一種檢測與結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關基因的多態性的試劑盒及其應用的製作方法
2023-05-17 05:51:51 1
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種檢測與結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關基因多態性的試劑盒及其應用。
背景技術：
FCGR2A基因編碼的蛋白是巨噬細胞和中性粒細胞表面的免疫球蛋白Fc受體，參與吞噬和清除免疫複合體的生物學過程。人類FCGR2A基因位於1q23，含有6個外顯子，編碼317個胺基酸，編碼蛋白為35KD。研究發現，表達於免疫系統細胞的球蛋白Fc區段受體與自身抗體或者自身免疫病中免疫複合物觸發的致病過程相關，也與某些免疫治療的有效性相關。此外，研究報導FCGR2A基因多態性與多種疾病相關，例如4541T（rs1801274）多態性與淋巴瘤、瘧疾、系統性紅斑狼瘡等疾病相關。
FCGR3A編碼免疫球蛋白G的Fc段受體，參與抗體依賴的反應中抗原-抗體複合物的清除。人類FCGR3A基因位於1q23，含有6個外顯子，編碼290個胺基酸，編碼蛋白為33KD。研究發現，表達於免疫系統細胞的球蛋白Fc區段受體與自身抗體或者自身免疫病中免疫複合物觸發的致病過程相關，也與某些免疫治療的有效性相關。此外，研究報導FCGR3A基因多態性與多種疾病相關，例如5872G（rs396991）與愛滋病的易感性和進程、克羅恩氏病和風溼性關節炎等疾病相關。
研究報導FCGR2A基因和FCGR3A基因多態性與多種疾病相關，並且可以採用不同的基因分型方法來檢測。溶解曲線法及質譜分型是針對大樣本多位點的高通量分型方法，而Taqman探針法是中通量分型的金標準，具有靈敏性高、花費相對較少的優點。Taqman探針法是在PCR上下遊引物間選取一段序列作為探針，並在探針上標記螢光基團和淬滅基團，該探針可與模板結合，在延伸反應中，當引物合成至探針與模板結合處時，Taq酶的5』外切酶活性可以降解探針5』端，使螢光基團和淬滅基團分離，釋放螢光。相對於傳統的限制性片段長度多態性聚合酶鏈式反應（PCR-RFLP），Taqman探針法具有靈敏性更高、操作更簡單的優勢，且通量更高。
技術實現要素：
本發明旨在提供一種檢測與結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關基因的多態性的試劑盒，該試劑盒可用於製備與結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關的基因多態性的試劑。
為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
所述檢測與結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關的基因多態性試劑盒中含有檢測FCGR2A基因4541T位點和/或FCGR3A基因5872G位點的探針和引物，所述探針和引物能與FCRG2A基因4541T位點和FCGR3A基因5872G位點前後的基因序列特異性結合併擴增出包含FCRG2A基因4541T位點和/或FCGR3A基因5872G位點的基因序列。
優選的，所述探針和引物是與FCRG2A基因4541T位點和/或FCGR3A基因5872G位點前後500bp的基因序列特異性結合併能擴增出包含FCRG2A基因4541T位點和/或FCGR3A基因5872G位點的基因序列。
優選的，所述檢測與結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關基因的多態性的試劑盒中含有如下探針：
FCGR2A：FAM-TCCAAACGGGAGAATT-MGB(SEQ ID NO.1);
VIC-TGGGATCCAAATGG-MGB(SEQ ID NO.2);
FCGR3A：FAM-AGGGGGCTTGTTG-MGB (SEQ ID NO.3);
VIC-CAGGGGGCTTTTTG-MGB (SEQ ID NO.4);
該試劑盒中還含有如下引物：
FCGR2A-F：5』-TTTGCTTGTGGGATGGAGAAG-3』 (SEQ ID NO.5)
FCGR2A-R：5』-TGAGGTGCCACAGCTGGAA-3』 (SEQ ID NO.6)
FCGR3A-F：5』- CTCAAAGACAGCGGCTCCTACTT -3』 (SEQ ID NO.7)
FCGR3A-R：5』- GGTGATGTTCACAGTCTCTGAAGACA -3』 (SEQ ID NO.8)
