使用重組棒狀細菌發酵製備l－胺基酸的方法
2023-05-03 11:52:41
專利名稱：使用重組棒狀細菌發酵製備l－胺基酸的方法
技術領域：
發現一些化學化合物、特別是L-胺基酸、維生素、核苷及核苷酸及D-胺基酸用於人用醫藥及製藥工業，用於化妝品業、食品業及動物營養。
許多這些化合物是通過發酵微生物、優選棒狀細菌菌株製備，特別是從穀氨酸棒桿菌(corynebacterium glutamicum)中製備的。
由於L-胺基酸的極其重要性，已持續進行改良生產方法的嘗試。生產方法的改良可涉及發酵的技術特徵，如攪拌和供氧，或培養基的組分如發酵期間的糖濃度，或生產加工方法，例如通過離子交換層析或微生物本身的固有生產性質。
為改良這些微生物的生產性質，可使用誘變、選擇及突變體選擇等方法。以此方式可獲得抗代謝物例如賴氨酸類似物S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸或者甲硫氨酸類似物α-甲基-甲硫氨酸、乙硫氨酸、正亮氨酸、N-乙醯基正亮氨酸、S-三氟甲基高半胱氨酸、2-氨基-5-heprenoit acid、硒代甲硫氨酸、甲硫氨酸sulfoxamine、methoxine、1-氨基環戊烷羧酸抗性的菌株，或者對於調節重要性代謝物是營養缺陷的並產生L-胺基酸的菌株。
一段時間以來，重組DNA技術也已經用於生產胺基酸的穀氨酸棒桿菌菌株的改良，其中擴增特定的胺基酸生物合成基因並研究對L-胺基酸的生產的作用而進行。
發明目的本發明人提供了用微生物、優選棒狀細菌發酵製備L-胺基酸、特別是L-甲硫氨酸的改良方法的新基礎。
發明描述當下文提及L-胺基酸或胺基酸時，是指選自如下的一或多種蛋白質胺基酸，包括其鹽L-天冬氨酸、L-天冬醯胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-穀氨酸、L-穀氨醯胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸。特別優選L-甲硫氨酸。
蛋白質胺基酸是指在天然蛋白質中出現的胺基酸，即在微生物、植物、動物和人體蛋白質中出現的胺基酸。它們作為蛋白質的結構實體(entities)，通過肽鍵彼此連接。
下文提及的L-甲硫氨酸或者甲硫氨酸也指其鹽，例如甲硫氨酸鹽酸鹽或者甲硫氨酸硫酸鹽。
從發酵介質中攝取甲硫氨酸對於甲硫氨酸的生產非常有意義，因為分泌產物的可能再吸收會降低生產速度。本發明中例如針對穀氨酸棒桿菌而描述的被弱化的基因yaeE、abc和yaeC編碼一起形成MetD2甲硫氨酸攝取系統的ATP結合蛋白ABC和通透酶YaeE，及編碼周質結合蛋白(periplasmatic binding protein)Yaec。
對於MetD2甲硫氨酸攝取系統的編碼基因yaeC、abc和yaeE的一或多個的弱化、特別是失活，與這些基因未弱化或失活的起始微生物相比改良了相應棒狀細菌中L-甲硫氨酸的生產。
本發明的目的是提供一種使用重組微生物、優選棒狀細菌發酵製備L-胺基酸的方法，所述微生物特別已經生產L-胺基酸，其與起始微生物相比從周圍介質中較少地吸收甲硫氨酸或者不吸收甲硫氨酸，其中編碼MetD2甲硫氨酸攝取系統的yaeC、abc和yaeC編碼核苷酸序列中的一或多個被弱化或者特別是被失活或者以較低水平表達。
本發明的另一個目的是發酵製備L-胺基酸的方法，其中進行如下步驟(a)在培養基中發酵生產L-胺基酸的重組微生物、優選棒狀細菌，其與起始微生物相比從周圍介質中較少地或者不吸收甲硫氨酸，且其中編碼MetD2甲硫氨酸攝取系統的yaeE、abc和yaeC編碼基因中的至少一個被弱化，特別是被失活或者較低水平表達；(b)富集培養基或者細菌細胞中的L-胺基酸；(c)分離希望的L-胺基酸，其中任選地，發酵肉湯的成分和/或生物量部分(＞0-100％)或者全部保留在終產物中。
應用的微生物、優選棒狀細菌在弱化或者失活從周圍介質中攝取甲硫氨酸之前已經生產L-胺基酸、尤其是L-甲硫氨酸，甲硫氨酸攝取的弱化或者失活例如通過弱化或者失活yaeE、abc和yaeC基因中的一或多個而實現。
發現通過弱化或者失活MetD2甲硫氨酸攝取系統的yaeE、abc和yaeC編碼基因中的一或多個而實現從周圍介質中較少地或不吸收甲硫氨酸的微生物、優選棒狀細菌增強了L-胺基酸、特別是L-甲硫氨酸的生產。
所述穀氨酸棒桿菌基因的核苷酸序列對於最近的技術領域是已知的，可以引用不同的專利申請和國立醫學圖書館(National Libraryof Medicine，Bethesda，MD，USA)的國家生物技術信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)的資料庫中可獲得。
