含有bcrf1拮抗物的藥物組合物的製備方法
2023-05-17 08:13:56 2
專利名稱：含有bcrf1拮抗物的藥物組合物的製備方法
技術領域：
本發明涉及通過施用愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)蛋白BCRF1拮抗物治療EBV感染的方法。
EBV是一種普遍存在的人皰疹病毒，其第一次發現與非洲的勃氏淋巴瘤(Burkitt′slymphoma)有關，後來還發現它與鼻咽癌有關，並且是傳染性單核細胞增多症的病原體。傳染通常發生在幼兒時期，一般都無明顯臨床症狀的表現，偶爾表現輕微的症狀。但是在中青年期的感染，則出現傳染性單核細胞增多症，其症狀表現為咽喉炎、發燒和淋巴結病。雖然不適和疲勞有時會延續數周至數月，但是大多數情況下，傳染性單核細胞增多症在1至3周內都會消退。包括扁桃體的嚴重腫大、血小板減少、脾臟破裂、黃疸和腦炎等的併發症偶爾也會出現。在免疫受損害的患者中，例如移植接受者和愛滋病患者，EBV感染會導致B細胞淋巴增生紊亂症。在學校和部隊人口集居的地方，傳染性單核細胞增生症的發病率最高，例如威斯康辛大學學生住院治療率達5%，而部隊每天因患此種病的缺勤率為第四位(參閱Thorley-Lawson，BiochimicaetBiophysicaActa，Vol.948，pgs263-286，1988;Mandell等編Princi-plesandPracticeofInfectiousDiseases一書中由Schooley等著第126章，第2版，JohnWileySons，NewYork，1985)。
利用藥物治療EBV感染者具有顯著的臨床效果，尤其是用於治療免疫受損害患者。
本發明提供了通過施用有效量的EBV蛋白BCRF1拮抗物治療EBV感染的方法。最好BCRF1拮抗物是單克隆抗體或採用常規技術由其產生的組合物。
附
圖1的圖示說明用於產生BCRF1的哺乳動物表達載體。
附圖2的圖示說明用於產生BCRF1的細菌表達載體。
本發明部分是基於發現了BCRF1抑制幹擾素-γ(IFN-γ)-一種細胞防禦病毒感染所需的細胞素-的產生。人們認為，BCRF1是由EBV產生，以提高其在宿主中的生存。本發明方法包括給患者施用有效(或改輕病症)量的BCRF1拮抗物。
本發明的拮抗物以由對BCRF1有特異性的抗體衍生的為佳，本發明的拮抗物尤以含有這種抗體的片段或對BCRF1有特異性的組合物為佳。抗體含有一組由二硫橋鍵連接在一起的多肽鏈。被稱為輕鏈和重鏈的兩個多肽主鏈構成抗體的各種類型的主要結構(同型物)。重鏈和輕鏈又可分為可變區和不變區兩個亞區。重鏈包括一個可變區和三個不同的不變區，輕鏈包括一個可變區(不同於重鏈的可變區)和一個不變區(不同於重鏈的不變區)。重鏈和輕鏈的可變區決定抗體的結合特異性。
本文所述「重鏈可變區」意指多肽為(1)胺基酸的長度為110-125，(2)其胺基酸順序相當於本發明單克隆抗體重鏈的胺基酸順序。與此相似，「輕鏈可變區」意指多肽為(1)胺基酸長度為95-115，(2)其胺基酸順序相當於本發明單克隆抗體輕鏈的胺基酸順序。
本文所述「單克隆抗體」意指能對BCRF1進行特異性結合的免疫球蛋白的均一群體。
本文所述「結合組合物」意指含有兩個多肽鏈的組合物，並且該兩個多肽鏈為(1)在進行操作聯結時具有對BCRF1很高結合親和力的構象，(2)是由對BCRF1具有特異性的雜交瘤產生的單克隆抗衍生的。「操作聯結」意指兩個多肽鏈相對另一個鏈而言通過改變某種方式能夠定位結合，包括諸如Fab或Fv天然抗體片段，或通過遺傳工程方法在羧基末端連接含半胱氨酸的肽聯結子。通常兩個多肽鏈對應於BCRF1特異性單克隆抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區。本發明的拮抗物最好由BCRF1特異性單克隆抗體產生。能夠封阻或中和BCRF1的單克隆抗體可通過它們能夠抑制由BCRF1引起的對幹擾素-γ產生的抑制進行選擇。這樣的測定需要能合成IFN-γ的細胞系或細胞群。較為方便的是將由分裂素如植物凝血素(PHA)已刺激過的周圍血淋巴細胞(PBL)用作這樣的細胞群。一般說來，按如下所述方法進行測定將PHA刺激過的PLB分成三等份，把BCRF1加到第一部分，把BCRF1和假定的拮抗物加到第二部分，第三部分作為對照。數天後，測定培養物上清液中的IFN-γ。採用常規的ELISA測定方法和市售用於IFN-γ的單克隆和多克隆抗體(例如由麻省波士頓Genzyme公司出售的那些抗體)很容易進行這種測定。此外，測定的讀數可以是用RNA印跡法和PCR等方法測定錄下的IFN-γmRNA的量。用常規技術，例如Mishell等編的SelectedMethodsinCellularImmunology(Freeman，NewYork，1980)一書中所述方法得到PBL。
