檢測血中3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸的試劑盒的製作方法

2023-05-17 06:28:01

專利名稱：檢測血中3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及分析化學和醫學領域，是一種基於檢測血中3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸 和甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCS和GCDCA)的試劑盒對人血液進行超高效液相色譜質譜聯用高溫 高速分析，以快速定量測定血中G⑶CS和G⑶CA的技術。
背景技術：
肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一。肝癌或者起始於肝臟本身，或者來源於身體其 他癌症細胞的轉移作用。原發性肝癌是指肝細胞或肝內膽管細胞發生的惡性腫瘤，起始於 肝臟的原發性肝癌的發病率一直是肝臟惡性腫瘤之首。在惡性腫瘤死亡率中僅次於胃癌和 食道癌而居第三位，在部份地區的農村中則佔第二位，僅次於胃癌。我國每年死於肝癌約11 萬人，佔全世界肝癌死亡人數的45%。近年來，我國原發性肝癌的發病率、死亡率有上升趨 勢，而農村明顯高於城市。在我國，肝癌主要和乙型、C型肝炎病毒感染以及肝硬化等疾病相關。肝癌的早期 症狀經常不明顯，多數病人無症狀，體檢亦缺乏腫瘤本身的體徵，此期稱之為亞臨床階段。 肝癌一旦出現症狀，表示患者大多已進入中晚期。目前，中晚期肝癌缺乏有效治療手段。因 此，肝癌的早期診斷非常重要，如積極綜合治療，可使肝癌的五年生存率有顯著性提高。一 般影像學檢查和體格檢查作用有限，往往到了中、晚期才能夠發現和確診，缺少預警價值。 隨著分子生物學的不斷發展，多種新型標誌物不斷發現，提高了肝癌在亞臨床階段的早期 診斷率，使治療效果得到改善。目前最常用的肝癌血清標誌物為甲胎蛋白(AFP)。然而甲胎 蛋白(AFP)血清水平在診斷肝癌時存在敏感性和特異性較低的缺點，單獨用於確診時的檢 出率一般只有50% -75%左右。因此，為了提高臨床診斷的靈敏度和特異性，開發新的檢測 方法勢在必行。膽汁酸是由肝實質細胞在線粒體中以膽固醇為原料直接合成的，經輸膽管運輸後 在膽囊中濃縮，是存在於膽汁中的一大類膽烷酸的總稱。作為膽固醇代謝的主要產物，膽汁 酸具有類似的固醇核心結構和不同結合體的支鏈結構。人體內主要含有5種游離型膽汁 酸以及10種其與甘氨酸、牛磺酸結合的結合型膽汁酸；同時，人體內也含有少量的3羥基 位結合的單硫酸化膽汁酸。膽汁酸一直被認為僅具有促進脂類的消化和吸收、維持膽汁酸 分泌的動態平衡、抑制膽固醇在膽汁中析出沉澱而形成膽結石以及在病毒性肝炎和膽道堵 塞等疾病中輔助診斷等生理功能。近年來，膽汁酸越來越引起人們的重視，其被認為是一 種多功能的重要信號分子，在能量動態平衡(文獻1 Watanabe，M. ；Houten, S. M. ；Mataki, C. ；Christoffolete, Μ. A. ；Kim, B. W. ；Sato, H. ；Messaddeq, N. ；Harney, J. W. ；Ezaki, 0. ；Kodama, T. ；Schoonjans, K. ；Bianco, Α. C. ；Auwerx, J. Nature 2006,439,484-489.文 獻 2 =Baxter, J. D. ；Webb，P. Nature 2006，439，402-403·)、磷脂代謝(文獻 3 =Martin, F. P. J. ；Dumas, Μ. Ε. ；Wang, Y. L. ；Legido-Quigley, C. ；Yap, I. K. S. ；Tang, H. R. ；Zirah, S. ；Murphy, G. Μ. ；Cloarec, 0. ；Lindon, J. C. ；Sprenger, N. ；Fay, L. B. ；Kochhar, S. ；vanBladeren, P. ；Holmes, Ε. ；Nicholson, J. K. MolecularSystems Biology 2007,3,16.