包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒及高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌的製作方法

2023-06-05 02:10:36

專利名稱：：包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒及高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌的製作方法
技術領域：
：本發明屬於基因工程
技術領域：
，具體地說涉及包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒及高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌。
背景技術：
：在多種疾病進程中，包括癌症、心腦血管疾病和炎症等，由組織因子(tissuefactor,TF)引發的外源性凝血系統的激活扮演重要角色，一些患者因此致死。組織因子途徑抑制因子(tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI)是抑制外源凝血的一種重要蛋白因子。大量臨床實驗和動物實驗證明，重組人組織因子途徑抑制因子(humanrecombinanttissuefactorpathwayinhibitor,rhTFPI)對血栓形成、感染性休克、血管再狹窄、內毒素血症和DIC等具有明顯防治作用，在臨床上有廣泛的應用前景。目前，重組人TFPI製備的效果很不理想，存在的主要問題是表達量較低，以哺乳動物細胞表達系統為例，表達量最高(約2-5mg/L)，但成本也最高。因此，通過分子生物技術上的改造，得到能夠高表達人類組織因子途徑抑制因子的重組酵母菌，將有效降低重組人組織因子途徑抑制因子的生產成本。
發明內容本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒。本發明的第二個目的是提供一種高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌。本發明的技術方案概述如下包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒，用下述方法製成以序列表SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所述核苷酸序列為PCR引物，以重組質粒mTFPI-pPIC9為模板，擴增出人類組織因子途徑抑制因子基因閱讀框架，回收得到序列表SEQIDNo.l所述的1125bp的核苷酸序列，與pPIC9K加入T4連接酶進行連接反應，製備成包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒rhTFPI-pPIC9K。高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌，用下述方法製成將包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒rhTFPI-pPIC9K導入巴斯德畢赤酵母工程菌種GS115,獲得基因組中包含序列表SEQIDNo.4所述的人類組織因子途徑抑制因子基因的重組酵母菌，運用抗生素G418抗性篩選，獲得高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G418。本發明應用劑量效應的原理，運用抗生素G418抗性，篩選出高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌。經過高密度發酵，使菌種表達人類組織因子途徑抑制因子的量大大提高，達到每升培養基6.8mg左右。(G418即G-418sulfate,也稱Geneticin，遺傳黴素，分子式為C20H40N4010.2H2S04，分子量為692.71g/mole)圖1為PCR擴增TFPI:片段大小為1，125bp;圖2為質粒rhTFPI-pPIC9K限制性內切酶EcoRI，XhoI，BglII，HindIII酶切電泳圖；圖3為WesternBlot檢測結果；圖4為不同rhTFPI基因拷貝數酵母rhTFPI表達量對照；圖5為高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌發酵罐高密度培養rhTFPI表達量。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例1製備包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒1.分別設計上、下遊PCR引物，以序列表SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所示，由上海生工負責合成並純化。以重組質粒mTFPI-pPIC9為模板(專利號ZL200610015651.3)，擴增出人類組織因子途徑抑制因子基因閱讀框架，反應體系為100PL1)TaKaRaExTaq(5U/tiL)0.5yL反應條件為2)10XExTaqBuffer(Mg2+Plus)1094°C30sec3)dNTPMixture(各2.5mM)4yL55°C30sec4)模板DNA20ng72°Clmin5)上、下遊引物(lOOuM)各0.4uL上述反應30個循環6)無菌去離子水80.5PL回收得到序列表SEQIDNo.l所述的核苷酸序列，將PCR反應液上樣於7.5%瓊脂糖凝膠，電泳30分鐘(見圖1，圖中M表示DNA分子量標準，100-6,000WideRangeDNAMarker(TaKaRa);1表示PCR產物)2.