本發明的雜種瘤可採用已知技術產生。通常該方法包括將永久性的細胞系與產生所需抗體的B淋巴細胞相融合。此外，還可採用非融合技術產生永久性抗體的細胞系，這也屬於本發明的範圍，例如通過病毒誘導的轉化(參閱Casalietal.，「HumanMonoclonalsfromAntigen-SpecificSelectionofBLymphocytesandTransformationbyEBV」，Science，Vol.234，pp.476-479，1986)。永久性細胞通常都是被轉化的哺乳動物細胞，尤其是齧齒動物、牛和人的骨髓瘤細胞(參閱美國專利4693975和4720459)。最常用的是大鼠或小鼠的骨髓瘤細胞系，既很方便又易於得到。將靶抗原注射到哺乳動物中，由其得到適合的淋巴細胞，這種技術也是已知的。一般說來，如果需要人細胞，則可使用周圍性血淋巴細胞(PBL);如果需要非人哺乳動物細胞，則可使用脾臟細胞或淋巴細胞。將重複劑量的經過純化的抗原注入到宿主哺乳動物中，使其能產生所需的產生抗體的細胞，然後收集這些細胞用於與永久性細胞系融合。產生抗體的B細胞的最佳哺乳動物是小鼠、大鼠、兔或人。融合技術是本領域已知的，一般說來是將細胞與融合劑(如聚乙二醇)混合。雜種瘤可通過常規方法(如HAT選擇法)選擇。採用常規免疫測定法例如Western印跡法、ELISA法、RIA法和BCRF1中和能力法等方法，測定雜種瘤的培養基，從而從這些雜種瘤中，選擇能分泌對BCRF1具有特異性的所需抗體的雜種瘤。用常規的蛋白質純化技術，例如Tijssen著的「PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays」(Elsevier，Amsterdam，1985)一書中介紹的方法，從培養基中回收抗體。指導使用上述任何技術有許多文獻可以參考利用，例如Kohleretal.，HybridomaTechniques(ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1980)Tijssen，PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985);Campbell，MonoclonalAntibodyTechnology(Elsevier，Amsterdam，1984);Hurrell，MonoclonalHybridomaAntibodiesTechniquesandApplications(CRCPress，BocaRaton，FL，1982)等雜種瘤產生的對BCRF1具有特異性的單克隆抗體採用上述IFN-γ-抑制測定法進行第二次篩選，選出具有能封阻或中和BCRF1生物活性的抗體。
抗體片段的使用和產生也是已知的，例如Fab片段Tijssen，PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985);Fv片段Hochmanetal.，Biochemistry，Vol.12，pgs.1130-1135(1973)，Sharonetal.，Biochemistry，Vol.15，pgs.1591-1594(1976)和Ehrlichetal.，美國專利4，355，023;和抗體半分子;Auditore-Hargreaves，美國專利4，470，925。
本發明的雜種瘤和單克隆抗體採用由重組方法產生的成熟免疫原BCRF1的糖基化或非糖基形式進行生產。一般說來，非糖基化形式的BCRF1在大腸桿菌中產生，而糖基化形式的BCRF1則在哺乳動物細胞宿主中產生，例如CV1或COS猴細胞和鼠L細胞等。重組產生的成熟BCRF1是通過將表達載體引入宿主細胞產生的，其所採用的是常規方法，例如Maniatisetal.，MolecularCloningALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1982);OkayamaandBerg，Mol.Cell.Biol.，Vol.2，pgs.161-170(1982)和Vol.3，pgs.280-289(1983);Takebeetal.，Mol.Cell.Biol.，Vol.8，pgs.466-472(1988);美國專利4，599，308;美國專利4，675，285;Kaufmanetal.，Mol.Cell.Biol.，Vol.2，pgs.1304-1319(1982);一經了解編碼所需蛋白質的核苷酸順序，則細菌或哺乳動物表達載體的構建是本領域已知的，也可從文獻中得到，例如DeBoer在美國專利4551433中公開了用於細菌表達載體的啟動子;Goeddeletal.