文 獻 4 :Bilz, S. ；Samuel, V. ；Morino, K. ；Savage, D. ；Choi, C. S. ；Shulman, G. I. American Journal of Physiology-Endocrinologyand Metabolism 2006,290, E716-E722.)> H^ 謝(文獻 5 :Nguyen，Α· ；Bouscarel, B. Cellular Signalling 2008，20，2180-2197.文 獻 6:Brinton，Ε. A. Diabetes Obesity & Metabolism 2008，10，1004-1011.)以及細胞增 M^iJlt ( i^ 7 :Metalli, V. D. ；Mancino, Μ. G. ；Mancino, Α. ；Torrice, Α. ；Gatto, Μ.； Attili, Α. F. ；Alpini, G. ；Alvaro, D.Digestive and Liver Disease 2007,39,654-662. 文獻 8 Ramalho, R. Μ. ；Viana, R. J. S. ；Low, W. C. ；Steer, C. J. ；Rodrigues, C. Μ. P. Trends in Molecular Medicine 2008，14，54_62.)等整合調節中起重要調節作用。近年來，隨著人 們對腫瘤學認知的不斷加深，惡性腫瘤被更多的認為是一種系統性的慢性疾病。以原發性 肝癌為例，其多由肝炎肝硬化等慢性疾病發展而成。當人體遭受肝膽疾病尤其是惡性腫瘤 侵襲時，肝臟的基本單位——肝實質細胞的代謝將受到癌症刺激而使膽汁酸的代謝發生變 化。雖然血清總膽汁酸(TBA)含量已被廣泛應用於病毒性肝炎和肝硬化等慢性疾病的輔助 診斷當中，但其在肝癌診斷中的作用極為微小。並且因為血清總膽汁酸含量是基於3羥基 固醇酶法測定的，其並不能反映當人體遭受原發性肝癌時，體內各個膽汁酸的變化情況。有 鑑於此，測定血中各膽汁酸的含量變化情況有利於我們了解肝細胞的代謝變化，以便找出 有效的潛在標誌物以開發和建立檢測肝癌的新方法。 目前檢測膽汁酸的常用方法有酶法、核磁共振、氣相色譜和液相色譜以及與其 聯用的紫外吸收、螢光散射、質譜等。臨床酶法可快速檢測總膽汁酸，卻不能準確定量各 個單獨膽汁酸的含量(文獻 9Mashige，F. ；Tanaka, N. ；Maki, A. ；Kamei, S. ；Yamanaka, M. Clinical Chemistry 1981，27，1352-1356.)；核磁共振技術雖然具有快速和無偏向 性的特點，但與其它技術相比靈敏度太低且花費較大；氣相色譜及其質譜聯用技術預處 理過程冗繁，且結合型膽汁酸易分解為游離型膽汁酸(文獻IO=Keller, S. Jahreis,
G.Journalof Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedicaland Life Sciences 2004,813,199-207.文 ^ 11 :Roda, A. ；Piazza, F. ；Baraldini, Μ. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedicaland Life Sciences 1998，717，263-278.文 獻 12 :Makino，I. ；Shinozak. K ；Nakagawa, S.； Mashimo，K. Journal of Lipid Research 1974，15，132-138.);常規液相色譜技術存在 檢測靈敏度低或衍生化過程複雜等缺點(文獻11 :Roda，A. ；Piazza, F. ；Baraldini, M. Journal of Chromatography B-AnalyticalTechnologies in the Biomedical and Life Sciences 1998，717，263-278.文獻 13 Sakakura, H. ；Kimura，N. ；Takeda，H. ；Komatsu，
