一種植物內生真菌球毛殼菌株、微生物菌劑及其應用的製作方法

2023-05-17 08:16:56

專利名稱：一種植物內生真菌球毛殼菌株、微生物菌劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於農業微生物領域，涉及的球毛殼(Chaetomium globosum)ND35菌株是一種具有多機制和廣譜性抑制植物病原菌以及促進植物生長能力的植物內生真菌菌株，可用於研發具有防治多種植物病害的生物殺菌劑產品和促進植物生長的多功能生物菌肥產
品
背景技術：
利用微生物活體菌劑防治植物病害是傳統的生防技術之一，目前商品化的生防真菌主要是木黴菌等。雖然在生產上應用取得了一定的效果，但田間應用往往由於各種環境因素的影響而導致防病效果不穩定。其中主要原因是木黴菌的孢子粉製劑為其無性型分生孢子，容易失去活力，貨架期較短，嚴重影響田間的生防效果。尋找生活力強、貨架期長且具有生防機制多樣性的新型高效生防菌株是當務之急。毛殼屬真菌(Chaetomium spp.)是子囊菌重要屬之一，球毛殼(CC. globosum)、 螺捲毛殼(C. cochliodes)、繩生毛殼(C. fun i Co la)和銅毛殼(C. cupreum)等能產生毛殼素、球毛殼素等多種抗生素，具有抗真菌和細菌活性(Brewer et al. , 1972 ；Di Pietro et al. , 1992 ；Aggarwal et al.，2004)。用毛殼處理種子或植物，可促進植物生長並獲得高產。 能抑制20多屬的植物病原真菌，包括引起農作物種子腐爛和種苗猝倒的腐黴菌、立枯絲核菌、鐮刀菌和引起蔬菜和大田作物以及林木、果樹病害的灰黴病菌、瓜果腐黴、辣椒疫黴、小麥穎枯病菌、大麥白粉病菌、稻瘟病菌、甘蔗紅腐病菌、玉米彎孢葉斑病菌、楊樹腐爛病菌、 蘋果樹腐爛病菌、蘋果炭疽病菌等。在國外，已經用於蘋果黑星病、歐洲赤松幼苗猝倒病等病害的田間生物防治試驗(Cullen et al. , 1984 ；)。植物內生真菌是生活在植物體內，而不引起明顯侵染症狀的微生物。它們與植物長期協同進化是互惠共生的關係。已有的研究表明，在沒有菌根真菌存在的環境中，內生真菌可以起到替代菌根真菌的促生防病作用。分離自健康毛白楊的內生真菌球毛殼ND35菌株是一個經過多年篩選研究得到的優良生防菌株。該菌株經誘導產生的粗酶液和抗生物質粗提液均能明顯抑制多種植物病原真菌菌絲的生長和孢子萌發。掃描和透射電鏡觀察到， ND35能纏繞、侵入立枯絲核菌菌絲內部，降解細胞質。免疫細胞化學標記證明，幾丁質酶和 β-1，3-葡聚糖酶在重寄生過程中起重要作用(Gao et al.，2005)。另外，球毛殼ND35菌株還能對楊樹、核桃、板慄、番茄、黃瓜等植物的生長發育有明顯的促進作用。毛殼菌在自然界廣泛分布，具有廣譜拮抗性和較強抗逆性。子囊孢子壽命長，對乾燥、低溫等不良環境的抵抗力強。子囊孢子在空氣中乾燥2. 5年，萌發率仍大於90% (劉曉光等，1999)。這一特性為延長活菌劑型生防產品的貨架期提供了保證。因而，毛殼菌是一種理想的生防益菌。

發明內容
本發明的目的是為了克服已有的生防菌株生活力不強，生防機制單一，貨架期短而提供一種具有廣譜高效抑制植物病原菌和促進多種植物生長的能力，適合工業化生產，貨架期長，適用於植物病害生物防治的球毛殼(Chaetomium globosum)優良菌株。該菌株可用於生產具有促生防病功能的多種生防產品。為解決上述問題，本發明是通過如下技術方案實現的(一 )本發明的球毛殼真菌菌株1、本發明的球毛殼真菌菌株被命名為球毛殼(Chaetomium globosum)菌株ND35， 保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日2010年9月2日，保藏號為CGMCC No. 4136。其有性態屬於子囊菌門、核菌綱、球殼目、毛殼科、毛殼屬。2、本發明所述的球毛殼ND35菌株的培養特徵本發明球毛殼ND35菌株分離自本地白楊樹，菌株在馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養基 (PDA)上培養，初期白色較濃密，後期淡褐色。在25°C條件下，5-6天菌落在PDA平板上擴展 9cm, 7天後從中心區域向外開始漸進產生子囊果，顏色逐漸變為橄欖綠色、橄欖褐色。15天後多個成熟子囊果聚集，密布整個PDA平板，在聚集的子囊果上方有肉眼可見稀疏輻射狀的淺色菌絲覆蓋(