，在美國專利4，601，980和Riggs在美國專利4，431，739中公開了通過大腸桿菌表達系統產生哺乳動物蛋白，和Riggs(引文同上)，Ferrettietal.，Proc.Natl.Acad，Sci.，Vol.83，pgs.599-603(1986)，Sproatetal.，NucleicAcidsResearch，Vol.13，pgs.2959-2977(1985)和Mullenbachetal.，J.Biol.Chem.，Vol.261，pgs.719-722(1986)公開了如何構建用於細菌表達的合成基團。因此，這些文獻也是本文的參考文獻。BCRF1也可以通過用質粒pBCRF1(SRα)過渡轉染COS7細胞產生。質粒pBCRF1(SRα)作為本發明公開的一部分，已保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)，保藏號為68193。圖1給出pBCRF1(SRα)的限制性圖。
BCRF1cDNA的最大開放讀碼定義為下列胺基酸順序
Met Glu Arg Arg Leu Val Val Thr Leu Gln Cys Leu Val Leu Leu51015Tyr Leu Ala Pro Glu Cys Gly Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe202530Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys354045Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys505560Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala657075Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln808590Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu95100105Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His110115120Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile125130135Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala140145150Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met155160165Thr Ile Lys Ala Arg170EBV基因組已由Baer等作了介紹(Nature，Vol.310，pp.207-211，1984)，BCRF1cDNA的核苷酸順序可從GenBankrelease26得到。
當BCRF1以可溶解形式表達時，例如轉化的酵母或哺乳動物細胞的分泌產物，則可按本領域的常規方法純化，包括硫酸銨沉澱、離子交換色譜、凝膠過濾、電泳、親和性色譜和/或其他方法，例如「EnzymePurificationandRelatedTechniques」，MethodsinEnzymology，22∶233-577(1977)和Scopes的「ProteinPurificationPrinciplesandPractice(Springer-Verlag，NewYork，1982)為這種純化提供了指導。同樣，當BCRF1表達為不溶解形式時，例如集合物和包涵體等，則它們可以按本領域常規方法純化，包括通過離心從分裂的宿主細胞中分離包涵體、用促溶劑和還原劑溶解包涵體、稀釋已溶解的混合物和降低增溶劑和還原劑的濃度，使多肽具有生物活性的構型。上述方法在下列文獻中已作了介紹Winkleretal.，Biochemistry，25∶4041-4045(1986);Winkleretal.，Biotechnology，3∶992-998(1985);Kothsetal.，美國專利4，569，790;以及歐洲專利申請86306917.5和86306353.3.這些文獻都作為本文的參考文獻。