使用限制性內切酶BamHI和EcoRI分別雙酶切上述PCR擴增片段以及載體質粒反應體系20uL1)rhTFPI/pPIC9K1wg2)TaKaRaBamHI0.5yL3)TaKaRaEcoRI0.5uL4)TaKaRa10XKBuffer2uL5)無菌去離子水7uL反應條件37°C2小時pPIC9K將反應液上樣於7.5。/。瓊脂糖凝膠，電泳30分鐘，使用凝膠回收試劑盒(天根)，分別回收純化上述PCR擴增和載體質粒pPIC9K酶切後片段；3.將上述純化後的PCR擴增和載體質粒pPIC9K酶切後片段中加入T4連接酶16'C，過夜反應反應體系25yL1)TaKaRaT4DNALigase(350U/uL)lyL2)TaKaRaT4LigaseBuffer2.5tiL3)雙酶切後pPIC9K0.03pM4)雙酶切後rhTFPI0.3pM5)無菌去離子水加至25iiL反應條件16°C，過夜反應上述反應液直接轉化感受態大腸桿菌TB1，並將100iiL轉化後菌液直接塗布在LB氨苄(氨苄青黴素含量為lOOug/ml)培養瓊脂平板上，37°C培養12小時。獲得帶有rhTFPI-pPIC9K的大腸桿菌TBI(TBI-rhTFPI-pPIC9K);4.挑取單個菌落至10mlLB氨苄(氨苄青黴素含量為100Pg/ml)培養基，250rpm37°C培養12小時，使用質粒小提試劑盒(天根)，小量提取質粒rhTFPI-pPIC9K，進行下一步檢測；5.將上述質粒分別被限制性內切酶￡coRI，loI，Bg/II以及///"dIII酶切，反應體系20uL1)rhTFPI-pPIC9K1yg2)TaKaRa五coR礙o崎/II脂dIIIluL3)TaKaRa10XH/顧/MBuffer2UL4)無菌去離子水7uL反應條件37°Cl小時將反應液上樣於7.5%瓊脂糖凝膠，，電泳30分鐘。(見圖2其中，M表示DNA分子標準量XHindIIIDNAMarker(TaKaRa);1表示未酶切質粒；2表示rhTFPI-pPIC9KEcoRI酶切質粒pPIC9K;3表示BglII酶切質粒pPIC9K;4表示XhoI酶切質粒pPIC9K;5表示HindlII酶切質粒pPIC9K)，結果符合理論。重組基因限制性內切酶位點預測酶切片段大小(bp)5coRI(GAAATTC)10099勘I(CATCGAG)4759,5340rhTFPI-pPIC9K(AAGATCT)7876,2403倫dIII(A八AGCTT)4959,35%,1532,126.將質粒送上海生工進行測序，測序結果符合模板中人類組織因子途徑抑制因子基因序列。實施例25高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌(GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)製備1.將質粒rhTFPI-pPIC9K使用限制性內切酶SacI酶切後純化，使其成為線性而非環狀的質粒片段，通過原生質體法，將質粒rhTFPI-pPIC9K轉化畢赤酵母GS115(美國，Invitrogen)。1)準備畢赤酵母菌(GS115)準備a)取10PL凍存菌株，四區劃線法塗布於RDBplate(陽性轉化子為His+)。倒置放置於孵育箱(30°C)培養3Days;b)挑取單個菌落接種至5mlYPD培養基(50ml錐型離心管)中，30°C，200rpm，培養20h(OD6"0.3)。表達質粒準備將已構建好的rhTFPI-pPIC9K用限制性內切酶SacI酶切後純化(通過同源重組，目的基因應插入5'A0X1,GS115表形應為His+Mut+)，培養基準備YPD培養基，RDBagar和RDmoltenagarose。2)步驟a)將菌液以l，500rpm室溫離心10min，棄上清；b)用20ml無菌水重懸上述細菌；c)將菌液以l，500rpm室溫離心5min，棄上清；d)用20ml新鮮SED重懸上述細菌，將菌液以l，500rpm室溫離心5min，棄上清；e)用20mllM山梨醇重懸上述細菌，將菌液以l，500rpm室溫離心5min，棄上清；f)用20mlSCE重懸上述細菌，並分裝兩管，一管用於確定Zymolyase消化細菌細胞壁的最佳時間，另一管用於製備酵母原生質體；g)取7.5iiLZymolyase置於10ml上述菌液，輕輕混勻，並置於30。C孵箱，靜置60min;h)將上述菌液以750rpm室溫離心10min，棄上清；i)用10ml1M山梨醇重懸上述沉澱(一定要輕柔)；j)將上述菌液以750rpm室溫離心10min，棄上清；k)用lOmlCaS重懸上述沉澱(一定要輕柔)；1)將上述菌液以750rpm室溫離心10min，棄上清；m)用600uLCaS重懸上述沉澱(一定要輕柔)；n)取100uL上述菌液，加入10yg已酶切的mTFPI-pPIC9K，室溫靜置lOmin;o)將1mlPEG/CaT溶液加入上述菌液室溫靜置lOmin;p)將上述菌液以750rpm室溫離心10min，棄上清；q)用150ULSOS培養基重懸己轉化的細菌，室溫靜置20min;r)在上述菌液中加入850uLlM山梨醇，並取此菌液lOOwL加入900uL1M山梨醇；s)將上述菌液與10ml熔化的RDagarose混合，並鋪在RDBplate上，30°C培養5天。2.配製含有抗生素G418各級濃度(0.25mg/ml，2.Omg/ml以及4.Omg/ml)的YPD培養基，並使用上述培養基篩選能夠在上述含抗生素培養基中生長的轉化後酵母菌，由於劑量效應，能夠在高濃度抗生素中生長的酵母菌-高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌(GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)基因組DNA中攜帶的人類組織因子途徑抑制因子基因拷貝數應高於其它在低濃度抗生素中生長的酵母菌-GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml，GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml。保存各級酵母菌種。3.為了驗證能夠在高濃度抗生素中生長的酵母菌攜帶人類組織因子途徑抑制因子基因拷貝數高於其它在低濃度抗生素中生長的酵母菌，採用實時定量PCR檢測酵母基因組中人類組織因子途徑抑制因子基因絕對拷貝數。1)準備a)使用酵母基因組提取試劑盒(天根)分別提取轉化後的酵母菌(GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml，GS115-ATFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml和GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)基因組DNA。b)分別設計上、下遊引物上遊引物5'-GGAAGAAGATCCTGGAATATGTCGAGG-3'下遊引物5'-CTTGGTTGATTGCGGAGTCAGGGAG-3擴增產物260bp2)儀器和試劑:tableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8其中l指的是GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml基因組DNA,2指的是GS115-rhTFP1-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml基因組DNA，3指的是GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml基因組DNA將反應板放入ABI7300螢光定量PCR儀中，設置好反應板文件和程序，開始運行。擴增反應條件如下:tableseeoriginaldocumentpage9通過實時定量PCR檢測，高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌(GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)絕對拷貝數為110025.7(平均值)遠高於GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml:1.08(平均值)GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml:325.96(平均值)。4)為了驗證高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌(GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)人類組織因子途徑抑制因子表達量同樣高於酵母菌-GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml，GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml，在同條件下培養上述酵母菌，誘導人類組織因子途徑抑制因子表達，並通過ELISA試劑盒(AssayMaxHumanTissueFacto/"屍a決ww/w/n力"w(TF屍"以及WesternBlot檢測人類組織因子途徑抑制因子表達量。a)SDS-PAGE電泳按《分子克隆》方法進行SDS-PAGE，積層膠5%，分離膠15%。b)溼法轉膜跑好的膠在轉膜液中浸泡20min;從下至上分別放入濾紙、膠、PVDF膜、濾紙，夾子夾好放入倒好轉膜液的轉膜槽中，250mA轉膜30min。c)封閉將膜取出，放入含5%脫脂奶粉的PBST，室溫封閉2h。d)—抗、二抗結合取出膜，對應一抗l:100稀釋，室溫結合2h;PBST洗3次，每次10min;二抗l:10000稀釋，室溫結合lh;分別用PBST禾口PBS各洗3次，每次lOmin。e)顯影等比例混合顯色基質A液和B液，均勻滴加膜上，靜置lmin，用保鮮膜將膜包好，輕輕擠出多餘顯色基質，放入暗盒，曝光2-5min。結果表明，高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌(GS115-ATFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)人類組織因子途徑抑制因子表達量明顯高於酵母菌GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti國G4180.25mg/ml，GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml，(見圖3其中1表示GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml;2表示GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml;3表示GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml))達到了搖瓶培養時每升培養基L0mg(見圖4其中樣品1為GS115-rhTFPI陽pPIC9Kanti-G4180.25mg/ml;樣品2為GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4182.0mg/ml;樣品3為GS115-rhTFPI陽pPIC9Kanti陽G4184.0mg/ml)4.