圖1)。3、本發明所述的球毛殼ND35菌株的顯微形態和超微結構特徵子囊果表生，以褐色假根固著於基質表面，在反射光下為橄褐色、褐色、橄綠色， 卵形、近卵形、球形或近球形，偶見扁球形、倒卵形，直徑140-320 μ m，高約160-370 μ m ； 子囊果壁由暗褐色或深褐色交錯絲組織構成；頂生附屬絲大量而密集，曲折狀、波浪狀或呈稍螺旋狀捲曲，褐色，具隔，基部隔膜較明顯，不分枝，表面具密集疣點，基部寬 3. 2-5. 2μπι;側生附屬絲，直立或稍曲折狀，向頂漸細，分隔明顯；子囊棍棒狀或紡錘狀， 具長柄，50-100X10-19 μ m，內含8個子囊孢子，子囊壁易消解；子囊孢子檸檬形，兩側扁， 兩端各具一個細尖，偶見子囊孢子上有一個細尖狀突起，幼時無色或淺色，成熟時褐色， 8-12 X 7-9 X 5. 3-7. 5 μ m，具單個頂生芽孔(圖2)。掃描電鏡下觀察到，子囊殼頂端有孔口，其周圍著生附屬絲，附屬絲基部具瘤狀物。檸檬形的子囊孢子表面光滑，子囊孢子萌發時芽管從發芽孔向兩端延伸(圖3-4)。4、本發明所述的球毛殼ND35菌株的系統發育學鑑定提取該菌的DNA，以ITSl和ITS4為引物，通過PCR擴增出一段含有ITS1、5. 8S rDNA和ITS2的487bp的rDNA基因(NCBI登陸號EU164852)。測得的基因序列如序列表所示。將該序列進行 Blast 比較，與 Chaetomium globosumCg3、Cg4、Cg5、Cg8、Cg9、UAMH7142 和AFTOL-ID等菌株相似性達98-100 %。鑑定結果表明該菌株為球毛殼(Chaetomium globosum)，系統發育學與形態學的鑑定結果相同。( 二 )本發明球毛殼ND35菌株的孢子培養方法第一步球毛殼ND35菌株的子囊孢子產孢培養基組成馬鈴薯200g，葡萄糖20g， 瓊脂18g，水1000ml，pH自然(不調整pH值)；第二步新鮮馬鈴薯去皮後切成邊長0. 5cm的小方塊，加水1000ml，煮沸後再加熱 30min,然後用四層紗布過濾，保留濾液，加入20g葡萄糖，18g瓊脂，定容至1000ml，121°C滅菌25min備用。第三步將活化的球毛殼ND35菌株的菌絲餅接種於PDA平板上，25°C培養12_15 天，可獲得大量子囊孢子。經過一段時間的低溫冷藏後，子囊孢子即可用1/2濃度的馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)配製成濃度為1 X IO6的孢子懸浮液用於固體菌劑培養的接種劑。(三)用本發明球毛殼ND35菌株液製備固體菌劑的方法第一步固體菌劑生產的原料可以利用小麥粒、玉米粒、大米粒、棉籽殼、粉碎的玉米秸、麥秸以及麥麩與蛭石混合物(體積比為1 1)和各種生產培養平菇、木耳、金針菇等食用菌的廢料-菌糠等農副產品。第二步將第一步中的小麥粒等原料用自來水浸泡3-4小時，裝入聚丙烯塑膠袋中，兩端用繩紮緊，121°C滅菌25min，涼透後從兩端接入孢子濃度約為1 X IO6的子囊孢子懸浮液10ml，置於25°C條件下培養3-4天，打開袋口，以利於產孢，9-10天收起，晾乾後，用多功能高速植物粉碎機粉碎，製品為能通過40篩目的粉末，包裝好後放置在冷涼處備用。(四)本發明菌株和固體菌劑的應用1、用本發明球毛殼ND35菌株及其固體菌劑能抑制20多屬的植物病原真菌，包括引起農作物種子腐爛和種苗猝倒的腐黴菌、立枯絲核菌、鐮刀菌和引起蔬菜和大田作物以及林木、果樹病害的灰黴病菌、瓜果腐黴、辣椒疫黴、玉米彎孢葉斑病菌、楊樹腐爛病菌、蘋果樹腐爛病菌、蘋果炭疽病菌等。2、本發明球毛殼ND35菌株還能對楊樹、核桃、板慄、番茄、黃瓜和生薑等植物的生長發育有明顯的促進作用。3、本發明球毛殼ND35菌可提高植物對逆境條件的適應性，例如乾旱、鹽鹼和低溫的抗性等。(五)本發明菌株能抑制20多屬的植物病原真菌，促進植物生長發育，並且保存時間長，經檢測，菌株的固體製劑在30個月後孢子萌發率還達到88%左右。為了說明本發明的優點，下面對球毛殼ND35菌株的子囊孢子活力和菌株生物活性進行測定。1、球毛殼ND35菌株的子囊孢子活力測定為檢測球毛殼ND35菌株的子囊孢子存活時間，確定產品的貨架期。