催化丹參酮類化合物生物合成途徑C20位甲基羥基化的關鍵CYP450基因的製作方法
2023-05-17 08:03:36 1
本發明涉及利用酵母表達和體外酶促反應方法對從丹參中篩選得到的一個CYP450基因及其表達蛋白進行活性分析，涉及到丹參主要活性成分丹參酮類化合物生物合成途徑中CYP450基因及其編碼產物與應用，屬於藥用植物基因工程領域。
背景技術：
藥用植物有效成分的形成是植物次生代謝途徑中特有基因表達的產物，隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨具特色又有廣闊應用前景的藥用植物次生代謝合成相關功能基因的研究逐漸成為研究的熱點，這些基因的克隆將為詮釋藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調控機制、為藥材品質的形成提供理論基礎，同時為利用生物技術提高目標成分含量或直接生產有效成分或中間體帶來廣闊的應用前景。
丹參為唇形科鼠尾草屬藥用植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的乾燥根及根莖，具有祛瘀止痛，活血通經，清心除煩等功效，其主要有效成分包括脂溶性的丹參酮和水溶性的丹酚酸。其中丹參酮類主要包括隱丹參酮、丹參酮IIA、丹參酮IIB和二氫丹參酮等，具有擴張血管、抗血栓、抗菌消炎以及抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用，在製藥以及美容、化妝品等領域得到廣泛應用。丹參酮類化合物為松香烷型二萜醌類化合物，其生物合成在萜類化合物前體物質合成的基礎上，通過異戊二烯基轉移酶(Prenyl Transferases，PT)的作用產生20個碳原子的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(Geranylgeranyl Diphosphate，GGPP)，GGPP進一步在丹參柯巴基焦磷酸合酶(S.miltiorrhiza Copalyl Diphosphate Synthase，SmCPS)和丹參類貝殼杉烯合酶(S.miltiorrhiza ent-kaurene Synthase，SmKS)的作用下形成丹參類化合物的基本骨架次丹參酮二烯(Miltiradiene)，在次丹參酮二烯的基礎上經過甲基化和羥基化等形成丹參酮類化合物，其中細胞色素P450(CYP450)酶在修飾過程發揮著重要作用。
CYP450酶為血紅蛋白結合蛋白，在所有已知的CYP450酶中都存在一個保守的血紅素結合域，是鑑定該基因的一個重要特徵。擬南芥基因組中有272個CYP450基因，水稻基因組注釋顯示有457個CYP450基因，如此龐大的基因家族反映了植物次生代謝物的複雜多變。各種CYP450酶催化的反應廣泛並且複雜，包括：羥基化、N-、O-和S-端的脫烷基化、環氧基化、脫氨基作用、脫硫、脫滷作用和過氧化反應等。儘管催化反應各異，催化機理卻相同，即通過NADPH或者NADH為CYP450傳遞電子，激活氧分子，將其中的一個氧插入到底物上，同時生成一分子水。CYP450酶作為萜類、黃酮類、脂肪酸類和植物激素等合成代謝途徑的一類重要酶蛋白，不但催化相關代謝反應，由於大多數的CYP450蛋白均有一段內質網膜定位蛋白，因此在代謝區室(Metabolon)的酶複合體中還具有固定酶複合體的作用。隨著分子生物學以及相關檢測技術的不斷發展，次生代謝途徑相關的CYP450基因功能逐漸得以驗證。真核表達、原核表達以及RNA幹擾(RNA Interference)等技術在CYP450基因的功能驗證中發揮了重要作用。近年來利用真核表達以及RNAi技術使得CYP450酶在紫杉酚、青蒿素、植物抗毒素等代謝途徑中的重要作用逐漸被解析。但是作為在植物次生代謝中發揮作用的CYP450表達量相對較低，並且大多CYP450蛋白具有嚴格的催化 底物結構特異性，同時基因組中廣泛存在的CYP450基因為次生代謝相關基因的克隆和功能驗證提供了難度，使之成為了近年來國際學術界的研究熱點之一。