yaeC-基因名稱周質結合蛋白YaeC功能MetD2甲硫氨酸攝取系統的一部分參考文獻EP1108790的序列7061和709登記號AX127145和AX120793abc-基因名稱ATP結合蛋白ABC功能MetD2攝取系統的一部分參考文獻EP1108790的序列7061、708、7060和707；WO0100805的序列363；WO0100844的序列509登記號AX127145、AX120792、AX127144、AX120791、AX066781、AX065383yaeE-基因名稱通透酶YaeE功能MetD2甲硫氨酸攝取系統的一部分參考文獻EP0100805的序列7060、7061和706；WO0100805的序列365登記號AX127144、AX127145、AX120790、AX066783根據本發明可以使用本文所述的編碼yaeC、abc和yaeE基因的序列。另外，可以使用所述基因的等位基因，等位基因是通過遺傳密碼的簡併性質或者通過中性功能「有義突變」而產生的。
優選的實施方案可見於權利要求書中。
文中術語「弱化」是指降低或失活微生物中由相應的DNA編碼的一或多種酶系統或者蛋白質的胞內活性，例如使用弱啟動子或編碼具有較低活性的相應酶的基因或等位基因或者使相應的基因或酶或蛋白質失活，及如果需要任選組合這些措施。
通過弱化步驟，與野生型蛋白質或者起始微生物中蛋白質的活性或濃度相比，相應蛋白質的活性或濃度通常降低了的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或者0-5％。
術語「較低」指的是與MetD2甲硫氨酸攝取系統未被弱化或失活的起始微生物相比，重組微生物的攝取能力具有相同的百分比。
蛋白質濃度的降低可以通過一維和二維常用蛋白質分離技術及隨後使用適當的評價軟體經光學鑑別凝膠中蛋白質濃度而檢測。製備棒狀細菌的蛋白質凝膠及鑑別該蛋白質的方法由Hermann等(Electrophoresis，221712-23(2001))描述。蛋白質濃度的分析也可以通過與要驗證的蛋白質的特異性抗體進行Western印跡雜交(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY，(1989))，隨後用適當的軟體光學解釋以確定濃度(Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum 532-39；Lottspeich，Angewandte Chemie 1112630-2647(1999))。DNA結合蛋白的活性可以使用DNA條帶遷移分析(也稱作凝膠滯留分析)測定，如教科書Bioanalytik(Lottspeich/Zorbas，Spektrum AkademischerVerlag GmbH，Heidelberg，Germany，1998)所述，並由Wilson等(J.Bacteriol.1832151-2155(2001))所應用。DNA結合蛋白對其它基因表達的作用可以使用Reportergen-Assays的不同方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning；a Laboratory Manual.2ndEd.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)證實。
本發明的微生物可以從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉、纖維素，或者從甘油和乙醇中生產胺基酸。所述微生物是棒狀細菌，尤其是棒桿菌屬(corynebacterium)。對於棒桿菌屬，提及的是穀氨酸棒桿菌，本領域技術人員已知其生產L-胺基酸的能力。
合適的棒桿菌屬菌株尤其是穀氨酸棒桿菌，尤其是野生型菌株。
穀氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806嗜乙醯乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870Corynebacterium melassecola ATCC17965Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067乳糖發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869，和叉開短桿菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020。
或者，例如生產L-甲硫氨酸的菌株穀氨酸棒桿菌ATCC21608具有ATCC名稱的菌株可以得自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA)。
具有FERM名稱的菌株可以得自National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology(AIST Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba Ibaraki，Japan)。所提及的菌株Corynebacteriumthermoaminogene(FERM BP-1539)在美國專利5,250,434中描述。