其中，FAM吸收波長485-505nm，發射波長515-530nm；VIC吸收波長515-535nm，發射波長540-560nm；MGB為淬滅基團。所述與結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關基因為FCGR2A基因4541T和FCGR3A基因5872G。
所述試劑盒中每條引物濃度為900nM，每個探針濃度為250nM。
試劑盒中還包括探針型PCR反應液（2X）和無核酸酶無菌純水。
所述探針、引物及包含兩者的試劑盒均可用於製備檢測與結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關基因多態性的試劑。
FCRG2A基因4541T位點用於製備檢測與結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性的製劑中的應用。
FCGR3A基因5872G位點用於製備檢測與結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性的製劑中的應用。
FCGR2A基因4541T和FCGR3A基因5872G可能通過增加病人的無進展生存期而具有更好的對西妥昔單抗的藥物應答，從而與結直腸癌的靶向用藥西妥昔單抗的治療敏感性相關，之前並無相關報導。
FCGR2A基因4541T位點位於FCGR2A基因內部，在中國漢族人群中，其最小等位基因頻率（Minor Allele Frequency,MAF）為33.5%；FCGR3A基因5872G位點位於FCGR3A基因內部，在中國漢族人群中，其最小等位基因頻率為32.89%。目前，還沒有FCGR2A基因4541T和FCGR3A基因5872G多態性與西妥昔單抗治療敏感性相關的檢測試劑盒產品面世，因此，探索檢測與結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗的治療敏感性相關基因的多態性的方法和產品顯得意義深遠。
有益效果：本發明的試劑盒能準確、快速、簡便的檢測與結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關的基因位點（FCGR2A基因4541T和FCGR3A基因5872G的多態性）。
附圖說明
圖1為實施例中FCGR2A 4541T位點方法驗證的螢光散點圖；
圖2為實施例中FCGR3A 5872G位點方法驗證的螢光散點圖；
圖3為實施例中FCGR2A 4541T位點實驗樣本的螢光散點圖；
圖4為實施例中FCGR3A 5872G位點實驗樣本的螢光散點圖。
具體實施方式
實施例1
1.設計Taqman探針及引物
1.1查找FCGR2A基因4541T位點前後500bp序列
在PUBMED GENE資料庫中搜索FCGR2A，選擇NG_012066.1，在Fasta sequence中可以獲得此多態位點前、後500bp的序列（SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10）,用於尋找合適的探針和引物。
GTGCCAGGCTTTCTGGAGTGAATGGCTATAACATGAGCCATGAGAAGAAACGAGGCAAACCTCAGCTCTTAGGAATGCCCAGGAGCTTAGGGAACCTCTGCATCAATGAGGGAGCTCTGCTTCACTGCCATCTTTAGTCTGGGGCCTACATTTCAAAGTGAAACAACAGCCTGACTACCTATTACCTGGGACGTGAGGGCTCCAAGCTCTGGCCCCTACTTGTTGGTCAATACTTAGCCAGGCTTCCACCCCACTCCTCTTTGCTCCAGTGCCCAATTTTGCTGCTATGGGCTTTCTCAGACCTCCATGTAGGCCCATGTGACCTCAGCCCTTGTCCATCCCCTCTTCTCCCCTCCCTACATCTTGGCAGACTCCCCATACCTTGGACAGTGATGGTCACAGGCTTGGATGAGAACAGCGTGTAGCCTATGTTTCCTGTGCAGTGGTAATCACCACTGTGACTGTGGTTTGCTTGTGGGATGGAGAAGGTGGGATCCAAA（SEQ ID NO.9）；
Y（Y是指FCGR2A基因4541T位點）