H.；Ishizaki，K. ；Nagata，S. Journal of Chromatography B 1998，718，33-40.)。 隨 著液相色譜質譜聯用技術的發展，高靈敏度和高分離度的特性不斷得到提升，在複雜體 液分析測試膽汁酸中獲得廣泛應用(文獻14:Alnouti，Y. ；Csrnaky，I. L. ；Klaassen, C. D.Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedicaland Life Sciences 2008，873，209-217.文獻 15 Bobeldijk，I. ；Hekman, Μ. ；deVries-van der Weij, J. ；Coulier, L. ；Ramaker, R. ；Kleemann，R. ；Kooistra，Τ. ；Rubingh, C.； Freidig，Α. ；Verheij, Ε. Journal of Chromatography B-AnalyticalTechnologies in the Biomedical and Life Sciences 2008，871，306-313·文獻 16 :Tagliacozzi，D.；Mozzi, A. F. ；Casetta, B. ；Bertucci, P. ；Bernardini, S. ；Di Ilio, C. ；Urbani, A.； Federici, G. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 2003,41,1633-1641. 文獻 17 :Ye，L ；Liu, S. Y. ；Wang, Μ. ；Shao, Y. ；Ding，Μ. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical andLife Sciences 2007，860，10-17. 文獻 18 :Ando，M. ；Kaneko, Τ. ；Watanabe, R. ；Kikuchi, S. ；Goto，Τ. ；Iida，Τ. ；Hishinuma， Τ. ；Mano, N. ；Goto，J. Journal οfPharmaceutica1 and Biomedical Analysis 2006， 40，1179-1186.文獻 19 :Burkard，I. ；von Eckardstein，A. ；Rentsch，K.M. Journal of ChromatographyB-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 2005,826，147-159.)；尤其是超高效液相色譜技術由於具有更高的分離度、解析度以及更 短的分析時間等特點而備受人們青睞3。但這些技術只能檢測到人體內常規的15種膽汁 酸，並不能檢測到任何單硫酸化膽汁酸。而用於檢測單硫酸化膽汁酸的方法較少，其預處理 過程冗繁，採用多步SPE柱分離得到硫化膽汁酸，且具有離子抑制效應大，分離度低，只能 用於檢測單硫酸化膽汁酸等缺點(見參考文獻=Ikegawa S，Yanagihara T，Murao N, etc. J0URNAL0F MASS SPECTROMETRY. 1997，32，401-407.)。目前，還沒有一種快速高效的方法既 能夠檢測到人體內的常規膽汁酸又能檢測到硫酸化膽汁酸，並且還沒有人將各個膽汁酸的 變化情況與原發性肝癌聯繫起來。(文獻 20 =Administration, F. a. D. 2001.)本發明提供了一種用於快速檢測血中3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸 的試劑盒，該試劑盒無需複雜的SPE預處理過程，不但檢測血中3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸/ 時通量高，並且具有檢測成本低、重複性好以及穩定性高的特點。

發明內容
本發明的目的是開發一種檢測血中3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸的 試劑盒。使用該試劑盒檢測血中3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸的方法具有檢 測成本低，重複性好，穩定性高，快速高效的特點；測定一個實際樣本只需19分鐘，適於臨 床應用。為實現上述目的，本發明採用的技術方案如下該試劑盒由三部分構成⑴內標一異亮氨酸鳥菲肽或膽汁酸同位素標準品；⑵ 緩衝液-PH 4. O 8. O的醋酸銨；(3)洗脫液一乙腈或甲醇。