將在PDA平板上培養已經成熟的球毛殼ND35菌株的子囊孢子和在麥粒培養基上培養並加工成的粉末狀固體菌劑放置在室溫下，分別在6個月、12個月、18個月、M個月和30個月時，用懸滴法測定其孢子萌發率。方法如下在無菌環境下，取少許子囊殼放於滅菌的1. 5ml離心管中，用無菌玻璃棒研碎，使子囊孢子充分釋放出來，加入1/2濃度的PDB培養基溶液，過濾除去雜質後，配成適當濃度的孢子懸浮液，40倍物鏡下，每個視野60-80個子囊孢子為宜。取30 μ 1 孢子懸浮液滴加到滅菌的載玻片上，翻轉180度，使孢子懸浮液懸浮於在載玻片上，將該載玻片放置於保溼器中，每處理重複5次，於25°C條件下培養IOh後，鏡檢計數已經萌發的子囊孢子數量，統計孢子萌發的標準為芽管長於孢子長軸的二分之一時即可視為萌發，計算孢子萌發率(表1)。孢子萌發率=萌發的孢子數/總調查的孢子數X 100%表1乾燥保存不同時間的球毛殼ND35菌株子囊孢子萌發率
權利要求
1.一種植物內生真菌球毛殼菌株，其特徵在於，其命名為球毛殼(Chaetomium globosum)菌株ND35，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日2010年10月09日，其保藏編號為CGMCC No. 4136。
2.如權利要求1所述的植物內生真菌球毛殼菌株在防治植物病原真菌方面、促進植物生長發育方面和/或增強植物對逆境條件適應性方面的應用。
3.如權利要求2所述的菌株的應用，其特徵在於，所述的植物為板慄、核桃、楊樹或生薑。
4.一種如權利要求1所述的球毛殼ND35菌株的孢子培養方法，其特徵在於，步驟如下第一步球毛殼ND35菌株的子囊孢子產孢培養基組成馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂 18g，水 1000ml，pH 自然；第二步新鮮馬鈴薯去皮後切成邊長0. 5cm的小方塊，加水1000ml，煮沸後再加熱 30min,然後用四層紗布過濾，保留濾液，加入20g葡萄糖，18g瓊脂，定容至IOOOml，121°C滅菌25min備用；第三步將活化的球毛殼ND35菌株的菌絲餅接種於PDA平板上，25°C培養12-15天，可獲得大量子囊孢子；經過一段時間的低溫冷藏後，子囊孢子即可用1/2濃度的馬鈴薯葡萄糖液體培養基配製成濃度為IXlO6的孢子懸浮液用於固體菌劑培養的接種劑。
5.一種微生物菌劑，其特徵在於，其活性成分為權利1所要求所述的植物內生菌球毛殼菌ND35菌體及其胞外代謝產物。
6.如照權利要求5所述的微生物菌劑，其特徵在於，所述的微生物菌劑為固體菌劑。
7.如權利要求6所述的微生物菌劑，其特徵在於，所述的固體菌劑按照如下方法製備 第一步固體菌劑生產的原料為小麥粒、玉米粒、大米粒、棉籽殼、粉碎的玉米秸、麥秸、麥麩與蛭石混合物或各種生產培養平菇、木耳、金針菇食用菌的廢料-菌糠農副產品；第二步將第一步中的原料用自來水浸泡3-4小時，裝入聚丙烯塑膠袋中，兩端用繩紮緊，121 °C滅菌25min，涼透後從兩端接入孢子濃度約為1 X IO6的球毛殼ND35菌株子囊孢子懸浮液10ml，置於25°C條件下培養3-4天，打開袋口，以利於產孢，9-10天收起，晾乾後，用多功能高速植物粉碎機粉碎，製品為能通過40篩目的粉末，包裝好後放置在冷涼處備用。
8.如權利要求5-7任一所述的生物菌劑在防治植物病原真菌方面、促進植物生長發育方面和/或增強植物對逆境條件適應性方面的應用。
9.如權利要求9所述的生物菌劑的應用，其特徵在於，所述的植物為板慄、核桃、楊樹或生薑。
全文摘要
本發明公開了一種植物內生真菌球毛殼菌株、微生物菌劑及其應用，這種菌株命名為球毛殼(Chaetomium globosum)菌株ND35，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日2010年10月09日，其保藏編號為CGMCC No.4136。該菌株是一種具多種生防作用機制的生防益菌，具有廣譜高效抑制植物病原菌和促進多種植物生長的能力，適合工業化生產，貨架期長，適用於植物病害生物防治，可用於生產具有防治多種植物病害的生物殺菌劑產品和促進植物生長發育的多功能生物菌肥產品。
文檔編號C12N1/14GK102311925SQ20111023247
公開日2012年1月11日 申請日期2011年8月3日 優先權日2011年8月3日
發明者劉曉光, 張修國, 畢建傑, 米士偉, 高克祥 申請人:山東農業大學