一種利用乳糖培養基高效表達家蠶重組抗菌肽的方法與流程

2023-05-17 07:58:41 1

本發明屬於生物
技術領域：
，具體涉及一種利用乳糖培養基高效表達家蠶抗菌肽的方法，所述抗菌肽包括BmcecropinB6，BmcecropinD和Bmmoricin。
背景技術：
：抗菌肽存在於大量昆蟲細胞中，在正常組織中含量很低，分離純化難度大，化學合成的成本十分昂貴。因此，通過基因工程技術獲得的抗菌肽成為首選方法。現有技術通常採用異丙基-β-D-巰基半乳糖苷（IPTG）誘導表達外源重組蛋白和多肽，但由於IPTG具有潛在的毒性，對菌體生長有一定的抑制作用，且價格昂貴，而且表達的重組蛋白和多肽含量低，目前國內外已有研究用乳糖代替IPTG作為乳糖啟動子的誘導劑誘導重組蛋白的表達，但在家蠶抗菌肽的表達方面未見報導，目前，在家蠶中已有40餘種抗菌肽基因被發現，其中BmcecropinB6、BmcecropinD和Bmmoricin具有極強廣譜的抗菌性，能夠殺滅大多數的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌及真菌，預示這些家蠶抗菌肽具有廣泛的應用前景。現有技術應用IPTG作為誘導劑誘導的重組蛋白表達產率一般不超過30%，原因在於IPTG具有潛在毒性，對細菌的生長具有一定的抑制作用，而且該方法中細菌繁殖效率低，從而造成重組蛋白表達產率低。目前，人們還沒有研發出如何提高IPTG作為誘導劑誘導的重組蛋白表達產率的技術，僅僅通過調整IPTG濃度、誘導時間、誘導溫度來提高重組蛋白表達產率，但效果不佳。技術實現要素：本發明的目的就是針對上述問題提出一種利用乳糖培養基高效表達家蠶重組抗菌肽的方法，該方法能夠明顯提升BmcecropinB6、BmcecropinD和Bmmoricin重組蛋白表達產率，為家蠶抗菌肽的純化、活性鑑定及在食品、化妝品等領域的應用提供新的技術選擇。本發明的上述目的通過如下手段實現：一種利用乳糖培養基高效表達家蠶抗菌肽的方法，其特在於：（1）家蠶BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因的克隆以五齡七天家蠶中腸組織總RNA為模板，分別針對三種抗菌肽基因設計三對特異性引物，引物序列如下表一所示：表一合成抗菌肽基因的引物序列基因名稱上遊引物（5'→3'）下遊引物（5'→3'）產物大小（bp）BmcecropinB6CATGCCATGGTTAGGTGGAAGATCTTCAAGGACCCTCGAGTCAGATAGCTTTAGCCGAACCAAGG192BmcecropinDCAGTCCATGGGCAACTTCTTCAAGGATCCCGCTCGAGTCATTGTCCGAGAGCTTTTGCTTTTG114BmmoricinCATGCCATGGCAAAAATACCTATCAAGGCCATTAAGACTGTAGGAAAGGCAGTCGGTACCGCTCGAGTCAATGCTTTCTTTTCTTCGGTTTCAAGAAATTGAAAACATC201上遊引物下劃線處為NcoⅠ限制性內切酶位點，下遊引物下劃線處為XhoⅠ限制性內切酶位點，利用RT-PCR技術擴增BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因，PCR反應條件為：94°C×5min→（94°C×20s→55°C×20s→72°C×20s）×35cycles→72°C×10min→4°C×∞，利用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，採用膠回收試劑盒純化PCR產物；（2）pET32a-BmcecropinB6，pET32a-BmcecropinD，pET32a-Bmmoricin表達載體的構建採用NcoⅠ/XhoⅠ限制性核酸內切酶分別雙酶切BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因和pET32a表達載體，得到BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因片段和pET32a載體大片段，利用T4DNA連接酶分別連接雙酶切後的BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin和pET32a，構建pET32a-BmcecropinB6，pET32a-BmcecropinD，pET32a-Bmmoricin