為實現弱化，可以降低或失活基因的表達或者酶蛋白的催化性質。如果需要，可組合這兩種措施。
基因表達可通過合適的培養控制或通過遺傳修飾(突變)基因表達的信號結構而降低。基因表達的信號結構是例如阻抑物基因、激活物基因、操縱基因、啟動子、弱化子、核糖體結合位點、起始密碼子和終止子。本領域技術人員可以在如下文獻中發現這種信息專利申請WO 96/15246，論文Boyd和Murphy(Journal ofBacteriology 1705949-5952(1988)，Vosuil和Chambliss(NucleicAcids Research 263584-3590(1998)，Patek et al(Microbiology 1421297-309(1996)和Journal of Biotechnology 104311-323(2003))及已知的遺傳學和分子生物學教科書，例如Knippers「MoleculareGenetik」(Molecular Genetics)，6thedition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)，或者Winnacker(「Gene und Klone」(Genesand Clones)，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany(1990))的教科書。
希望的基因表達調節的例子是要弱化的基因被克隆在通過加入一定劑量的IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)可誘導的誘導型啟動子例如trc啟動子或者tac啟動子的控制下。為此，載體例如大腸桿菌(Escherichia coli)表達載體pXK99E是合適的(WO0226787，根據布達佩斯條約於2001年7月31日提交，作為DH5alpha/pXK99E以保藏號DSM14440保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，或者是pVWEx2(Wendisch，theJülich Research Center的Ph.D論文，Jül-3397，ISSN 0994-2952，Jülich，Germany(1997))，其使得克隆的基因可以在穀氨酸棒桿菌中IPTG-依賴性表達。
這種方法例如包括在專利WO0226787中，通過將載體pXK99EdeaD整合進穀氨酸棒桿菌的基因組中而調節deaD基因的表達，或者如Simic等(Applied and Environmental Microbiology 683321-3327(2002))所述通過將載體pK18mobglyA整合進穀氨酸棒桿菌中調節glyA基因的表達。
特異性降低基因表達的另一種方法是反義技術，其中短的寡脫氧核苷酸或載體用於在靶細胞中合成較長的反義RNA。
所述反義RNA可以結合特異的mRNA的互補節段(segment)，並降低其穩定性或者阻斷其阻斷易位體能力的能力。本領域技術人員可以在Srivastava et al.(Applied EnvironmentalMicrobiology，Oct 2000；66(10)4366-4371)中發現關於這方面的實例。
本領域已知導致催化性質改變或降低的突變。提及的例子見Qiu和Goodman(Journal of Biological Chemistry 2728611-8617(1997))，Sugimoto et al(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 611760-1762(1997))的工作及M_ckel(Ph.D論文，Berichte desForschungszentrums Jülich(Jülich Research Center Reports)，Jül-2906，ISSN09442952，Jülich，Germany(1994)所述。概括描述可見於已知的遺傳學和分子生物學教科書，例如Hagemann(「AllgemeineGenetik」(General Genetics)，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart(1986)的教科書。
可能的突變是轉換、顛換、插入和缺失。根據胺基酸置換對酶活性的作用，稱作「錯義突變」或「無義突變」。
在基因中插入或缺失至少一個鹼基對導致移碼突變，這樣導致錯誤的胺基酸形成或者翻譯過早中斷。缺失多個密碼子典型導致酶活性的完全破壞。