本發明雜種瘤的特徵性抗體和抗體片段也可通過提取信使RNA、構建cDNA庫和選擇編碼抗體分子片段的克隆等重組方法產生，例如Walletal.，NucleicAcidsResearch，Vol.5，pgs.3113-3128(1978);Zakutetal.，NucleicAcidsResearch.Vol.8，pgs.3591-3601(1980);Cabillyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.81，pgs.3273-3277(1984);Bossetal.，NucleicAcidsResearch，Vol.12，pgs.3791-3806(1984);Amsteretal.，NucleicAcidsResearch，Vol.8，pgs.2055-2065(1980);Mooreetal.，美國專利4，642，334;Skerraetal.，Science，Vol.240，pgs.1038-1041(1988);Huseetal.，Science，Vol.246，pgs.1275-1281(1989);Betteretal.，Science，Vol.240，pgs.1041-1043(1988);和Riechmannetal.，Nature，Vol.332，pgs.323-327(1988)。特別是這些技術可以用於產生種間單克隆抗體，其中一個種的結合區與另一種抗體的非結合區相結合，從而降低免疫原性，例如Liuetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.84，pp.3439-3443(1987)。
本發明的拮抗物可以藥物組合物的形式使用。這類組合物含有治療量的至少一種本發明單克隆抗體或其片段和藥物載體。該藥物載體可以是任何能相容的無毒性的適合於將本發明組合物傳遞給患者的物質。載體可以包括無菌水、醇、油脂、石蠟和惰性固體。藥物上可接受的助劑(例如緩衝劑和分散劑)也可結合到藥物組合物中。一般說來，非經腸胃道使用這類藥物的組合物都是已知的，例如Remington著的「PharmaceuticalScience」，15thEd.(MackPublishingCompany，Easton，PA，1980)。此外，將本發明的組合物引入患者體內可以通過可植入或注入藥物的傳遞系統，例見Urquhartetal.，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，Vol.24，pgs.199-236(1984);Lewis，ed.，ControlledReleaseofPesticidesandPharmaceuticals(PlenumPress，NewYork，1981);Johnsonetal.，eds.，DrugDeliverySystemsFundamentalsandTechniques(EllisHorwood，Ltd.，London，1987);美國專利3，773，919;美國專利3，270，960等等。
當本發明的拮抗物由抗體產生時，它們通常是非經腸胃道用藥，尤以靜脈注射為佳。由於這類蛋白或肽拮抗物可以是免疫原性的，所以最好採用常規的第Ⅳ種用藥方式或皮下儲存方式緩慢用藥，例如按Tomasi等在美國專利4732863中所述方式用藥。以非經腸胃道用藥時，抗體或片段與藥物上可接受的非經腸胃道的載體結合，配製成可注射的單位劑量形式(溶液，懸浮液，乳液)。這類載體應是固有無毒性的和非治療性的。這類載體的例子有標準鹽水、Ringer溶液、葡萄糖溶液和Hank溶液。還可以使用非液體載體，例如固體油和油酸乙酯。較佳的載體是5%的葡萄糖鹽水。載體可以含有少量的添加劑，例如可增加等滲性和化學穩定性的物質，如緩衝液和防腐劑。抗體最好以純化過的形式配製，基本不含聚合物、其他蛋白質和內毒素等，濃度約為5-30mg/ml，尤以10-20mg/ml為佳。內毒素的量最好低於2.5E
/ml。
使用拮抗物方式的選擇決定於若干因素，包括拮抗物的血清轉換率、BCRF1的血清水平、拮抗物的免疫原性和靶BCRF1的可接受性等。用藥方式最好以可接受的副作用程度，將最大量的拮抗物傳送給患者。此外，傳遞拮抗物的量部分決定於具體的拮抗物和需要治療的患者的病情嚴重程度。指導如何選擇適宜的劑量在有關抗體的治療應用的文獻中都可參考，例如Bach等在Ferrone等編的「HandbookofMonoclonalAntibodies」(NogesPublications，ParkRidge，NJ，1985)一書中的第22章，Russell和Smith等在Haber等編的「AntibodiesinHumanDiagnosisandTherapy」(RavenPress，NewYork，1977)一書中所介紹的方法。拮抗物最好總是含有單克隆抗體或其Fab大小的片段(包括結合組合物)，劑量範圍約為1-20mg/kg/天，尤以大約1-10mg/kg/天最佳。
以下的實施例用於說明本發明的各個方面，選擇的載體、宿主、融合對象、試劑濃度、溫度以及其他可變值等僅僅舉例說明本發明而不是限制本發明。
