單酶切載體的構建方法
2023-05-17 08:00:16
單酶切載體的構建方法
【專利摘要】本發明提供了一種單酶切載體的構建方法，包括如下步驟：1)單酶切位點的篩選；2)在目的基因兩端引入酶切位點；3)對載體和目的基因進行酶切和電泳切膠回收；4)對目的基因和載體混合液進行溫度梯度預處理；5)使用連接T載體用的solutionI連接載體與目的基因。本發明提供了一種單酶切載體構建的新方法，極大地提高了單酶切連接效率，同時極大地縮短了其連接時間。通過本發明方法，單酶切連接效率顯著提高，連接時間只需90min左右，極大節約了人力、物力，降低了單酶切操作難度。
【專利說明】單酶切載體的構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及DNA重組技術，具體地說，涉及一種單酶切載體的構建方法。
【背景技術】
[0002] 表達載體的構建是轉基因技術的關鍵步驟，其主要過程是通過一系列酶切和連接 反應將目的基因表達框與載體重組，再將重組後的載體轉染宿主細胞，實現目的基因在宿 主細胞中的表達。目前酶切技術主要分為雙酶切和單酶切兩種。
[0003] 雙酶切是指載體構建時在載體序列上找到2個合適的酶切位點，同時在目的基因 的上下遊引入相應的酶切位點；然後通過雙酶切反應，在載體和目的基因上個形成2個不 同的粘性末端；最後通過連接反應，目的基因可以高效的並以特定方向插入到載體中。雙酶 切反應的優點是載體不會發生自連，目的基因的插入方向確定和較高的連接效率；限制雙 酶切應用的因素是要求載體合適位置上存在2個酶切位點，而且要求2種限制酶必須在同 一種緩衝液中具有高酶切活性。某些特殊的載體或研究者自己構建的載體就難以找到2個 合適的酶切位點，這個時候就需要用到單酶切技術。
[0004] 單酶切是指在載體的目的基因插入位點處只有一種可用的酶切位點，這樣目的基 因上下遊只能導入相同的酶切位點，經過酶切反應後，在載體和目的基因的兩端形成了 4 個相同的粘性末端，最後通過連接反應將目的基因插入載體中。限制單酶切技術應用的主 要問題是連接效率低，連接時間長。這是由於酶切後4個粘性末端相同，載體極易發生自身 連接，而且目的基因會以2種不同的取向隨機整合到載體中，這兩個因素極大的降低了單 酶切連接效率，只有雙酶切效率的5-10%左右。研究者嘗試了很多方法提高單酶切效率， 比如載體5,端去磷酸化等，但效率也不高，而且增加了操作步驟難度、以及核酸降解的機 會。無論是單酶切和雙酶切，其連接一般都是利用T4 DNA連接酶16°C過夜連接，連接時間 在10h以上。
【發明內容】
[0005] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種新的提高單酶切連接效率的單 酶切載體的構建方法。
[0006] 為了實現本發明目的，本發明提供一種單酶切載體的構建方法，包括如下步驟：
[0007] 1)單酶切位點的篩選；
[0008] 2)在目的基因兩端引入酶切位點；
[0009] 3)對載體和目的基因進行酶切和電泳切膠回收；
[0010] 4)對目的基因和載體混合液進行溫度梯度預處理；
[0011] 5)使用Takara公司的連接T載體用的solution I (主要成分為T4DNA連接酶 +Takara公司生產緩衝液）連接載體與目的基因。
[0012] 其中，步驟1)根據載體的結構和自身研究的需要確定一個限制性內切酶位點。
[0013] 其中，步驟2)在目的基因的5'和3'端非編碼區設計擴增引物，在上下遊引物的 5'端引入步驟1)確定的酶切位點，加上酶切位點相應的保護鹼基，利用高保真酶擴增目的 基因，擴增出5'和3'端含有相應的酶切位點的目的基因。
[0014] 其中，步驟3)將載體和目的基因分別同時酶切，酶切體系根據實際需要確定，一 般40-50 μ L。酶切反應結束後，酶切產物需要電泳分離並切膠回收，電泳時間不能太長，以 10-14min為宜，長時間電泳會損失核酸結構。切膠時紫外不能長時間照射膠面，避免損傷核 酸結構。