關於產生這種突變的指導為本領域所已知，可見於已知的遺傳學和分子生物學教科書，例如Knippers(″Molekulare Genetik[Molecular Genetics]″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)；或Winnacker(″Gene und Klone[Genes andClones]″(Genes and Clones)，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann(″Allgemeine Genetik[General Genetics]″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
突變穀氨酸棒桿菌的基因的常用方法是Schwarzer and Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991)所述的「基因破壞」和「基因置換」方法。
在基因破壞方法中，例如將感興趣基因的編碼區的主要部分(central portion)克隆進質粒載體中，所述質粒載體在一種宿主(典型為大腸桿菌)中可以複製，但在穀氨酸棒桿菌中不能複製。值得考慮的載體是例如pSUP301(Simon et al.，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18 mob、pK19mob、pk18mobsacB或者pK19mobsacB(Sch_fer et al.，Gene 145，69-73(1994))、pGEM-T(Promega Corporation，Madison，WI，USA，pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Groningen，Netherlands)；Shuman(1994)，Journal of BiologicalChemistry 26932678-84，U.S.Patent 5,487,993，pCR_Blunt(Invitrogen，Groningen，Netherlands)；Bernard et al.，Journal of Molecular Biology，234534-541(1993)或者pEMl(Schrumpf et al.，1991，Journal ofBacteriology 173 4510-4516)。隨後，將含有基因編碼區的主要區域的質粒載體通過接合或轉化進穀氨酸棒桿菌的希望菌株中。所述接合方法例如Sch_fer等(Journal of Bacteriology 1721663-1666(1990)和Applied and Environmental Microbiology 60756-759(1994)所述。
轉化方法例如在Thierbach等(Applied Microbiology andBiotechnology 29，356-362(1988)，Duncan and Shivnan(Bio/Technology 7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMSMicrobiolgical Letters 123，343-347(1994))中描述。在通過「交換」事件同源重組後，所述被研究基因的編碼區被載體序列中斷，獲得兩個不完整的等位基因，每個等位基因缺少3』或者5』末端。Fitzpatrick等(Applied Microbiology and Biotechnology 42，575-580(1994)使用這個方法使得穀氨酸棒桿菌的recA基因失活。
本發明另外提供了含有至少yaeD、abc或者yaeE基因之一的編碼區主要部分的至少15個、優選25個連續核苷酸的載體。
在「基因置換」方法中，在體外在感興趣基因中產生了例如缺失、插入或者鹼基置換的突變。另一方面將製備的等位基因在穀氨酸棒桿菌的非複製型載體中克隆，隨後通過轉化或者接合進希望的穀氨酸棒桿菌宿主中。在靶基因或者指定序列中通過首先產生整合的「交換」事件及適當的導致切除的「交換」事件的同源重組之後，可以獲得(entrapment)突變體或者等位基因。這種方法在Scharzer and Pühler Bio/Technology 984-87(1991)中描述，並且例如由Peters-Windisch等(Microbiology 144，915-927(1998)使用，以通過缺失而使得穀氨酸棒桿菌的pyc基因失活，或者由Wehmeier等(Microbiology 1441853-1862(1998)使用，在穀氨酸棒桿菌rel基因中插入缺失。
Kirchner和Tauch(Journal of Biotechnology 104287-299(2003))提供了關於穀氨酸棒桿菌的不同遺傳方法的綜述。
在這種方式中，可以在選自yaeC、abc和yaeE組中的一或多個基因中進行缺失、插入或者鹼基置換。
另外，除了根據本發明通過弱化選自yaeC、abc和yaE組中的一或多個基因而降低從周圍介質中輸入甲硫氨酸之外，強化或弱化各自的生物合成途徑、糖酵解、添補代謝、檸檬酸循環、胺基酸輸出的戊糖磷酸循環的一或多種酶及如果需要調節蛋白、尤其是失活或者降低其表達對於生產L-胺基酸是有益的。