表達載體，轉化BL21感受態細胞，在含100μg/ml氨苄青黴素的固體LB平板上挑取單菌落，置含氨苄青黴素的的液體LB培養液中37℃搖床培養過夜，將菌液PCR鑑定為陽性的三種菌液送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序；（3）抗菌肽BmcecropinB6，BmcecropinD和Bmmoricin的表達將測序正確的三種陽性菌液分別分為兩份，一份按1%的接種量接種到10ml含有100μg/mlAmp的乳糖培養基，其組成為：50mmol/LNa2HPO4,50mmol/LKH2PO4,50mmol/LNH4Cl,5mmol/LNa2SO4,2mmol/LMgSO4,0.2×金屬離子,0.50%甘油,0.06%葡萄糖,0.20%乳糖，將10ml將含菌液的乳糖培養基置於大容量，空氣密度大的250ml容量三角瓶中，於37℃、220rpm培養12,14,16,18,20,22h，各收集1ml菌液；另一份10ml在37℃200rpm搖床培養至OD600=0.6時，加入終濃度為0.1mM的IPTG誘導表達重組蛋白，分別收集誘導0h-6h的菌液1ml，將收集的菌液10000rpm離心1min，棄上清，沉澱用5×蛋白上樣緩衝液和1×PBS懸浮，總體積100μL，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白表達情況，分析比較乳糖培養基誘導的BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin重組蛋白與IPTG誘導的重組蛋白表達產率差異。本發明採用大容量三角瓶和乳糖培養基替代IPTG進行BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin的誘導表達，該培養基中含有一定比例的葡萄糖和乳糖，在氧氣充足的情況下，葡萄糖耗盡後乳糖才被利用，目的蛋白開始表達。採用乳糖培養基誘導表達的最終菌體密度大，蛋白產量高，而且沒有毒性，適於重組蛋白的高效表達。該系統減少了菌液濃度測定和IPTG濃度對細胞毒性的影響，凝膠成像系統分析顯示，應用IPTG作為誘導劑誘導的BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin抗菌肽表達產率分別為22%，24%，23%，而應用乳糖培養基誘導的BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin抗菌肽表達產率高達41%，38%和34%，表達產率分別提高了19%，14%，11%，為BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin抗菌肽的高效表達和應用奠定了基礎。本發明應用乳糖培養基代替IPTG，一方面減少了IPTG對細菌的毒性，另一方面採用大容量瓶和乳糖培養基來培養細菌，該系統中氧氣充分，依據大腸桿菌對培養基中的碳源和能源的利用機制建立，即在自乳糖培養基中加入含有成比例的葡萄糖和乳糖時，在氧氣供應充分的條件下，大腸桿菌會優先選擇葡萄糖供應能量，待葡萄糖消耗完成之後，就開始攝取乳糖，乳糖經β-半乳糖苷酶作用生產中間代謝產物異乳糖，異乳糖就相當於IPTG，從而啟動T7RNA聚合酶的表達，既而啟動目的基因的表達，該方法減少了IPTG的毒性和不穩定性，使目的基因能高效表達，表達產率遠遠高於IPTG誘導水平。附圖說明圖1是pET32a原核表達載體的圖譜圖，pET32a大小5900bp，含有NcoⅠ和XhoⅠ多克隆位點。圖2是本發明BmcecropinB6抗菌肽在大腸桿菌細胞中重組表達的SDS-PAGE圖譜圖。圖3是本發明BmcecropinD抗菌肽在大腸桿菌細胞中重組表達的SDS-PAGE圖譜圖。圖4是本發明Bmmoricin抗菌肽在大腸桿菌細胞中重組表達的SDS-PAGE圖譜圖。圖2中，SDS-PAGE檢測家蠶重組抗菌肽BmcecropinB6表達產率M:Proteinmarker1:含pET32a空質粒的菌液2-8:IPTG分別誘導0,1,2,3,4,5,6h重組抗菌肽BmcecropinB6的表達9-14:乳糖培養基誘導12,14,16,18,20,22h重組抗菌肽BmcecropinB6的表達。圖3中，SDS-PAGE檢測家蠶重組抗菌肽BmcecropinD表達產率，M:Proteinmarker1:含pET32a空質粒的菌液2-8:IPTG分別誘導0,1,2,3,4,5,6h重組抗菌肽BmcecropinD的表達9-14:乳糖培養基誘導12,14,16,18,20,22h重組抗菌肽BmcecropinD的表達。