使用發酵罐(上海保興10JS)將高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌(GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G4184.0mg/ml)高密度發酵1)發酵菌種準備a)將保存的菌液由冰箱中取出，取10uL置於RDBagarplate倒置30°C3daysb)挑取單個菌落置於5ralYPD培養基中30°C200rpm24hr0D6。。^1c)取上述菌液lml置於200mlBMGY培養基中30°C200rpm18hr0D6。。"42)菌體擴增階段一參數a)溫度30。Cb)pH:5c)培養時間24hr歩驟a)將發酵基礎鹽(FermentationBasalSaltwithantifoam204)4L倒入發酵罐中；b)用pH電極測量培養基準確的pH值，並記錄；c)按照發酵罐消毒操作規則，高溫，高壓30min消毒；d)將培養基冷卻至28°C，將攪拌開至900rpra，通氣量開至1.OVVM罐壓維持在0.09MPa;e)當所有數值穩定後，首先標定pH電極，修改零點值，使pH電極數值正常；f)打開鹼補料，使用濃氨水(28%NH40H)將培養基的pH值調至5;g)當DO值穩定後(一般大於100%)，標定DO電極斜率至100%;.h)將攪拌下調至300rpm調節進氣量至0.2VVM，調節排氣閥VT1，使罐壓接近0(不得大於0.02MPa);i)在接種口處放好火焰圈並點燃，並旋鬆接種口10S，打開接種口；j)分別倒入PTM1微量鹽(PTM1TraceSalts17.5ml(已滅菌))，200ml菌液(0D6。。^4);k)旋緊接種蓋，立即調高通氣量開至1.0VVM罐壓至0.09MPa，並將攪拌上調至600rpm;此時DO值開始下降，通過調節通氣量及排氣量，D0值維持在7(m左右。3)菌體擴增階段二參數a)溫度30°C;b)pH:5;c)培養時間5hr。步驟a)將已消毒的補料瓶及輸液管放置於擱架上，用手動方式轉動蠕動泵頭，將輸液管沿蠕動泵轉動方向嵌入蠕動泵內，並用夾子加緊軟管(保證其不移動)；b)旋下補料口上悶頭，用酒精棉球對補料口內橡膠塞外表面消毒，然後將針頭插入並穿透密封蓋，並用補料針上的螺母鎖緊；C)打開蠕動泵手動開關使輸液管中充滿料液，將蠕動泵開關打至自動狀態；d)連通50%甘油補料，將流加量設定為7075ml/hr;e)此時，D0值從100%逐漸下降，調節通氣量至lOL/min罐壓至0.09MPa，補料時間為5hr。4)蛋白表達階段參數a)溫度25°C;b)pH:5;c)培養時間72hr。步驟a)將培養基冷卻至25'C;b)將裝有10%酸水解酪素補料瓶及輸液管放置於擱架上，用手動方式轉動蠕動泵頭，將輸液管沿蠕動泵轉動方向嵌入蠕動泵內，並用夾子加緊軟管(保證其不移動)；c)旋下補料口上悶頭，用酒精棉球對補料口內橡膠塞外表面消毒，然後將針頭插入並穿透密封蓋，並用補料針上的螺母鎖緊；d)打開蠕動泵手動，直至800ml10%酸水解酪素全部補完，關閉蠕動泵；e)連通Methanol(100%Methnol—with12mlPTM1TraceSalts/liter);f)分別設定流加量為i)第1至5個小時14.4ml/hr(Total72ml);ii)第6至8個小時.29.2ml/hr(Total87.6ml);iii)第9至72個小時43.6ml/hr(Total2.8L);注意，此時沒有連通的補料瓶一定要用旋夾夾緊，保證沒有空氣倒流(壁厚1.6mm的矽膠管能耐受的壓力為0.IMPa)11g)此時，DO值從100%逐漸下降，調節通氣量至l.OVVM罐壓至0.09MPa，補料時間為7280hr。發酵過程中使用Sigmaantifo柳204作為消泡劑，使用濃度為0.1%，使用1%酸水解酪素是為了降低酵母細胞分泌的蛋白水解酶對rhTFPI的降解通過ELISA檢測rhTFPI表達量rhTFPI蛋白最高表達量出現於65小時，表達量為每升培養基6.8mg(見圖5)序列表SEQIDNo.l1.序列特徵1)長度1125bp2)類型核酸3)鏈性雙鏈4)拓撲結構線性2.分子類型DNA3.序列描述SEQIDNo.lformulaseeoriginaldocumentpage121.序列特徵1)長度28bp2)類型核酸3)鏈性單鏈4)拓撲結構線性2.分子類型DNA3.帶有限制性內切酶BamHl位點4.序列描述SEQIDNo.25'gaaggatccaaacgatgagatttcctag3'SEQIDNo.31.序列特徵1)長度24bp2)類型核酸3)鏈性單鏈4)拓撲結構線性2.分子類型DNA3.序列描述SEQIDNo.34.帶有限制性內切酶EcoRI位點5'cgccctagggaattcacatatttt3SE(3IDNo.41.序列特徵1)長度831bp2)類型核酸3)鏈性雙鏈4)拓撲結構線性2.分子類型DNA3.序列描述SEQIDNo.4gattctgaggatcacagstacggagttgcc60cttatgcattcattttgtgcattcaaggcgg￡Ltg￡LtggCC120agatttttcttcaatattttcactcgacagtgcgaagaatttatatatggg鵬tgtgaa180gga^atcagag￡Lgtgca^^aaatgtgtac■gagataat240gcaaacaggattataaagacaacattgcaacaagaaaagcc已gatttctgctttttggaa300gaag已tcctggaatatgtcgaggttatattaccaggtacttctacaacaa360cagtgtgaac"tggtggatgcctgggcaatatgagacactg420gaagaatgcaagaacatttgtgaagatggtccgaatggtttccaggtggataattatgga480acccagctcaatgctgtgaataactccctgactccgcaatcaaccaaggttcccagcctt540tttgaatttcacggtccctcatggtgtctcactccagcagacagaggattgtgtcgtgcc600aatgagaacagattctactacaattcagtcattgggaaatgccgcccatttaagtacagt660ggatgtgggggaaatgaaaacaattttacttccaaacaagaatgtctgagggcatgtaaa720aaaggtttcatccaaagaatatcaaaaggaggcctaattaaaaccaaaagaa肪agaaag780aagcagagagtgaaaatagcata.tgaagaaatttttgttaaaaatatgtga831SEQIDNo.51.序列特徵1)長度276個胺基酸.2)類型胺基酸3)拓撲結構線性2.分子類型多肽序列描述SEQIDNo.5AspSerGluGluAspGluGluHisThrIsoIsoThrAspThrGluLeu16ProProLeuLysLeuMetHisSerPheCysAlaPheLysAlaAspAsp32GlyProCysCysAlaIsoMetLysArgPhePhePheAsnIsoPheThr48ArgGinCysGluGluPheIsoTyrGlyGlyCysGluGlyAsnGinAsn64ArgPheGluSerLeuGluGluCysLysLysMetCysThrArgAspAsn80AlaAsnArgIsoIsoLysThrThrLeuGinGinGluLysProAspPhe96CysPheLeuGluGluAspProGlyIsoCysArgGlyTyrIsoThrArg112TyrPheTyrAsnAsnGinThrLysGinCysGluArgPheLysTyrGly128GlyCysLeuGlyAsnMetAsnAsnPheGluThrLeuGluGluCysLys144AsnIsoCysGluAspGlyProAsnGlyPheGinValAspAsnTyrGly160ThrGinLeuAsnAlaValAsnAsnSerLeuThrProGinSerThrLys176ValProSerLeuPheGluPheHisGlyProSerTrpCysLeuThrPro192AlaAspArgGlyLeuCysArgAlaAsnGluAsnArgPheTyrTyrAsn208SerValIsoGlyLysCysArgProPheLysTyrSerGlyCysGlyGly224AsnGluAsnAsnPheThrSerHysGinGluCysLeuArgAlaCysLys240LysGlyPheIsoGinArgIsoSerLysGlyGlyLeuIsoLysThrLys256ArgLysArgLysLysGinArgValLysIsoAlaTyrGluGluIsoPhe272ValLysAsnMet2761權利要求1.包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒，其特徵是用下述方法製成以序列表SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所述核苷酸序列為PCR引物，以重組質粒mTFPI-pPIC9為模板，擴增出人類組織因子途徑抑制因子基因閱讀框架，回收得到序列表SEQIDNo.1所述的1125bp的核苷酸序列，與pPIC9K加入T4連接酶進行連接反應，製備成包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒rhTFPI-pPIC9K。2.高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌，其特徵是用下述方法製成將包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒ATFPI-pPIC9K導入巴斯德畢赤酵母工程菌種GS115，獲得基因組中包含序列表SEQIDNo.4所述的人類組織因子途徑抑制因子基因的重組酵母菌，運用抗生素G418抗性篩選，獲得高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌GS115-rhTFPI-pPIC9Kanti-G418。全文摘要本發明公開了包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒及高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌，包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒，是以序列表SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所述序列為PCR引物，mTFPI-pPIC9為模板，擴增出人類組織因子途徑抑制因子基因閱讀框架，回收得序列表SEQIDNo.1所述的核苷酸序列，與pPIC9K加入T4連接酶進行反應，製成包括人類組織因子途徑抑制因子的重組質粒。本發明應用劑量效應原理，運用抗生素G418抗性，篩選出高表達人類組織因子途徑抑制因子重組酵母菌。經高密度發酵，使菌種表達人類組織因子途徑抑制因子量大大提高。文檔編號C12N15/81GK101509010SQ20091006825公開日2009年8月19日申請日期2009年3月26日優先權日2009年3月26日發明者冷希崗,宋麗萍,徐偉傑,筠朱,霞董申請人:中國醫學科學院生物醫學工程研究所