GGGAGAATTTCTGGGATTTTCCATTCTGGAAGAATGTGACCTTGACCAGAGGCTTGTCCTTCCAGCTGTGGCACCTCAGCATGATGGTTTCTCCCTCCTGGAACTCCAGGTGAGGGGTCTGGAGCACCAGCCATTCTGAAAGACACAAATATGATAAGAAAAAGTTGTAAGGATAGATTCCAAGGGTTTTTCAGTCTCAGAGGTACGTTACTCACAGAACTTGACATGATGTCTGGCAGACAGAAATGAAGATGCTTCATGACAGATGTGAGCATTCTCTTATAGGCAATATATGGTATTATATCTGTGGGACTTCTAAAAGCAGAAGTTTTCAGAGGTTTCAAAGATGCAGAGCAGATATTTAAAACAATTCTGAGGAATTTAAAATACTACGTTTGAGTAGAGAAATGAGCGCATTTCAGTAACTGTAGAGGCTACTCGACAGGGCCTGAAGCCGTCAGTTTTTGTGGTCTGGGGATTACTAATTTAATGGTAAATTT（SEQ ID NO.10）。
在PUBMED SNP資料庫中搜索FCGR3A，選擇rs396991，進入Gene View，選擇NM_001127593.1，在Fasta sequence中可以獲得此多態位點前、後500bp的序列（SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12），用於尋找合適的探針和引物。
CTGCAGATATGCTCATCGTTGCTTCTCACTTACCTCATTGCTTAGTCCCTCTGCTCTAACCCTGTGTGTTGATCACATGTGTGTGTGTCCCTCTTCCCCATTAGACAAAGGTCTTGGTATGACTTCAGTTCTCTTGCAGGGCCCCATCAGCTCTTCCCCAAAGGGAGCTATGCAGGGTTGACTCCCAATCTGGCTTTCCCTTATGTCTCAGGATCTGGGTGGTACGTGGCCCCTTCACAAAGCTCTGCACTGAGAGCTGAGGCCTCCCGGGCCTGGGGTGTCTGTGTCTTTCAGGCTGGCTGTTGCTCCAGGCCCCTCGGTGGGTGTTCAAGGAGGAAGACCCTATTCACCTGAGGTGTCACAGCTGGAAGAACACTGCTCTGCATAAGGTCACATATTTACAGAATGGCAAAGGCAGGAAGTATTTTCATCATAATTCTGACTTCTACATTCCAAAAGCCACACTCAAAGACAGCGGCTCCTACTTCTGCAGGGGGCTT（SEQ ID NO.11）；
Y（Y是指FCGR3A基因5872G位點）
TTGGGAGTAAAAATGTGTCTTCAGAGACTGTGAACATCACCATCACTCAAGGTGAGACATGTGCCACCCTGGAATGCCCAGGGACGCCTGTGTGTGGAACCTGCAATCACACTGGGAAGTTGAGTTGGGAGGAGATTCCTGATTCTTACACGCACTTCTTCATATGTGGTTCCCTCCTGGTGATCACCAGGAGGTCCCCAAAAGTCCCTGATTGCAGGGTAGGTTTGCAGCTCTGTTTCAGTCCATTCTTTTGGGGTAGCTAGGAGGTGTCATTCACTCTGCAGCATGATGGCAGGAGCAGAAGCCACATCTCCTCCCCAATAAATACCTCTGTCTTTCCTTACGCTAATCACACCCACGGTGTCATATGTTCCTATCGTGCTGGCCTCCTTCTTATCCAAGCCTTTTAGCCACGATCCAAACTGGCAGGAGCCCCTCATCCCCTCACAGAAAGAGCCCAGAACCTGGGTTCTGGCCCTGCAGCTAATTAACCATCTGAC（SEQ ID NO.12）。
1.2利用PrimerExpress 3.0進行探針和引物的設計
（1）探針設計原則：
1.確保G-C含量在20-80%之間。
2.探針5』端的第一個鹼基不能是G。
3.用Primer Express軟體計算出來的探針Tm值應當在68-70℃之間。
4.探針要儘可能地短，但是不要短於13個鹼基。
5.避免同一鹼基重複過多，特別是G，不可超過4個及以上。
6.儘量使含C多於含G的探針。如果C少於G，則使用互補鏈上的探針。
7.如果是SNP，多態位點儘量位於探針中央。
（2）引物設計原則：
1.在探針確定以後再選擇引物。
2.引物要儘可能地接近探針，但是不要重疊。
3.保持G-C含量在20-80%之間。
4.避免同一鹼基重複過多。特別是G，不可超過4個及以上。
5.用Primer Express軟體計算出來的Tm值應當在58-60℃之間。
6.在3』端的5個鹼基中，G和C鹼基加起來不要超過2個。
（3）Primer Express 3.0操作方法
進入Primer Express 3.0軟體，File/New/選擇Taqman MGB Allelic。粘貼SNP位點前後500bp序列，標定SNP位置並選擇變異類型。然後選擇引物/探針查找，軟體即開始查找合適的引物和探針。若沒有匹配的探針和引物，則可手動設計。