本試劑盒選用異亮氨酸鳥菲肽作為內標，可降低分析成本並加強檢測準確性；採 用PH = 5. O的緩衝液醋酸銨、洗脫液乙腈體系可以得到最好的分離效果並達到快速分離分 析3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸的目的。本發明還開發了基於檢測試劑盒的 使用條件，並在正常對照、肝炎、肝硬化和肝癌樣本中進行了應用。具體步驟如下，1)選取試劑盒最佳組成內標選擇為異亮氨酸鳥菲肽(也可使用各種膽汁酸同位 素作為內標14』15』18，但因其價格昂貴而較少用於實際應用中)，可以有效降低分析成本並加 強檢測準確性；緩衝液選擇PH = 5. O的醋酸銨；洗脫液選擇乙腈體系(也可選擇pH 4. O 8.0的醋酸銨和乙腈(甲醇)體系，但這些體系的分析速度較慢且各膽汁酸分離度也較差)。
2)試劑盒使用條件色譜儀器為Waters超高效液相色譜，色譜柱為C8柱，柱溫60 攝氏度，流速0. 5ml/min (也可選用C18色譜柱，柱溫25 60攝氏度，流速0. 2 1. Oml/min 的條件來分析膽汁酸，但因這些方法分離速度較慢且各膽汁酸分離度較差而未採用14-19)， 質譜儀器為單四極杆質譜。3)在相同條件下取早晨空腹正常人和確診的肝炎、肝硬化和肝癌患者的離體血 清，採集後於4°C靜置半小時、9000g條件下離心15分鐘取上清(血清)後立即儲存於-80°C 的冰箱中備用。4)血清樣品預處理樣品待測時室溫解凍，取150 μ 1血清，加入600 μ 1乙腈、 30 μ 1異亮氨酸鳥菲肽的濃度為3.3 μ g/ml乙腈水溶液(乙腈水體積比為1 1)，振蕩30 秒，4°C 9000g條件下離心15分鐘後取650μ1上清液凍幹，採用體積比為1 3的乙腈水 混合溶液100 μ 1復溶後4°C 9000g條件下離心15分鐘取上清後直接上樣分析，通過總離 子流圖計算內標峰、3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸以及甘氨鵝脫氧膽酸的峰面積，以確定3-硫酸 甘氨鵝脫氧膽酸以及甘氨鵝脫氧膽酸的含量。5)對4組血清樣本按隨機順序依次進行超高效液相色譜質譜高溫高速分析，並 對血液膽汁酸的分析方法進行了標徵，要求14種膽汁酸標準品的線性方程、單針進樣重複 性、回收率以及日間和日內精密度均符合美國食品與藥物管理局(FDA)檢驗標準13。6)在血清樣本測試中，G⑶CS在肝癌組中相對正常組有顯著性升高。G⑶CS判斷肝 癌的靈敏度為75. 56%，特異性為88. 89% ；而採用AFP判斷肝癌的靈敏度為62. 2%，特異 性為100%。而在45例肝癌樣本中有17例AFP值小於20ug/L(假陰性)的樣本，我們通過 G⑶CS判斷，發現其中14例樣本大於0.21 (陽性結果)，可以判斷其為肝癌。這說明G⑶CS 與AFP具有較好的互補性，可用於輔助AFP進行原發性肝癌普篩。為了進一步考察GCDCS在臨床中的應用潛力以及其在肝癌發生中的機制，肝炎和 肝硬化組血中的G⑶CS、其上遊代謝物G⑶CA及其相關參數G⑶CS/G⑶CA與正常對照和肝癌 組進行了比較，發現GCDCS在在肝炎和肝硬化中的含量更高。GCDCA在正常對照組、肝炎、肝 硬化和肝癌組的含量變化，發現其變化趨勢近似於GCDCS。但其在肝癌組中的含量相對於正 常組有升高但無顯著性。而GCDCS/GCDCA在肝癌組中相對於三組非肝癌組都是顯著性升高 的。通過ROC曲線分析，只有G⑶CS/GOTCA與AFP沒有顯著性，說明G⑶CS/G⑶CA更具有應 用潛力。採用G⑶CS/G⑶CA判斷肝癌的靈敏度為68. 89%，特異性為86. 15% ；而採用AFP 判斷肝癌的靈敏度為62.2%，特異性為89.2%。而在45例肝癌樣本中有17例AFP值小於 20ug/L (假陰性)的樣本，我們通過G⑶CS/GOTCA判斷，發現其中10例樣本大於0. 097 (陽 性結果)，可以判斷其為肝癌。這說明GCDCS/GCDCA與AFP具有較好的互補性，可用於輔助 AFP進行原發性肝癌的診斷。本發明方法具有的效果是組成試劑盒的內標異亮氨酸鳥菲肽可以有效降低分析 成本並加強檢測準確性；緩衝液選擇PH = 5. O的醋酸銨和乙腈體系，可以得到最好的分離 效果，不但能檢測到血中的15種常規膽汁酸，並且可以檢測到3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸等幾 種硫酸化膽汁酸。基於試劑盒開發的方法具有以下特點樣本的採集、儲存採用了標準化操 作程序，避免引入人為誤差；預處理過程簡單，分析過程採用高溫高速的方法，此方法不僅 提高了對被分析物的分離分辯能力，而且大大縮短了分析時間，既能分離常規膽汁酸，又能 夠同時分離幾種硫酸化膽汁酸。在血清樣本測試中，GCDCS/GCDCA可輔助AFP進行原發性肝癌的診斷。採用這種方法建立的診斷肝癌的方法，具有安全可靠、通量高、靈敏度和特異 性高的特點，適於肝癌的早期篩查和輔助診斷。