本實驗室在前期研究的基礎上已克隆到了丹參酮化合物合成途徑的上遊的相關關鍵酶基因，並通過構建工程菌產生了丹參酮化合物的前體次丹參酮二烯、鐵鏽醇及11-羥基鐵鏽醇。本發明涉及的是催化11-羥基鐵鏽醇(11-hydroxy ferruginol)和11-羥基柳杉酚(11-hydroxy sugiol)在C-20的羥基化分別產生丹參酮類化合物合成途徑中間產物11，20-二羥基鐵鏽醇(11，20-dihydroxy ferruginol)和10-羥甲基四氫丹參新酮(10-methyloltetrahydromiltirone)，以及11，20-二羥基柳杉酚(11，20-dihydroxy sugiol)的關鍵CYP450酶基因，該基因是首次從丹參中得到的丹參酮類生物合成的關鍵CYP450基因，依據CYP450基因命名法則命名為CYP76AK1。在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報導過本專利申請中涉及的CYP76AK1基因及其胺基酸序列。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一個丹參酮化合物生物合成代謝途徑的CYP450基因CYP76AK1，其編碼的蛋白在含有NADPH的緩衝體系中能催化11-羥基鐵鏽醇和11-羥基柳杉酚分別生成11，20-二羥基鐵鏽醇和11，20-二羥基柳杉酚，而11，20-二羥基鐵鏽醇能夠自發進行氧化作用形成丹參酮鄰苯二醌結構10-羥甲基四氫丹參新酮。
本發明提供了一種與丹參酮類化合物合成代謝有關的基因：CYP76AK1，它是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；
2)與序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有一個或幾個鹼基突變，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
一種由上述基因CYP76AK1編碼的蛋白質，具有序列表中SEQ ID No.2的胺基酸殘基序列以及具有SEQ ID No.2的胺基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白質。
本發明SEQ ID No.1的DNA序列由1512個鹼基組成，編碼序列表中由503個胺基酸殘基組成的蛋白質序列SEQ ID No.2。
本發明克隆的基因CYP76AK1在積累丹參酮類化合物的丹參根中表達明顯高於不積累丹參酮類化合物的莖葉等地上部分。
含有本發明基因CYP76AK1的表達載體、細胞系及宿主菌和使用該基因在調節和生產植物二萜類化合物及丹參育種中的應用也在本發明的保護範圍之內。將CYP76AH3基因克隆到真核表達載體pESC-His的限制性內切酶BamH I和Sal I位點間，構建帶有CYP76AH3基因的重組表達載體pESC-CYP76AH3，同時將SEQ ID No.1基因克隆到真核表達載體pESC-His和重組表達載體pESC-CYP76AH3的限制性內切酶EcoR I和Sep I位點間，構建帶有CYP76AK1基因的重組表達載體pESC-CYP76AK1和pESC-CYP76AH3-CYP76AK1，轉入酵母菌株WAT11中表達，宿主菌採用半乳糖誘導表達。提取表達菌株微粒體，加入到以鐵鏽醇和11-羥基柳杉酚為底物的體外酶促反應體系中，正己烷萃取反應產物，LC-MS 分析。鐵鏽醇在CYP76AH3和CYP76AK1蛋白酶的共同催化下，生成了11，20-二羥基鐵鏽醇，且此化合物可進一步自氧化生成10-羥甲基四氫丹參新酮，11-羥基柳杉酚在CYP76AK1蛋白酶的催化下生成11，20-二羥基柳杉酚。本發明與丹參酮類化合物合成有關的基因具有CYP450基因的特徵結構域，酶促反應分析發現該基因催化11-羥基鐵鏽醇和11-羥基柳杉酚的C-20羥基化形成丹參酮類化合物中間產物11，20-二羥基鐵鏽醇、10-羥甲基四氫丹參新酮和11，20-二羥基柳杉酚，對於調節和生產植物二萜類化合物及培育高品質的丹參具有重要的理論及實際意義。
附圖說明
圖1 CYP76AK1基因在不同組織部位的表達情況
Root：根，Stem：莖，Leaf：葉
圖2 CYP76AK1基因編碼蛋白酶促反應產物LC-MS分析
A：以鐵鏽醇為底物進行酶促反應，提取離子317.2(m/z)(11，20-二羥基鐵鏽醇)的負離子質譜圖；B：以鐵鏽醇為底物進行的酶促反應，提取離子315.2(m/z)(10-羥甲基四氫丹參新酮)的負離子質譜圖；C：以11-羥基柳杉酚為底物進行的酶促反應，提取離子331.2(m/z)(11，20-二羥基柳杉酚)的負離子質譜圖
圖3 11，20-二羥基鐵鏽醇的結構分析
a：高分辨質譜圖；b：HMBC，HMBC，1H-1H COSY和ROESY關係；c：1H NMR譜；d：13C NMR譜；e：HSQC譜；f：HMBC譜；g：1H-1H COSY譜；h：ROESY譜
圖4：10-羥甲基四氫丹參新酮的結構分析
a：高分辨質譜圖；b：HMBC關係；c：1HNMR譜d：13CNMR譜；e：HSQC譜；f：HMBC譜