確定FCGR2A基因4541T位點Taqman探針和引物如下：
探針（AB（Applied Biosystems）公司）：
Probe1（C）：FAM-TCCAAACGGGAGAATT-MGB（SEQ ID NO.1）;
Probe2（T）：VIC-TGGGATCCAAATGG-MGB（SEQ ID NO.2）;
FAM吸收波長485-505nm，發射波長515-530nm；VIC吸收波長515-535nm，發射波長540-560nm；MGB為淬滅基團。
引物（博尚生物）：
FCGR2A-F：5』-TTTGCTTGTGGGATGGAGAAG-3』（SEQ ID NO.5）；
FCGR2A-R：5』-TGAGGTGCCACAGCTGGAA-3』（SEQ ID NO.6）;
確定FCGR3A基因5872G位點Taqman探針和引物如下:
探針（AB（Applied Biosystems）公司）：
Probe3（G）：FAM-AGGGGGCTTGTTG-MGB（SEQ ID NO.3）;
Probe4（T）：VIC-CAGGGGGCTTTTTG-MGB（SEQ ID NO.4）;
FAM吸收波長485-505nm，發射波長515-530nm；VIC吸收波長515-535nm，發射波長540-560nm；MGB為淬滅基團。
引物（博尚生物）：
FCGR3A-F：5』- CTCAAAGACAGCGGCTCCTACTT -3』（SEQ ID NO.7）；
FCGR3A-R：5』- GGTGATGTTCACAGTCTCTGAAGACA -3』（SEQ ID NO.8）。
2.SNP檢測
2.1PCR擴增體系及程序
FCGR2A擴增體系（Takara390A）：
Premix Ex Taq (probe qPCR) 2x 10ul
FCGR2A-F primer (10 umol) 0.4ul
FCGR2A-R primer (10 umol) 0.4ul
Probe 1 (10 umol) 0.8ul
Probe 2 (10 umol) 0.8ul
gDNA 2ul
ddH2O 6.4ul
FCGR3A擴增體系（Takara390A）
Premix Ex Taq (probe qPCR) 2x 10ul
FCGR3A-F primer (10 umol) 0.4ul
FCGR3A-R primer (10 umol) 0.4ul
Probe 3 (10 umol) 0.8ul
Probe 4 (10 umol) 0.8ul
gDNA 2ul
ddH2O 6.4ul
程序（Roche LightCycler 480Ⅱ）；
95℃ 30s
[95℃ 5s
60℃ 20s]40循環
擴增產物1（FCGR2A）：112bp
TGAGGTGCCACAGCTGGAAGGACAAGCCTCTGGTCAAGGTCACATTCTTCCAGAATGGAAAATCCCAGAAATTCTCCCATTTGGATCCCACCTTCTCCATCCCACAAGCAAA（SEQ ID NO.13）；
擴增產物2（FCGR3A）：78bp
CTCAAAGACAGCGGCTCCTACTTCTGCAGGGGGCTTTTTGGGAGTAAAAATGTGTCTTCAGAGACTGTGAACATCACC（SEQ ID NO.14）。
2.2 實驗方法準確性驗證
對已知FCGR2A 4541T位點基因型的6個樣本用本檢測方法進行檢測，其中A6/B6為CC基因型，C6/D6為CT基因型，E6/F6為TT基因型已通過質譜分型確認，G6為陰性對照。實驗結果如圖1所示，A6/B6FAM螢光強度（465-510nm）遠大於VIC螢光強度（533-580nm），說明其為CC基因型；C6/D6FAM與VIC螢光強度相當，說明其為CT基因型；E6/F6VIC螢光強度遠大於FAM螢光強度，說明其為TT基因型；G6為陰性對照。我們所建立的Taqman探針法檢測出的對應樣本的基因型與已知基因型完全一致，表明我們的Taqman SNP檢測方法成功建立。
對已知FCGR3A 5872G位點基因型的6個樣本用本方法進行檢測，其中其中A6/B6為GG基因型，C6/D6為GT基因型，E6/F6為TT基因型已通過質譜分型確認，G6為陰性對照。實驗結果如圖2所示，A6/B6FAM螢光強度（465-510nm）遠大於VIC螢光強度（533-580nm），說明其為GG基因型；C6/D6FAM與VIC螢光強度相當，說明其為GT基因型；E6/F6VIC螢光強度遠大於FAM螢光強度，說明其為TT基因型；G6為陰性對照。我們所建立的Taqman探針法檢測出的對應樣本的基因型與已知基因型完全一致，表明我們的Taqman SNP檢測方法成功建立。
2.3實驗樣品SNP檢測