文中術語「強化」描述了微生物中由相應DNA編碼的一或多種酶或蛋白質的胞內活性或者濃度的增加，例如基因的拷貝數或者基因數增加，使用強啟動子或者編碼具有較高活性的相應酶或蛋白質的基因或等位基因，及如果需要則組合這些措施。
通過強化、尤其是過表達措施，相應蛋白質的活性或濃度相對於野生型蛋白質或者起始微生物中蛋白質的活性或濃度通常增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或者500％，最大增加1000％或者2000％。
通常優選使用內源基因。
「內源基因」或者「內源核苷酸序列」是指所述種群中存在的基因或者核苷酸序列的類型。
因此，例如對於L-甲硫氨酸的製備，除了根據本發明通過弱化選自yaeC、abc和yaeE組中的一或多個基因而降低從周圍介質中輸入甲硫氨酸之外，選自生產甲硫氨酸的基因或等位基因組中的一或多個基因可以被強化、尤其是過表達。「生產甲硫氨酸的基因或等位基因」應理解為其強化/過表達可以使得甲硫氨酸生產改良的、優選內源的開放讀框、基因或等位基因。
如下讀框、基因或等位基因可用於此目的accBC，accDA，aecD，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，gnd，glyA，hom，homFBR，lysC，lyscFBR，metA，metB，metE，metH，metY，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwal，zwf和zwf A213T。這些基因概括示於表1。
表1甲硫氨酸生產中的基因和等位基因
另外，除了通過弱化選自yaeC、abc和yaeE組的一或多個基因而降低從周圍介質中輸入甲硫氨酸之外，同時弱化選自對於生長或者生產甲硫氨酸非必需的基因或等位基因組的一或多個基因、尤其是使其失活或者降低其表達對於L-甲硫氨酸的生產可能是有益的。
為此可以選擇如下開放讀框brnQ，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，menE，metD，metK，pck，pgi，poxB和zwa2。這些基因概括示於表2。
表2對於甲硫氨酸生產非必需的基因和等位基因
最後，除了通過例如弱化選自yaeC、abc和yaeE組的一或多個基因而降低從周圍介質中輸入甲硫氨酸之外，消除非所需的副反應對於胺基酸、尤其是L-甲硫氨酸的生產可以是有益的(Nakayama「Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms」inOverproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)Academic Press，London，UK，1982)。
根據本發明製備的微生物是本發明的另一個目的，其可通過連續培養或者通過分批法或者補料分批法或者重複補料分批法不連續培養，以生產L-胺基酸。已知的培養方法見Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik)，(Bioprocess Technology 1.Introduction to Bioprocess Technology)(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart(1991)或者Lehrbuch von Storhas，Bioreactoren und Periphere Einrichtungen(Storhas的教科書，(Bioreactors and Ancillary Equipment)(Viewweg Publishers，Braunschweig/Wiesbaden(1994))的教科書所描述。
所用培養基必須以適當方式符合適當菌株的需求。關於不同微生物的培養基的闡述見於美國細菌學會(American Society forBacteriology)的「Manual of Methods for General Bacteriology」(Washington D.C.，USA，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，澱粉和纖維素，油和脂肪如大豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機酸如乙酸。這些物質可單獨或混合使用。
可使用的氮源包括含氮有機化合物如腖，酵母提取物，肉膏，麥芽汁，玉米漿，大豆粉和尿素，或無機化物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應鈉鹽。培養基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最後，除了上述物質之外，可加入生長必需物質如胺基酸和維生素。此外，可將適當前體加入培養基中。所述添加物質可以單批形式加入培養物或在培養期間以適當方式補料。