圖1人血清膽汁酸TIC圖1，亮氨酸腦菲肽(內標)；2，3-硫酸甘氨熊脫氧膽酸 (GUDCS) ；3，3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸(GOTCS) ；4，3-硫酸甘氨脫氧膽酸(⑶CS) ；5，甘氨熊脫 氧膽酸(GUDCA) ；6，牛璜鵝脫氧膽酸(TUDCA) ；7，甘氨膽酸(GCA) ；8，牛璜膽酸(TCA) ；9，甘 氨鵝脫氧膽酸(GOTCA) ；10，牛璜鵝脫氧膽酸CTCDCA) ；11，甘氨脫氧膽酸(⑶CA) ；12，牛璜 脫氧膽酸(TDCA) ；13，膽酸(CA) ；14，熊脫氧膽酸(UDCA) ；15，甘氨石膽酸(GLCA) ；16，牛璜 石膽酸(TLCA) ；17，鵝脫氧膽酸(CDCA) ；18，脫氧膽酸(DCA) ；19，石膽酸(LCA)。圖2(A)血清G⑶CS在正常對照組、肝癌肝炎、和肝硬化組血清樣本中的含量變化 (均值士標準誤表示)。(B)正常對照組和肝癌組血清樣本中GCDCS和AFP的ROC曲線圖 AUC值分別為GCDCS = 0. 866，AFP = 0. 935。(C)血清GCDCA在正常對照組、肝癌肝炎、和 肝硬化組血清樣本中的含量變化。圖3 (A)，(B)血清GOTCSAXDCA和AFP在正常對照、肝炎、肝硬化和肝癌組中的含 量變化。(C)正常對照、肝炎、肝硬化和肝癌組血清樣本中G⑶CS、AFP以及GOTCSAXDCA的 ROC 曲線圖AUC 值分別為 GCDCS = 0. 653，AFP = 0. 875 以及 GCDCS/GCDCA = 0. 810。
具體實施例方式實施例11.血清樣品收集採集前，納入志願者籤署知情同意書。正常對照、肝炎、肝硬化和原發性肝癌組納入標準參考《黃家駟外科學(第7 版)》人民衛生出版社2008北京在相同條件下收集36例正常人、確診的14例肝炎、15例肝硬化和45例肝癌患者 的血清，採集後於4°C靜置半小時、9000g條件下離心15分鐘取上清後立即儲存於-80°C的 冰箱中備用。2.分析方法2. 1血清樣本預處理樣品待測時室溫解凍，取150 μ 1血清，加入600 μ 1乙腈、30 μ 1異亮氨酸鳥菲肽的 濃度為3.3 μ g/ml乙腈水溶液(乙腈水體積比為1 1)，振蕩30秒，4°C 9000g條件下離 心15分鐘後取650μ1上清液凍幹，採用體積比為1 3的乙腈水混合溶液100 μ 1復溶後 40C 9000g條件下離心15分鐘取上清後直接上樣分析，通過總離子流圖計算內標峰、3-硫 酸甘氨鵝脫氧膽酸以及甘氨鵝脫氧膽酸的峰面積，以確定3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸以及甘 氨鵝脫氧膽酸的含量。2. 2超高效液相色譜質譜高溫高速分析(1)液相條件為色譜儀器為Waters超高效液相色譜，色譜柱為WatersACQUITY UPLC BEH C8柱，流動相A為pH = 5. 0的50mM醋酸氨溶液，B為乙腈；梯度洗脫條件為 0 0. 5min為75% A相，0. 5 3. 5min線性變化至70% A相，3. 5 9min降至45%，9 Ilmin 降至 25%，11 13. 5min 降至 15%，13. 5 15min 降至 10%，並保持 2min，17 17. 5min升至75% A相併保持1. 5min ；流速0. 5mL/min,柱溫60°C，進樣量20 μ L,柱後流出 液不經分流直接進入質譜檢測。(2)質譜條件為質譜儀器為Waters單四極杆質譜，採用電噴霧離子源負離子模 式檢測；脫溶劑氣和錐孔氣流量分為700L/h和50L/h，脫溶劑氣和錐孔氣均為高純氮氣； 脫溶劑氣溫度為300°C，離子源溫度為120°C ；毛細管電壓和錐孔電壓分別為2800V和45V ； 採用選擇性離子監測模式檢測0 2. 6min檢測離子528. 3和554. 3，2. 65 3. 7min檢測 離子 448. 3,464. 3,498. 3 和 514. 