[0015] 進一步地，步驟4)載體與目的基因按物質量濃度1 :10的比例加入。
[0016] 載體和目的基因混合液按以下程序處理：
[0017] 80 °C ：3min ；
[0018] 55〇C ：15s ；
[0019] 45〇C ：15s ；
[0020] 16°C ：30s ；
[0021] 在16°C 30s結束後再加入solution I，在16°C下連接90min。
[0022] 作為優選，步驟4)連接反應的總體系為15-20 μ L。
[0023] (1) 80°C，3min的目的是為了增加核酸分子的內能，分子運動加劇，使處於自連狀 態下的載體分子解開，增加目的基因與載體結合的機率，而雙鏈在這一溫度不會解開；
[0024] (2) 55°C，15s和45°C，15s的目的是通過緩慢降溫實現目的基因與載體以粘性末 端相連，通過這一系列溫度的變化，可以增加目的基因與載體粘性末端配對；
[0025] (3) 16?，30s的目的是使體系溫度降到16?，加入連接反應液solution I，避免 高溫影響solution I中T4連接酶的活性。加入solution I時沿管壁加入，動作要輕，不 必混勻。
[0026] 前述的構建方法中，目的基因與載體連接後，還可包括如下步驟：
[0027] A、轉化感受態細胞
[0028] 連接反應完成後4 C保存，或直接轉化感受態。
[0029] (1)感受態取出後冰上融化，將連接產物全部加入感受態中，用移液槍稍稍混勻；
[0030] ⑵冰上靜置3〇min ;
[0031] (3)42°〇熱激6〇-9〇8;
[0032] ⑷冰上靜置lmin ;
[0033] (5)加入不含抗生素 LB培養液，37°C恆溫搖床培養lh，200r/min。
[0034] B、菌液塗板培養
[0035] (1)培養好的菌液離心2min，8000r/min ;
[0036] (2)用移液槍洗掉多餘上清，保留100 μ L左右，並混勻；
[0037] (3)用塗棒將100 μ L菌液均勻塗抹於含相應抗生素的培養皿上，37°C生化培養箱 中培養12h。
[0038] C、挑斑培養
[0039] 培養皿培養12h後，菌落長出挑取100個左右單克隆菌落，在lmL含相應抗生素的 LB培養液中培養5h左右。
[0040] D、菌落PCR鑑定
[0041] 對挑斑培養後的菌液進行PCR鑑定，PCR體系如下：
[0042] 組分 反應體積（μι) PCR Mix 5 正向引物 0,5 反向引物 0.5 菌液 1 dd H20 To 10
[0043] 根據不同目的基因和載體設計不同的引物，單酶切載體構建需要跨載體和目的片 段進行引物設計。根據不同的引物和模板設定PCR程序，目的是鑑定菌落中是否成功轉染 上了目的載體。PCR產物電泳後如果出現相應大小的條帶，證明轉染上了目的載體。
[0044] 本發明的有益效果在於：
[0045] 本發明提供了一種單酶切載體構建的新方法，極大地提高了單酶切連接效率並極 大地縮短了其連接時間。通過本發明方法，單酶切連接效率顯著提高，同時連接時間只需 90min左右，極大節約了人力、物力，降低了單酶切操作難度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0046] 圖1為pBCl乳腺特異表達載體結構圖。
[0047] 圖2為本發明ΗΙ0ΜΤ切膠回收產物的電泳檢測圖。
[0048] 圖3為溫度處理組菌斑。
[0049] 圖4為對照組菌斑。
[0050] 圖5為溫度處理組PCR鑑定。
[0051] 圖6為對照組PCR鑑定。
[0052] 圖7為溫度處理組與對照組菌落PCR陽性率比較。
【具體實施方式】
[0053] 以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
[0054] 實施例1 pBCl-HIOMT乳腺特異表達載體的構建