根據上述已建立的Taqman探針法檢測FCGR2A基因4541T多態性的方法，我們對20個實驗樣本進行了分型實驗。A10、A6、A32已知為TT、TC、CC基因型作為實驗過程的參照。實驗結果如表1及圖3所示，其中A32、A6、A10分別為CC、TC、TT 基因型，說明實驗過程無誤；所檢測20例樣本有14例為CC基因型，4例為TC基因型，2例為TT基因型；三種基因型在圖3中呈組內分布集中，組間分布差異明顯。更進一步說明我們成功建立Taqman探針法對FCGR2A基因4541T多態性的檢測方法。實驗樣本結果如表1所示：
表1
根據上述已建立的Taqman探針法檢測FCGR3A基因5872G多態性的方法，我們對20個實驗樣本進行了分型實驗。B5、B83、B28已知為TT、TG、GG基因型作為實驗過程的參照。實驗結果如表2及圖4所示，其中B5、B83、B28分別為TT、TG、GG基因型，說明實驗過程無誤；所檢測20例樣本有5例為TT基因型，7例為TG基因型，8例為TT基因型；三種基因型在圖4中呈組內分布集中，組間分布差異明顯。更進一步說明我們成功建立Taqman探針法對FCGR3A基因5872G多態性的檢測方法。實驗樣本結果如表2所示：
表2
採用本發明所述試劑盒能迅速快捷的檢測FCGR2A 4541T和FCGR3A 5872G多態性，且靈敏度高。
我們收集了200例對結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗敏感的患者和189例對結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗不敏感的患者。對FCGR2A 4541T和FCGR3A 5872G進行基因分型實驗，發現這兩個位點與西妥昔單抗治療敏感性相關（FCGR2A 4541T：p<0.001,OR=0.397,95%CI:0.28-0.61；FCGR3A 5872G：p<0.001, OR=0.23, 95%CI: 0.18-0.47）。此結果表明攜帶FCGR2A 4541T的患者比攜帶C等位基因的患者使用西妥昔單抗治療的敏感性好，攜帶FCGR3A 5872G的患者比攜帶T等位基因的患者使用西妥昔單抗治療的敏感性好。因此，FCGR2A 4541T和FCGR3A 5872G對西妥昔單抗治療結直腸癌具有一定的臨床指導意義。
SEQUENCE LISTING
上海杏園瑞民生物工程有限公司
一種檢測與結直腸癌靶向用藥西妥昔單抗治療敏感性相關基因的多態性的試
劑盒及其應用
14
PatentIn version 3.3
1
16
DNA
人工序列
1
tccaaacggg agaatt 16
2
14
DNA
人工序列
2
tgggatccaa atgg 14
3
13
DNA
人工序列
3
agggggcttg ttg 13
4
14
DNA
人工序列
4
cagggggctt tttg 14
5
21
DNA
人工序列
5
tttgcttgtg ggatggagaa g 21
6
19
DNA
人工序列
6
tgaggtgcca cagctggaa 19
7
23
DNA
人工序列
7
ctcaaagaca gcggctccta ctt 23
8
26
DNA
人工序列
8
ggtgatgttc acagtctctg aagaca 26
9
500
DNA
人工序列
9
gtgccaggct ttctggagtg aatggctata acatgagcca tgagaagaaa cgaggcaaac 60
ctcagctctt aggaatgccc aggagcttag ggaacctctg catcaatgag ggagctctgc 120
ttcactgcca tctttagtct ggggcctaca tttcaaagtg aaacaacagc ctgactacct 180
attacctggg acgtgagggc tccaagctct ggcccctact tgttggtcaa tacttagcca 240
ggcttccacc ccactcctct ttgctccagt gcccaatttt gctgctatgg gctttctcag 300
acctccatgt aggcccatgt gacctcagcc cttgtccatc ccctcttctc ccctccctac 360
atcttggcag actccccata ccttggacag tgatggtcac aggcttggat gagaacagcg 420
tgtagcctat gtttcctgtg cagtggtaat caccactgtg actgtggttt gcttgtggga 480
tggagaaggt gggatccaaa 500
10
500
DNA
人工序列
10