圖4中，SDS-PAGE檢測家蠶重組抗菌肽Bmmoricin表達產率M:Proteinmarker1:含pET32a空質粒的菌液2-8:IPTG分別誘導0,1,2,3,4,5,6h重組抗菌肽Bmmoricin的表達9-14:乳糖培養基誘導12,14,16,18,20,22h重組抗菌肽Bmmoricin的表達。具體實施方式下面用實例進一步說明本發明實施過程和有益技術效果。為了達到上述目的，本發明採用的技術方案其步驟如下：大腸桿菌表達系統原核表達抗菌肽BmcecropinB6、BmcecropinD和Bmmoricin的方法主要包括：（1）家蠶BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因的克隆①取五齡七天家蠶中腸組織約1g，用DEPC水清洗乾淨，將中腸組織轉至處理好的研缽中，加液氮後研磨成粉末，然後按50-100mg組織/mLTRIzolReagent，直至樣品與TRIzol混勻，室溫放置5min後，加入1/5體積的三氯甲烷。充分震蕩混勻，4°C，12,000rpm離心15min。小心將上清轉移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫放置10min後，4°C，12,000rpm離心10min。棄上清，用70%乙醇洗滌RNA沉澱，4°C，8,000rpm離心10min。棄上清，室溫放置待酒精完全揮發，將晾乾後的RNA溶於適當體積的DEPC水。用1%瓊脂糖TAE凝膠電泳檢測RNA質量，同時用紫外分光光度計檢測RNA溶液的濃度和純度，最後將總RNA提取液樣品於-80°C下保存。②cDNA第一鏈合成反轉錄體系組成如下：總RNA1ng-1μgOligo（dT）12-18Primer（50μM/L）1μLRNasefreeddH2Oupto6μL上述反應體系在70°C保溫10min後迅速在冰上急冷2min以上，離心數秒使模板RNA/引物的變性溶液聚集於離心管底部。在上述離心管中配製下列反轉錄反應液：上述模板RNA/引物的變性溶液6μL5×M-MLVBuffer2μLdNTP(各10mM/L)0.5μLRNaseInhibitor(40U/μL)0.25μLRNaseM-MLV（RnaseH-）（200U/μL）0.25-1μLRNasefreeddH2Oupto10μL反轉錄條件為：42°C反應1h，70°C保溫15min後冰上冷卻，得到的cDNA溶液直接用於家蠶抗菌肽基因克隆。③引物根據GenBank上公布的BmcecropinB6（NM_001043566），BmcecropinD（NM_001043368），Bmmoricinm（AB006915）RNA序列，應用PrimerPrimer5.0引物設計軟體設計三對特異性引物如表一，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。④PCR反應用合成的特異性引物，以反轉錄得到的家蠶cDNA第一鏈為模板，分別擴增出兩端含有NcoⅠ和XhoⅠ位點的BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricinm基因，以滅菌的雙蒸水作為陰性對照。PCR反應體系如下：10×Buffer（含Mg2＋）5μL4×dNTPs（2.5mM）4μLUpstreamprimer（10μM/L）2μLDownstreamprimer（10μM/L）2μLcDNAFirst-strand1μLTaq（0.5u/μL）5μLddH2O31μLTotalVolume50μLPCR反應參數為：94°C×5min→（94°C×20s→55°C×20s→72°C×20s）×35cycles→72°C×10min→4°C×∞。用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，在60-80伏的電壓下進行電泳，25-30分鐘後在UVP凝膠成像系統上觀察並記錄結果。