[0055] pBCl乳腺特異表達載體購自Invitrogen公司。該載體的結構比較單一，只有1個 氨苄抗性基因，沒有多克隆位點（MCS)。整個載體上只有Xhol、Notl、SalI3個可用的酶切 位點，而且要求目的基因必須插入Xhol位點處才能正常的表達（圖1)。因此在構建載體時 只能選擇單酶切方法。
[0056] 1、帶有Xhol酶切位點的ΗΙ0ΜΤ基因全長的克隆
[0057] (1)HI0MT全長克隆引物的設計
[0058] 我們在ΗΙ0ΜΤ基因的5'和3'端非編碼區分別設計上下遊引物，在上下遊引物的 5'端引入了 Xhol限制性內切酶的識別位點CTCGAG，並加入保護鹼基CCG，引物序列如下：
[0059] 正向引物：CCGCTCGAGCCACCATGTGCTCCCAGGAG ;
[0060] 反向引物：CCGCTCGAGCGGTCACTTTCTGGCCAAGA。
[0061] (2) ΗΙ0ΜΤ 全長 PCR 擴增
[0062] 以綿羊松果體cDNA為模板，利用上述引物對和PrimeSTAR? Max高保真酶 (Takara:R045Q)進行PCR擴增。反應體系如下：
[0063] 組分 反應體積（μΜ Prime star Mix 25 正向引物 2.5 反向引物 2.5 模板 5 dd H20 To 50
[0064]
[0065] 98°C 預變性 2min ;
[0066] 98°C變性 10s，55°C退火 15s，72°C 40s，35 個循環；
[0067] 72°〇延伸51^11，41：保存。
[0068] 2、PCR產物電泳與切膠回收
[0069] PCR結束後，進行電泳，電泳緩衝液為TAE，瓊脂糖凝膠濃度為1 %，電壓90v，電泳 時間12min，切膠回收，膠回收試劑盒購自Takara(D301)。回收產物經電泳檢測（見圖2)， 目的條帶位於1000bp-1500bp之間，與目的基因（1058bp)大小相當（參閱NCBI核酸數據 庫），表明目的基因成功被克隆並引入酶切位點。
[0070] 3、載體與目的基因的酶切與連接
[0071] (l)pBCl和ΗΙ0ΜΤ的酶切與產物回收
[0072] 將pBCl和上一步驟中回收到的ΗΙ0ΜΤ基因分別同時進行Xhol酶切，Xhol限制性 內切酶購自Takara(1094A)，酶切體系如下：
[0073] 組分 反應體積（μ? ) Xhol 2 H builcr 4 DNA < 2 μ g dd H20 To 40
[0074] 37°C酶切4h，反應結束後，酶切產物需要電泳分離並切膠回收，按照步驟2中的方 法進行操作。
[0075] ⑵載體pBCl與ΗΙ0ΜΤ連接
[0076] 選擇 Takara 公司的連接 T 載體用的 solution I (catalog :6013)。將 pBCl 與 ΗΙ0ΜΤ 回收產物經測定濃度分別為66. 23ng/l·! L、42. 54ng/l·! L。按1 :10的比例加入（物質量濃 度），經計算，20 μ L反應體系中pBCl和HIOMT分別加6 μ L、4 μ L。載體和目的基因混合液 按以下程序處理並設立對照組（無以下程序處理）：
[0077] 80 °C ：3min ；
[0078] 55〇C ：15s ；
[0079] 45〇C ：15s ；
[0080] 16 :30s。
[0081] 在16°C 30s結束後加入solution I，16°C連接90min。連接體系如下：
[0082] 組分 反應體積（μ? ) pBCl膠回收產物 6 HIOMT膠回收產物 4 Solutionl 10 終體積 20
[0083] 4、連接產物轉化感受態細胞
[0084] 連接反應完成後產物直接轉化感受態細胞。感受態細胞選擇ToplO菌株，購自天 根公司（CB104)。
[0085] (1) ToplO感受態菌株從_80°C冰箱取出後冰上融化，將連接產物全部加入感受態 細胞中，用移液槍稍稍混勻；
[0086] ⑵冰上靜置30min ;