實施例1BCRF1在COS7猴細胞中的表達編碼BCRF1開放讀碼的基因使用以後能將放大的片段插入EcoRI消化的pcD(SRα)載體(圖1)引物通過聚合酶鏈反應放大。插入片段的編碼鏈如下所述，其中按從起始信號ATG至終止信號TGA的密碼子以三字母一組給出開放讀碼
帶有在適當方向上插入物的克隆通過BCRF1的表達和/或限制性消化的電泳型式鑑定。帶有BCRF1基因一種這樣的載體命名為pBCRF1(SRα)並已保藏在ATCC，保藏號為68193。pBCRF1(SRα)在大腸桿菌MC1061中放大，通過常規方法分離，並按如下所述轉染COS7猴細胞轉染前一天，將大約1.5×106COS7猴細胞接種在各個100mm培養皿上，使用Dulbecco改進的Eagle培養基(DME)，含有5%胎牛血清(FCS)和2mM穀氨醯胺。為了完成轉染，通過與胰蛋白酶一起培養，從培養皿中移去COS7細胞，在不含血清的DME中洗滌2次，再在不含血清的DME中懸浮到107細胞/ml。將0.75ml等份液與20μg DNA混合，然後轉移到0.4cm的無菌electroporation杯中。10分鐘後，將細胞置於200伏960微法的BioRad基因脈衝儀中振動。10分鐘後，將從杯中移出的細胞加到含有5%FCS、2mM穀氨醯胺、青黴素、鏈黴素和慶大黴素的20ml DME中。將混合物等份分配在4個100mm組織培養皿中，在37℃和5%CO2下放置12-24小時後，用僅含1%FCS的相似培養基取換原來的培養基，再在37℃和5%CO2下繼續溫育72小時，然後收集培養基，測定其抑制IFN-γ合成的能力。
在37℃下，將10ml等份的新鮮分離的PBL(約2×106細胞/ml)與PHA(100ng/ml)一起在培養基中溫育，培養基的成份為(ⅰ)90%DME，附加5%FCS和2mM穀氨醯胺，(ⅱ)10%經上述pBCRF1(SRα)轉染的COS7細胞的上清液。24小時後，收集細胞和上清液，分別測定IFN-γmRNA和IFN-γ蛋白。對照也按同樣方法處理，但是10%上清液取自經上述帶不相關的cDNA插入物的質粒轉染的COS7培養物。與對照相比，抑制IFN-γ合成約為50%。
實施例2BCRF1在大腸桿菌中的表達以下給出的編碼成熟BCRF1基因的順序可以在大腸桿菌中表達Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg51015Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu202530Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys354045Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr505560Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ala657075Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg808590Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys95100105Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln110115120Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile125130135Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg140145將pBCRF1(SRα)的cDNA插入物再克隆到質粒M13中，其通過定位誘變已有兩次改變，即在成熟BCRF1多肽編碼區的5′端形成ClaⅠ位點和在成熟BCRF1多肽編碼區的3′端形成BamHⅠ位點。然後很容易將經過突變的順序插入到以下所述的TRPC11表達載體中。
TRPC11載體的構建可通過合成的RBS片段與ClaⅠ聯結子(ATGCAT)連接和將得到的片段克隆到預先經過修飾含有ClaⅠ位點的ClaⅠ限制的pMTllhc中。pMTllhc是由具有πⅤⅩ質粒EcoRⅠ-HindⅢ多聯結子區的pBR322衍生的小(2.3Kb)高拷貝AMP，TET。(πⅩⅤ已由Maniatis等作過介紹MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，1982)。這是經過用EcoRⅠ和BamHⅠ限制pMTllhc、插入生成的粘性末端和用ClaⅠ聯結子(CATCGATG)聯接等步驟修飾後，含有ClaⅠ位點，從而恢復EcoRⅠ和BamHⅠ位點並由ClaⅠ位點取代SmaⅠ位點。由TRPC11構建得到的一個轉化株具有由ClaⅠ位點於側翼聯接的銜接RBS順序。