3,3. 75 6min 檢測離子 391. 3,407. 3,448. 3 和 498. 3， 6. 05 19min檢測離子375. 3,391. 3,432. 3和482. 3 ；每0. 1秒採集一次數據(圖1)。3.血清測試結果與輔助診斷潛力分析在血清樣本測試中，G⑶CS在正常對照和肝癌組中的含量如圖2A所示。G⑶CS在肝 癌組中有顯著性升高，對G⑶CS和AFP分別作ROC曲線，得到ROC曲線AUC值分別為G⑶CS =0. 866和AFP = 0. 935 (圖2B)。通過比較我們發現，採用G⑶CS來診斷肝癌時不但具有 較高的靈敏度和特異性，並且其與AFP進行聯合診斷更有助於提高檢測肝癌的能力。例如， 在45例肝癌樣本中有17例AFP值小於20ug/L (假陰性)的樣本，我們通過G⑶CS判斷，發 現其中14例樣本大於0. 21 (陽性結果)，可以判斷其為肝癌。說明GCDCS與AFP具有較好 的互補性。表1顯示了 AFP、G⑶CS以及「AFP+G⑶CS」的靈敏性、特異性。為了進一步考察GCDCS在臨床中的應用潛力以及其在肝癌發生中的機制，肝炎和 肝硬化組血中的G⑶CS、其上遊代謝物G⑶CA及其相關參數GOTCSAXDCA與正常對照和肝 癌組進行了比較，發現G⑶CS在在肝炎和肝硬化中的含量更高(圖2A)。G⑶CA在正常對照 組、肝炎、肝硬化和肝癌組的含量變化，發現其變化趨勢近似於GCDCS (圖2C)。雖然其在肝 炎和肝硬化組中顯著性升高，但其在肝癌組中的含量相對於正常組有升高但無顯著性。而 GCDCS/GCDCA在肝癌組中相對於三組非肝癌組都是顯著性升高的(圖3A)。我們對肝癌組和 三組非肝癌組中G⑶CS、AFP以及G⑶CS/G⑶CA分別作ROC曲線，得到ROC曲線AUC值分別為 GCDCS = 0. 653，AFP = 0. 875 以及 GCDCS/GCDCA = 0. 810 (圖 3B)。通過比較我們發現，採 用GCDCS/GCDCA來診斷肝癌時不但具有較高的靈敏度和特異性，並且只有GCDCS/GCDCA與 AFP沒有顯著性，說明GCDCS/GCDCA更具有應用潛力，其與AFP進行聯合診斷更有助於提高 檢測肝癌的能力。例如，採用AFP法檢測肝癌時，45例肝癌患者中有17例呈陰性反應(AFP 0. 097)。這說明G⑶CS/G⑶CA與AFP具有較好的互補性，表2顯示了 GCDCS、AFP、GCDCS/GCDCA 以及 「AFP+GCDCS/GCDCA」 的靈敏度和特異性。表1 AFP與G⑶CS在正常對照組和肝癌組中的靈敏度和特異性
權利要求
1.檢測血中3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸的試劑盒，其特徵在於該試 劑盒由三部分構成(1)內標一異亮氨酸鳥菲肽或膽汁酸同位素標準品；(2)緩衝液一pH 4. 0 8. 0的醋酸銨；(3)洗脫液一乙腈或甲醇。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於選取的試劑盒內標為異亮氨酸鳥菲肽，可 以有效降低分析成本並加強檢測準確性。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於選取的試劑盒緩衝液為pH= 5. 0的醋酸 銨、洗脫液為乙腈，可以得到最好的分離效果並達到快速分離分析3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸 和常規膽汁酸的目的。
全文摘要
本發明公開了一種檢測血中3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸的試劑盒，該試劑盒由內標異亮氨酸鳥菲肽、緩衝液醋酸銨和乙腈組成。使用該試劑盒檢測血中3-硫酸甘氨鵝脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸的方法具有檢測成本低，重複性好，穩定性高，快速高效的特點；測定一個實際樣本只需19分鐘，適於臨床應用。
文檔編號G01N30/02GK101995441SQ20101010838
公開日2011年3月30日 申請日期2010年2月10日 優先權日2010年2月10日
發明者尹佩源, 湯靚, 洪毅, 王文昭, 王紅陽, 許國旺, 談冶雄, 路鑫 申請人:中國科學院大連化學物理研究所;中國人民解放軍第二軍醫大學東方肝膽外科醫院