[0087] (3)421：熱激758;
[0088] ⑷冰上靜止lmin ;
[0089] (5)加入不含氨苄（AMP) LB培養液，37°C恆溫搖床培養lh，200r/min。
[0090] 5、菌液塗板，培養
[0091] (1)將步驟4中培養好的菌液離心2min，8000r/min ;
[0092] (2)用移液槍吸掉多餘上清，保留100 μ L左右，並混勻；
[0093] (3)用塗棒將100 μ L菌液均勻塗抹於含相應抗生素的培養皿上，37°C生化培養 箱中培養12h。
[0094] 6、挑斑培養
[0095] 培養皿培養12h後，菌落長出挑取單克隆菌落，在1ml含50 μ g/mlAMP的LB培養 液中培養5h左右。我們發現溫度處理組菌斑的數量明顯低於對照組，這表明通過溫度處理 有效地降低了 pBCl載體自連的現象（圖3、4)。
[0096] 7、菌落PCR鑑定
[0097] 克隆引物用於PCR鑑定。
[0098] 正向引物：CCGCTCGAGCCACCATGTGCTCCCAGGAG ;
[0099] 反向引物：CCGCTCGAGCGGTCACTTTCTGGCCAAGA。
[0100] 將步驟7中培養好的菌液進行PCR鑑定，PCR體系如下：
[0101] 組分 反應體積（μυ PCR Mix 5 Forward premier 0,5 Reverse premier 0.5 菌液 1 dd H20 To 10
[0102] 951：預變性1〇1^11，1個循環；951：變性3〇8,581：退火3〇8,721：延伸5〇8,30個循 環；72°C補充延伸5min，1個循環，4°C保存。經PCR鑑定，溫度處理組轉入pBCl-HIOMT陽性 率為11.33±1.6%，顯著高於對照組的3. 9±0. 7% (P〈0. 05)(見圖5、圖6、圖7)。
[0103] 圖5、6中大小為1058bp的條帶為目的條帶，表明其相對應的樣品為陽性菌落。
[0104] 實施例2單酶切載體構建方法的優化
[0105] 本實施例針對400個樣品在16°C下分別進行不同連接時間的PCR，陽性率見表1 :
[0106] 表1不同連接時間對陽性率的影響
[0107]
【權利要求】
1. 一種單酶切載體的構建方法，其特徵在於，包括如下步驟： 1) 單酶切位點的篩選； 2) 在目的基因兩端引入酶切位點； 3) 對載體和目的基因進行酶切和電泳切膠回收； 4) 對目的基因和載體混合液進行溫度梯度預處理； 5) 使用連接T載體用的solution I連接載體與目的基因。
2. 根據權利要求1所述的構建方法，其特徵在於，所述步驟2)在目的基因的5'和3' 端非編碼區設計擴增引物，在上下遊引物的5'端引入步驟1)確定的酶切位點，加上酶切位 點相應的保護鹼基，利用高保真酶擴增目的基因，擴增出5'和3'端含有相應的酶切位點的 目的基因。
3. 根據權利要求1所述的構建方法，其特徵在於，步驟4)載體與目的基因按物質量濃 度1 :1〇的比例加入。
4. 根據權利要求3所述的構建方法，其特徵在於，步驟4)載體和目的基因混合液按以 下程序處理： 80 °C ：3min ； 55。。：15s ; 45。。：15s ; 16°C ：30s ； 在16°C 30s結束後再加入solution I，在16°C下連接90min。
5. 根據權利要求3所述的構建方法，其特徵在於，步驟4)連接反應總體系為 15_20 u L〇
6. 根據權利要求1所述的構建方法，其特徵在於，目的基因與載體連接後，還包括如下 步驟： A、 轉化感受態細胞； B、 菌液塗板培養； C、 挑斑培養； D、 菌落PCR鑑定。
【文檔編號】C12N15/66GK104059932SQ201410246859
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月5日 優先權日:2014年6月5日
【發明者】劉國世, 何長久, 朱寬峰, 孔瑾, 汪鋒, 田秀芝, 宋玉坤 申請人:中國農業大學