在4個脫氧核苷三磷酸存在下，通過用PstⅠ消化該質粒、Bal31核酸酶處理、EcoRⅠ限制和T4DNA聚合酶處理，除去1個ClaⅠ位點和部分第二拷貝的RBS順序。經PAGE回收生成的30-40bp片段，並將其克隆到SmaⅠ限制的pUC12中。然後將由pKC101衍生的具有大腸桿菌trpP的248pbEcoRⅠ片段(參閱Nichols等在「MethodsinEnzymology」Vol.101，p.155，AcademicPress，N.Y.1983)克隆到EcoRⅠ位點，從而完成TRPC11的構建(示於圖2)。TRPC11用作BCRF1的載體是先用ClaⅠ和BamHⅠ對其進行消化和純化，然後將其置於常規的連接溶液中與含有編碼成熟的BCRF1的核苷酸順序的Ml3的ClaⅠ-BamHⅠ片段混合。含有插入物的TRPC11，命名為TRPC11-BCRF1，使其在大腸桿菌K12JM101(可從ATCC獲得，保藏號為33876)中繁殖。
實施例3BCRF1中和單克隆抗體的生產用經過純化的COS7細胞表達的BCRF1製劑使Lewis雄鼠免疫。該大鼠先用1mlBCRF1溶液(5-100μg/mlBCRF1溶於10mMTris-HCl中，0.5MNaCl，pH7.4)免疫，該溶液預先用1ml弗羅因德氏完全佐劑(FCA)乳化，並用相同量的材料在弗羅因德氏不完全佐劑中加助2次。移去試驗液體。最後再用25μgBCRF1的磷酸緩衝鹽水溶液處理試驗動物，4天後得到用於融合的脾臟。
用聚乙二醇將大約3×108大鼠脾細胞與等量的P3X63-AG8，653小鼠骨髓瘤細胞(可從ATCC得到，保藏號為CRL 1580)融合。按照Chret-ien等所述方法(J.Immunol.Meth.Vol.117，pp.67-81，1989)將細胞懸浮液(約3.5×105細胞/ml於HAT培養基中)分配在40個96穴微量滴定皿中。10天後，測定雜種瘤上清液與直接固定在微量滴定皿上(間接的ELISA的BCRF1的結合能力，或兔抗BCRF1的被固定的多克隆IgG部分與BCRF1相結合的能力。結合抗體可按常規方法用與過氧化酶結合的羊抗鼠免疫球蛋白進行檢測。分泌與BCRF1反應的抗體的雜種瘤通過限制稀釋進行克隆。將所選擇的雜種瘤貯藏在-70℃和含有10%DMSO的培養基中，並用常規的哺乳動物細胞培養技術(例如含有10%胎牛血清的RPMI1640的培養基，補充/mM穀氨醯胺和50mM2-巰基乙醇)進行培養。產生BCRF1封阻抗體的雜種瘤是按上述測定方法，通過其減弱由BCRF1誘導的對產生IFN-γ的抑制的能力，從一組產生BCRF1特異性抗體的雜種瘤中進行選擇。
對上述本發明實施例的介紹，其目的是說明本發明，不可能是完整無遺的，也不是為了將本發明限制在所公開的精確內容上。顯然從以上所述，可以作出許多改進和改變。實施例的選擇和介紹，是為了更好地說明本發明的原理，從而能使本領域的其他專業人員作出適宜於具體應用的各種實施方案和各種改進。本發明的保持範圍由所附權利要求書予以限定。
申請人已將帶有pBCRF1(SRα)的大腸桿菌MC1061保藏在美國的ATCC，保藏號為68193。該保藏是在ATCC同意保藏用於專利目的培養下提供的條件下予以保藏的，該保藏根據35USC122和37CFR1.14可使美國專利和商標委員會能夠得到，並在要求保藏的美國專利公開以後可使公眾能夠得到。可以獲得所保藏的菌株並不認為可以違反各國政府按其專利法授予的專利權而許可實施本發明。
該保藏物已經改進，以符合布達佩斯條約的要求。
權利要求
1.BCRF1拮抗物的藥物組合物的製備方法，包括將BCRF1的拮抗物與藥物上可接受的載體相混合，其特徵在於所述BCRF1拮抗物選自能封阻由BCRF1誘導抑制幹擾素-γ的單克隆抗體或其片段和含有能封阻由BCRF誘導抑制幹擾素-γ的單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的結合組合物。
2.根據權利要求1的方法，其中所述單克隆抗體片段是Fab片段。
3.根據權利要求1的方法，其中所述單克隆抗體是由人-人雜種瘤產生的。
4.根據權利要求1的方法，其中所述單克隆抗體是人單克隆抗體。
全文摘要
本發明介紹了用於治療愛潑斯坦—巴爾病毒感染的BCRF1拮抗物，其特徵在於所述BCRF1拮抗物選自能封阻由BCRF1誘導抑制幹擾素—γ的單克隆抗體或其片段和含有能封阻由BCRF1誘導抑制幹擾素—γ的單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的結合組合物。
文檔編號C12P21/08GK1056245SQ9110190
公開日1991年11月20日 申請日期1991年3月22日 優先權日1990年3月26日
發明者凱文·W·穆爾 申請人:先靈公司