為了控制培養物的pH，可以適當方式應用鹼性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸。為控制泡沫產生，可以使用抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯。為維持質粒的穩定性，可以向培養基中加入選擇性作用物質例如抗生素。為維持有氧條件，可以向培養物中充入氧氣或含氧混合氣，例如空氣。培養溫度通常在20℃～45℃，優選25℃-40℃。持續培養直至希望的產物形成最大量。此目的通常在10～160小時範圍內達到。
使用本發明的方法，細菌或者發酵方法中關於產物濃度(每單位體積的產物)、產物產量(每一利用的碳源形成的產物)、產物形成(每單位體積時間形成的產物)或者其它方法參數及其組合的發酵方法的結果可以改良至少0.5％、至少1％或者至少2％。
本領域已知確定L-胺基酸的方法。可通過如Spackmann等(Analytical Chemistry，30，(1958)，1185-1190)所述的陰離子交換層析及隨後的茚三酮衍生化，或者可以進行Lindroth等(AnalyticalChemistry(1979)511167-1174)所述的反相HPLC來進行分析。本領域技術人員在Ashman等(in Tschesche(Hrsg)，Modern Methods inProtein Chemistry，155-172，de Gruyter，Berlin 1985)中也可發現關於這方面的信息。
本發明的方法是通過發酵生產L-甲硫氨酸。
如果需要，終產物中L-甲硫氨酸的濃度可以通過加入L-甲硫氨酸至希望的水平。
權利要求
1.一種通過發酵重組微生物、優選棒狀細菌製備L-胺基酸的方法，其特徵在於所應用的細菌與初始微生物相比從周圍介質中較少或者不攝取甲硫氨酸，所述微生物中編碼MetD2甲硫氨酸吸收系統的yaeC、abc和yaeE基因中的一或多個被弱化、失活或者以較低水平表達。
2.權利要求書1的方法，特徵在於製備的是L-甲硫氨酸。
3.權利要求書1的發酵製備L-胺基酸、特別是L-甲硫氨酸的方法，其中進行如下步驟(a)發酵產生希望的L-胺基酸的微生物、優選棒狀細菌，所述微生物與初始微生物相比從周圍介質中較少或不吸收甲硫氨酸，其中使得編碼MetD2甲硫氨酸吸收系統的yaeC、abc和yaeE組中的一或多個基因被弱化、特別是被失活或者以較低水平表達；(b)富集培養基或者細菌細胞中希望的產物；及(c)分離希望的L-胺基酸，其中任選地發酵肉湯的成分和/或生物量的全部或者部分(＞0至100)保留在終產物中。
4.權利要求1或3的方法，其特徵在於應用其中L-甲硫氨酸生物合成途徑的其它基因被額外強化的細菌。
5.權利要求1或3的方法，其特徵在於應用其中降低L-甲硫氨酸形成的代謝途徑至少被部分失活的細菌。
6.權利要求1或3的方法，其特徵在於降低編碼從周圍介質中攝取甲硫氨酸的成分的多核苷酸的表達，所述多核苷酸例如選自編碼甲硫氨酸攝取系統的yaeC、abc和yaeE組中的一或多個基因。
7.權利要求1或3的方法，其特徵在於降低yaeC、abc和yaeE多核苷酸編碼的多肽(酶蛋白)的調節和/或催化性質。
8.權利要求1或3的方法，其特徵在於為了製備L-胺基酸、尤其是L-甲硫氨酸，微生物、優選發酵的棒狀細菌中選自如下表1所示組的一或多個基因同時被強化、尤其是過表達
9.權利要求1或3的方法，其特徵在於為了製備L-胺基酸、特別是L-甲硫氨酸，發酵微生物、優選棒狀微生物，其中選自下表2中所示組的一或多個基因的表達被弱化、尤其被失活或降低
10.權利要求1-9任一項的方法，其特徵在於應用穀氨酸棒桿菌類型的微生物。
11.重組的微生物、優選棒狀細菌，其中選自編碼從周圍介質中攝取甲硫氨酸的、編碼MetD2甲硫氨酸攝取系統的yaeC、abc和yaeE組中的一或多個基因被弱化、尤其被失活或者以比MetD2甲硫氨酸攝取系統未被弱化或失活的起始微生物低的水平表達。
12.載體，其含有具有至少15個確定序列的核苷酸的片段，所述片段含有yaeC、abc和yaeE基因中至少一個的一或多個序列，且所述載體不能複製進穀氨酸棒桿菌中。
全文摘要
本發明涉及一種發酵製備L－胺基酸、特別是L－甲硫氨酸的方法，其中發酵產生希望的L－胺基酸的重組微生物，優選地發酵棒狀細菌，所述微生物從周圍介質中很少或者不吸收甲硫氨酸，其中選自metD2甲硫氨酸攝取系統的yaeC、abc和yaeE基因中的一或多個基因被弱化、特別是被失活或在較低水平表達，本發明還涉及這些重組微生物。
文檔編號C12R1/13GK1922329SQ200580005792
公開日2007年2月28日 申請日期2005年1月13日 優先權日2004年2月27日
發明者克裡斯蒂安·特洛特舍爾, 賴因哈德·克雷默, 安德烈亞斯·布爾科夫斯基, 布麗吉特·巴瑟 申請人:德古薩股份公司