圖5 11，20-二羥基柳杉酚結構分析
a：高分辨質譜圖；b：HMBC關係；c：1H NMR譜d：HMBC譜
圖6 CYP76AK1基因編碼蛋白催化功能圖示
A：CYP76AK1基因編碼蛋白對11-羥基鐵鏽醇的催化作用；B：CYP76AK1基因編碼蛋白對11-羥基柳杉酚的催化作用
具體實施方式
實施例1：丹參中細胞色素P450基因的克隆
1、取盛花期的丹參根，利用Trizol法提取丹參的總RNA，利用Invitrogen的5』和3』RACE試劑盒分別進行擴增，得到CYP76AK1基因的5』和3』末端序列。
2、全長cDNA的克隆和測序
對5、和3』RACE結果進行拼接，搜索ORF區域，設計全長基因引物，以cDNA為模板進行擴增。瓊脂糖凝膠電泳表明約在1500bp處出現特異片段，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara)回收目標片段，克隆至pGEM-T easy載體(Promega)中，鑑定陽性克隆並進行測序驗證(北京華大基因)，用於表達載體的構建。
實施例2、CYP76AK1基因序列的生物信息學分析以及組織表達分析
1、本發明涉及的丹參二萜合成代謝途徑CYP450基因CYP76AK1基因全長開放讀碼框(ORF)的長度為1512bp，編碼503個胺基酸，詳細序列見序列表中的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。將CYP76AK1全長開放讀碼框用BLAST程序在NCBI資料庫中進行同源性檢索，該基因在胺基酸水平上比對分析顯示，丹參CYP76AK1基因編碼的蛋白質胺基酸序列與其它物種的同源性較低。
2、提取盛花期的丹參根、莖和葉的RNA，利用逆轉錄試劑盒(Fermentas)進行逆轉錄，以β-actin為內參，進行半定量PCR，半定量PCR的正向引物為：5』-CTACTCCACCCCGACAA-3』，反向引物為：5』-CGGATTCCTCCACGAT-3』。結果表明CYP76AK1基因在丹參根中的表達明顯比不積累丹參酮化合物的莖葉中高(圖1)。
實施例3、CYP76AK1基因真核表達及功能分析
1、酵母表達載體的構建
設計CYP76AH3基因帶有BamH I和Sal I酶切位點的引物，進行PCR擴增，將克隆到的丹參CYP76AH3基因的開放閱讀框，插入到酵母表達載體pESC-His的BamH I和Sal I酶切位點之間，獲得重組質粒pESC-CYP76AH3，進行PCR和酶切鑑定。設計CYP76AK1基因帶有EcoR I和Sal I酶切位點的引物，進行PCR擴展，將克隆得到的丹參CYP76AK1基因的開放閱讀框，插入到酵母表達載體pESC-His和重組質粒pESC-CYP76AH3的EcoR I和Sal I酶切位點之間，獲得重組質粒pESC-CYP76AK1和pESC-CYP76AH3-CYP76AK1
2、誘導表達
將構建的重組質粒pESC-CYP76AH3，pESC-CYP76AK1，pESC-CYP76AH3-CYP76AK1及酵母表達載體pESC-His轉化表達宿主菌WAT11，利用半乳糖進行誘導表達，所得菌體製成微粒體用於進行體外酶促分析。
3、丹參CYP76AK1的功能分析
緩衝體系加入微粒體進行催化反應，緩衝體系包括100mM的Tric-HCl(pH 7.4)、500μM NADPH及NADPH再生體系和100μM底物(鐵鏽醇或11-羥基柳杉酚)，30℃反應4小時。反應完全後加入等體積正己烷萃取催化產物，進行LC-MS分析。
結果發現以鐵鏽醇為底物，包含有重組表達載體pESC-CYP76AH3-CYP76AK1催化組與僅含有pESC-CYP76AH3、pESC-CYP76AK1及空載體的催化組相比，其反應產物在總離子圖318(m/z)處有新物質產生(圖2)，且此化合物容易自發形成316(m/z)。高分辨質譜和核磁對產物結構進行表徵，最終確定CYP76AK1蛋白酶催化11-羥基鐵鏽醇的產物為11，20-二羥基鐵鏽醇，其自氧化後形成10-羥甲基四氫丹參新酮。以11-羥基柳杉酚為底物，包含有CYP76AK1基因重組表達載體催化組與含空載體及其他基因表達載體的催化組對照，反應產物在總離子圖332(m/z)處有新物質產生。高分辨質譜和核磁對產物結構 進行表徵，最終確定CYP76AK1蛋白酶催化11-羥基柳杉酚生成11，20-二羥基柳杉酚。說明CYP76AK1基因編碼的蛋白在丹參酮類化合物合成代謝途徑中能催化11-羥基鐵鏽醇和11-羥基柳杉酚的C-20羥基化形成丹參酮類化合物中間產物11，20-二羥基鐵鏽醇、10-羥甲基四氫丹參新酮和11，20-二羥基柳杉酚。