⑤PCR產物純化用膠回收試劑盒對PCR產物進行回收，具體步驟如下：估算PCR反應產物的體積，轉移到一個乾淨的1.5mLEppendorf管，加入4-5倍體積的NCPBuffer；將樣品轉移到2mLHiBindminiprepcolum純化柱上，10,000rpm離心1min，棄掉濾液；加700μLSPWBuffer（已加無水乙醇），10,000rpm離心1min，棄掉濾液；重複上一個步驟；棄廢液，將空管用10,000rpm離心1min；將HiBindminiprepcolum純化柱放到新的1.5mLEppendorf管中，加30-50μL去離子水或TEBuffer，10,000rpm，離心1min進行洗脫。純化的DNA貯存於-20°C備用。(2)pET32a-BmcecropinB6，pET32a-BmcecropinD，pET32a-Bmmoricin表達載體的構建①pET-32a質粒的抽提將含有質粒pET-32a的大腸桿菌BL21菌株分別接種於5mL含Amp（100μg/mL）的LB液體培養基中，37°C振蕩培養過夜。質粒的抽提採用E.Z.N.A.PlasmidMiniperpsKit，按說明書進行，具體操作步驟如下：在室溫下，取1mL菌液於1.5mL離心管，以10,000rpm離心1min；倒去上清液，加250μL溶液Ⅰ/RNaseA，充分懸浮菌體；加250μL溶液Ⅱ，溫和地上下顛倒4-6次，室溫放置2min，使細菌完全裂解；加350μL溶液Ⅲ，溫和地上下顛倒數次，10,000rpm離心10min；小心吸取上清液，加到放在2mL收集管的藍色HiBind柱上，以10,000rpm離心1min；倒掉液體，加500μLBufferHB，以10,000rpm離心1min；棄掉濾液，加750μL含乙醇的Washbuffer，以10,000rpm離心1min；以含乙醇的Washbuffer重複洗柱子1次；以10,000rpm離心1min，使柱子甩幹；將柱子放於1.5mL離心管中，加50-100μL去離子水或TEbuffer（pH8.0），以10,000rpm離心1min洗脫DNA。抽提得到的質粒，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，於-20°C保存備用。②pET-32a質粒和BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin目的基因的雙酶切pET-32a和BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin目的基因用NcoⅠ和XhoⅠ分別進行雙酶切，其反應總體積均為50μL，各組分如下：NcoⅠ(10U/µL)2μLXhoⅠ(10U/µL)2μL10×Buffer5μL0.1%BSA5μL表達載體質粒或目的片段15μLddH2O21μLTotalVolume50μL混勻後，點動離心，置於37°C水浴3h。③pET-32a質粒和BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin目的基因酶切產物的回收經NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切的質粒pET-32a和目的基因的酶切產物分別用0.8%和2.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳時採用新配製的0.5×TBE電泳緩衝液。電泳結束後，將凝膠放在紫外燈下，用刀片切割出含有目的片段的凝膠，從凝膠中回收純化pET-32a片段和目的片段，具體操作步驟如下：將切下的凝膠裝入離心管，按1mLBindingbuffer/g的比例加入Bindingbuffer，經50°C溫育10min後，將溶液轉移至放在2mL收集管的藍色HiBind柱上，10,000rpm離心1min，棄濾液。加入500µLQGbuffer，離心後用750µLPEbuffer洗滌兩次。將HiBind柱放入1.5mL離心管中，用EBbuffer溶解，13,000rpm離心2min，收集純化的目的片段，置於-20°C貯存備用。④BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin目的基因和pET32a的連接將酶切回收得到的BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因片段和已經線性化了的pET32a載體進行連接，連接反應體系如下：酶切後的BmCecropinB6或BmcecropinD或Bmmoricin基因6μL酶切後的pET32a2μLT4連接酶buffer1μLT4ligase1μL總體積10μL混勻，離心數秒後，於16°C連接過夜。連接產物用於轉化。