gggagaattt ctgggatttt ccattctgga agaatgtgac cttgaccaga ggcttgtcct 60
tccagctgtg gcacctcagc atgatggttt ctccctcctg gaactccagg tgaggggtct 120
ggagcaccag ccattctgaa agacacaaat atgataagaa aaagttgtaa ggatagattc 180
caagggtttt tcagtctcag aggtacgtta ctcacagaac ttgacatgat gtctggcaga 240
cagaaatgaa gatgcttcat gacagatgtg agcattctct tataggcaat atatggtatt 300
atatctgtgg gacttctaaa agcagaagtt ttcagaggtt tcaaagatgc agagcagata 360
tttaaaacaa ttctgaggaa tttaaaatac tacgtttgag tagagaaatg agcgcatttc 420
agtaactgta gaggctactc gacagggcct gaagccgtca gtttttgtgg tctggggatt 480
actaatttaa tggtaaattt 500
11
500
DNA
人工序列
11
ctgcagatat gctcatcgtt gcttctcact tacctcattg cttagtccct ctgctctaac 60
cctgtgtgtt gatcacatgt gtgtgtgtcc ctcttcccca ttagacaaag gtcttggtat 120
gacttcagtt ctcttgcagg gccccatcag ctcttcccca aagggagcta tgcagggttg 180
actcccaatc tggctttccc ttatgtctca ggatctgggt ggtacgtggc cccttcacaa 240
agctctgcac tgagagctga ggcctcccgg gcctggggtg tctgtgtctt tcaggctggc 300
tgttgctcca ggcccctcgg tgggtgttca aggaggaaga ccctattcac ctgaggtgtc 360
acagctggaa gaacactgct ctgcataagg tcacatattt acagaatggc aaaggcagga 420
agtattttca tcataattct gacttctaca ttccaaaagc cacactcaaa gacagcggct 480
cctacttctg cagggggctt 500
12
500
DNA
人工序列
12
ttgggagtaa aaatgtgtct tcagagactg tgaacatcac catcactcaa ggtgagacat 60
gtgccaccct ggaatgccca gggacgcctg tgtgtggaac ctgcaatcac actgggaagt 120
tgagttggga ggagattcct gattcttaca cgcacttctt catatgtggt tccctcctgg 180
tgatcaccag gaggtcccca aaagtccctg attgcagggt aggtttgcag ctctgtttca 240
gtccattctt ttggggtagc taggaggtgt cattcactct gcagcatgat ggcaggagca 300
gaagccacat ctcctcccca ataaatacct ctgtctttcc ttacgctaat cacacccacg 360
gtgtcatatg ttcctatcgt gctggcctcc ttcttatcca agccttttag ccacgatcca 420
aactggcagg agcccctcat cccctcacag aaagagccca gaacctgggt tctggccctg 480
cagctaatta accatctgac 500
13
112
DNA
人工序列
13
tgaggtgcca cagctggaag gacaagcctc tggtcaaggt cacattcttc cagaatggaa 60
aatcccagaa attctcccat ttggatccca ccttctccat cccacaagca aa 112
14
78
DNA
人工序列
14
ctcaaagaca gcggctccta cttctgcagg gggctttttg ggagtaaaaa tgtgtcttca 60
gagactgtga acatcacc 78