參照周淼平等，小麥基因槍法轉化技術的改進，江蘇農業學報，1999，15(1):62-64)，對待選植株進行PCR篩選，天麻抗真菌蛋白基因的PCR檢測引物為5'CTAGCACAAGGCGGCTACCTATTC3'和5'GCAGTGATTTCAGCATTTCCAACG3'，擴增條件95°C3分鐘；94°C1分鐘，62。C45秒，72°C30秒，共30個循環；最後72t:延伸5分鐘。擴增片段大小為305bp，檢測電泳圖見附圖3。兔防禦素基因的PCR檢測引物為5'ATGGTTGTTTGTGCATGTAG3'禾P5'CAACGACGACAACAAAGTGG3，，擴增條件95。C3分鐘；94。C1分鐘，60°C45秒，72°C30秒，共35個循環；最後72t:延伸5分鐘。擴增片段大小為104bp，檢測電泳圖見附圖4。獲得整合併表達天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因的轉基因植株，轉基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T5代轉基因純合株系，對轉基因純合株系後代進行紋枯病抗性篩選。紋枯病抗性篩選採用江蘇省農業科學院植物保護研究所提供的具較強紋枯病致病力菌株R3010接種，接種採用牙籤接菌法(具體鑑定方法參照蔡士賓等，小麥抗紋枯病種質創新及QTL定位的初步研究，中國農業科學，2006，39(5):928-934)，將長1.OcM左右的牙籤水浸30分鐘後，鋪於燒杯底部，加入適量PDA培養基，經高溫溼熱滅菌後，接種具有較強致病力的紋枯菌菌絲塊，25t:恆溫培養30天，待菌絲密集布滿短牙籤表面。小麥拔節期將經上述方法處理的牙籤嵌入到小麥植株貼近地面的基部第12葉鞘之間，每株系接種15個莖稈，噴霧保溼7天。於小麥乳熟期調查紋枯病發病情況，計算株系平均病情指數，根據病情指數判定小麥植株的紋枯病抗性。病情嚴重度判定標準如下0級無病症；1級葉鞘有典型的紋枯病病斑，但不侵莖；2級病菌侵人莖稈，病斑寬度環莖不超過莖稈周長的1/2;3級病菌侵人莖稈，莖稈上病斑環莖寬度在1/2-3/4莖稈周長之間；4級病菌侵人莖稈，莖稈上病斑繞莖稈3/4以上，或莖稈已軟腐；5級枯孕穗或枯白穗。病情指數按以下公式計算病情指數=[(E各級病株數X各級代表值)/(總株數X最高級代表值)]X100紋枯病抗性判定標準病情指數《20為"高抗"；20<病情指數《50為"抗病"；50<病情指數《80為"感病"；80<病情指數《100為"高感"。紋枯病抗性鑑定結果見表l，受體對照親本的病情指數為80.0，屬高感類型，23個導入天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因的T5代純合株系的平均病情指數在21.0-46.0之間，都屬於抗病類型，表明由於雙價基因的導入，可以使轉基因植株的紋枯病抗性得到大幅提高。表1揚麥158轉基因T5代純合株系的紋枯病抗性鑑定結果tableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8序列表〈110〉江蘇省農業科學院〈120〉一種提高小麥紋枯病抗性的方法〈130〉〈160>6〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉105〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉1atggttgtttgtgcatgtagacgtgcactttgttteccacgtgaacgtcgtgcaggtttt60tgtagaattcgtggtagaattcatccactttgttgtcgtcgttga105〈210>2〈211〉393〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>2atgagggtacggttgaattcgggccacc朋ggctacctattcateateg;aaaacgattgtgtetgggcatcagg朋cc朋cggaaaggccggcaacctccttetttetegcggtegcaggaacggteactactetctgatccttcagaga朋t朋tgcgatttgggc朋cccacacc朋ccacagc朋cggcacagcggcggcgtctggc〈210>3〈211>24〈212>DNA人工序列〈400>3ctagcacaaggcggctecctattc〈210〉4〈211>24〈212>DNA人工序列〈400>4gcagtgatttcagcatttccaacg〈210〉5〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5atggttgtttgtgcatgtag〈210>6〈211>20DNA〈213〉人工序列〈400>6c朋cgacgac朋c朋3gtggcttgataccgggggctcEigtagc卿aggc60aatcttgtcttetetgateacaacagagcg120tetggctgtgtgctteagatgcag朋tgat180gc朋tetgggc朋gc朋cacc朋tcgcc朋240gatcgteacgtcgtcatetecgataattct300gttgg￡l￡l￡ltgctgaaatcactgccatccca360tgEl39324242020權利要求一種提高小麥紋枯病抗性的方法，其特徵在於以下步驟a、構建天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因的表達載體pAHC-NP-GAFP；b、通過基因槍法將天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因表達載體pAHC-NP-GAFP導入受體小麥幼胚細胞；c、對所述的小麥幼胚細胞進行愈傷誘導、植株再生，獲得轉基因待選植株；d、對上述轉基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉基因植株，陽性轉基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T5代轉基因純合株系；e、對T5代轉基因純合株系後代進行紋枯病抗性篩選；f、篩選出紋枯病抗性提高的轉基因植株。2.根據權利要求1所述的一種提高小麥紋枯病抗性的方法，其特徵在於所述的天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因的表達載體pAHC-NP-GAFP通過以下步驟獲得A、製備質粒pAHC-NP:以pAHC25為基礎質粒，採用限制性內切酶XbaI和BglII對pAHC25質粒DNA進行部分酶切，切除質粒含有的bar基因，0.8%瓊脂糖電泳，回收9.1Kb左右DNA酶切大片段，以T4DNA連接酶與seql連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，轉化後的大腸桿菌DH5a細胞懸液塗布含100mg/L氨苄青黴素的平板，對抗氨苄青黴素的陽性克隆進行擴增並提取質粒，採用測序和酶切的方法驗證連接的正確性，獲得的質粒命名為pAHC-NP;B、製備pAHC-NP-GAFP表達載體pAHC-NP質粒DNA採用限制性內切酶SmaI和SacI完全酶切，切除質粒含有的GUS基因，O.8%瓊脂糖電泳，回收7.3Kb左右DNA酶切大片段，以!V)NA連接酶與Seq2連接，轉化大腸桿菌，對抗100mg/L氨苄青黴素的陽性克隆進行擴增並提取質粒，採用測序和酶切的方法驗證連接的正確性，獲得的質粒命名為pAHC-NP-GAFP即為天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因的表達載體。3.根據權利要求2所述的一種提高小麥紋枯病抗性的方法，其特徵在於所述的seq1為ATGGTTGTTTGTGCATGTAGACGTGCACTTTGTTTACCACGTGAACGTCGTGCAGGTTTTTGTAGAATTCGTGGTAGAATTCATCCACTTTGTTGTCGTCGTTGA;所述seq2為ATGAGGGTACGGTTGAATTCGGGCCACCAACTTGATACCGGGGGCTCAGTAGCAGAAGGCGGCTACCTATTCATAATAGMAACGATTGTMTCTTGTCTTATATGATAACMCAGAGCGGTATGGGCATCAGGAACCAACGGAAAGGCCTATGGCTGTGTGCTTAAGATGCAGAATGATGGCAACCTCCTTATTTATAGCGGTAGCAGGGCAATATGGGCAAGCAACACCAATCGCCAAAACGGTAACTACTATCTGATCCTTCAGAGAGATCGTAACGTCGTCATATACGATAATTCTAATAATGCGATTTGGGCAACCCACACCAACGTTGGAAATGCTGMATCACTGCCATCCCACACAGCAACGGCACAGCGGCGGCGTCTGGCTGA。4.根據權利要求1所述的一種提高小麥紋枯病抗性的方法，其特徵在於所述的分子檢測為PCR分析方法。5.根據權利要求1所述的一種提高小麥紋枯病抗性的方法，其特徵在於抗小麥紋枯病的應用。全文摘要本發明涉及分子生物學領域，具體涉及通過採用基因工程方法將天麻的抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因導入常規小麥並表達，增加小麥的紋枯病抗性；一種提高小麥紋枯病抗性的方法，在於以下步驟構建天麻抗真菌蛋白基因和兔防禦素基因的表達載體pAHC-NP-GAFP；通過基因槍法將pAHC-NP-GAFP導入受體小麥幼胚細胞，對小麥幼胚細胞愈傷誘導、植株再生，獲得轉基因待選植株，通過分子檢測，獲得陽性轉基因植株，陽性轉基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T5代轉基因純合株系；對T5代轉基因純合株系後代進行紋枯病抗性篩選；篩選出紋枯病抗性提高的轉基因植株。其優點在於與常規的種質培育方法相比，具有針對性強、培育周期短、對重要農藝性狀影響小的特點。文檔編號A01H1/02GK101696420SQ200910210538公開日2010年4月21日申請日期2009年11月9日優先權日2009年11月9日發明者任麗娟,餘桂紅,周淼平,孫曉波,張旭,張鵬,馬鴻翔申請人:江蘇省農業科學院;