⑤連接產物的轉化及陽性克隆的鑑定將製備好的10μL連接產物加入到裝有200μL大腸桿菌BL21感受態細胞的聚丙烯管中，輕輕旋轉混勻內容物，冰上放置30min；另外取一管加入1μL的空載體質粒作為轉化對照；將離心管放入預加溫至42°C的水浴中，熱擊90s，期間不要搖動離心管；快速將離心管轉移到冰浴中使細胞冷卻2min；每管加入1mL的37°C預熱LB培養基，37°C搖床上間應溫和搖動（<100rpm）60min；取200µL菌液塗布於含有AMP的LB平板上，37°C培養過夜。同時將空載體pET-32a也轉化至大腸桿菌BL21。從上述過夜培養的平板中挑取單個的菌落，接種於3mL含有AMP（100μg/mL）的LB液體培養基中，37°C培養過夜，直接以菌液作為模板進行PCR鑑定。採用T7和T7T通用引物和各目的基因的特異引物對菌液進行PCR鑑定。T7和T7T通用引物為：T7：5』-TAATACGACTCACTATAGGG-3』T7T：5』-GCTAGTTATTGCTCAGCG-3』PCR鑑定的反應體系及反應參數：菌液1µL上遊引物（10μM/L）1μL下遊引物（10μM/L）1μLdNTPs（2.5mM/L）2µL10×PCRreactionbuffer2µLTaq酶（0.5U/µL）2µLddH2O11µLTotalVolume：20µL將上述反應體系混勻，離心。PCR反應條件為：94°C×5min→（94°C×1min→50-55°C×30s→72°C×1min）×30cycles→72°C×10min→4°C×∞。擴增產物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統記錄結果。經PCR鑑定，插入片斷符合預期大小的克隆送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。（3）抗菌肽BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin的表達①重組蛋白的IPTG誘導表達37°C培養過夜的分別含有pET-32a-BmCecropinB6，pET-32a-BmcecropinD，pET-32a-Bmmoricin重組質粒的大腸桿菌BL21，按1:100比例接種到含有LB液體培養基（含100μg/mLAmp）中，37°C下250r/min振蕩培養至OD600約為0.6-0.8時加入IPTG至其終濃度為1.0mM以誘導目的基因的表達，收集誘導培養0-6h的菌液1mL制樣進行SDS-PAGE電泳檢測。②重組蛋白的高效表達分別挑取含有pET32a-BmCecropinB6，pET32a-BmcecropinD，pET32a-Bmmoricin重組質粒的單菌落，接種到4ml含有100μg/mlAmp的LB培養基中，37℃、220rpm培養過夜，再按1%的接種量接種到10ml含有100μg/mlAmp的乳糖培養基（50mmol/LNa2HPO4,50mmol/LKH2PO4,50mmol/LNH4Cl,5mmol/LNa2SO4,2mmol/LMgSO4,0.2×金屬離子,0.50%甘油,0.06%葡萄糖,0.20%乳糖）中，將該10ml含菌液的乳糖培養基置於250ml三角瓶中，37℃、220rpm培養12,14,16,18,20,22h，收集菌液，分別與IPTG誘導的菌液進行SDS-PAGE電泳分析，凝膠成像系統比較兩種方法誘導的重組蛋白表達產率差異。1.材料：RT-PCR擴增試劑盒購於上海生物工程有限公司，pET32a原核表達載體為Novagen公司產品，圖譜見圖1。膠回收試劑盒，小量質粒提取試劑盒購自AxyGen公司。2.工作流程：2.1本發明應用乳糖培養基高效表達家蠶重組抗菌肽的方法包括如下部分：(1)家蠶BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因的克隆：以五齡七天家蠶（即披露表中所填青松×皓月）中腸組織總RNA為模板，利用RT-PCR技術擴增得到抗菌肽CecropinB6基因。該RT-PCR擴增的具體方法如下：其中，PCR擴增所用的引物設計見表一，上遊引物含有NcoⅠ酶切位點，下遊引物含有XhoⅠ酶切位點。PCR反應的循環數、溫度和時間的設計如下：94°C×5min→（94°C×20s→55°C×20s→72°C×20s）×35cycles→72°C×10min→4°C×∞，然後，利用2.5％瓊脂糖凝膠電泳對得到的抗菌肽BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因進行PCR產物分析，並用膠回收試劑盒純化。(2)pET32a-BmCecropinB6，pET32a-BmcecropinD，pET32a-Bmmoricin表達載體的構建：用限制性內切酶NcoⅠ/XhoⅠ酶切BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因片段，然後分別將BmCecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin基因片段克隆入美國Novagen公司的表達載體pET32a，得到pET32a-BmCecropinB6，pET32a-BmcecropinD，pET32a-Bmmoricin重組表達載體。(3)抗菌肽BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin的表達：使用乳糖培養基和大容量三角瓶，37℃、220rpm搖床培養12,14,16,18,20,22h，收集菌液，與IPTG誘導的菌液進行SDS-PAGE電泳分析，比較兩者重組蛋白表達產率的差異。結果表明抗菌肽BmCecropinB6核苷酸大小192bp，編碼63個胺基酸，胺基酸序列為MNFAKILSFVFALVLALSMTSAAPEPRWKIFKKIEKMGRNIRDGIVKAGPAIEVLGSAKAVGK；BmcecropinD核苷酸大小186bp，編碼61個胺基酸，胺基酸序列為MKFSKIFVFVFAIVFATASVSAAPGNFFKDLEKMGQRVRDAVISAAPAVDTLAKAKALGQG；Bmmoricin核苷酸大小201bp，編碼66個胺基酸，胺基酸序列為MNILKFFFVFIVAMSLVSCSTAAPAKIPIKAIKTVGKAVGKGLRAINIASTANDVFNFLKPKKRKH；載體pET32a為原核表達載體，大小5900bp，含有T7啟動子和His-Tag標籤，設計擴增抗菌肽BmCecropinB6,BmcecropinD,Bmmoricin基因的特異性引物含NcoI和XhoI限制性內切酶位點。圖2,圖3，圖4中標記為M的是蛋白質標準分子量，1為轉化pET32a空質粒的菌液，2-8為IPTG誘導0-6h後BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin重組蛋白的表達情況，9-14為乳糖培養基誘導12,14,16,18,20,22h後BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin重組蛋白的表達情況，箭頭所示的條帶即為BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin，其分子量大小為14kDa，13kDa，17kDa，與預測的大小一致。序列表：BmcecropinB6核苷酸序列Atgaatttcgcaaagatcctatccttcgtcttcgctctggtgctggctttgagcatgaccagcgctgctcccgagcctaggtggaagatcttcaagaaaatagagaaaatgggcaggaatattcgtgacggcatcgtcaaagcgggcccagcgatcgaggtccttggttcggctaaagctgtcggaaaatga。BmcecropinD核苷酸序列Atgaaattctcgaaaattttcgttttcgtgttcgctattgttttcgccacggcttcggtctcggcagctcccggcaacttcttcaaggatcttgaaaaaatgggtcagagggttcgagacgccgtcatcagcgcggctccagcagtcgacaccctggcaaaagcaaaagctctcggacaaggatag。Bmmoricin核苷酸序列Atgaatattttaaaatttttctttgtttttattgtggcaatgtctctggtgtcatgtagtacagccgctccagcaaaaatacctatcaaggccattaagactgtaggaaaggcagtcggtaaaggtctaagagccatcaatatcgccagtacagccaacgatgttttcaatttcttgaaaccgaagaaaagaaagcattaa。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp