用於防治旋毛蟲病的抗原表位、其組合物及用途的製作方法

2023-05-03 20:36:31 1

專利名稱：用於防治旋毛蟲病的抗原表位、其組合物及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫生物學領域，涉及用於防治旋毛蟲病的抗原表位、其組合物及用途。
背景技術：
旋毛蟲病是一種呈全球性分布的人獸共患寄生蟲病。人的感染主要來源於高致病性的旋毛形線蟲(Pozio E. World distribution of Trichinella spp. infectionsin animals and humans. [J]. Vet Parasitol，2007，149 (1—2))。由；) 臨床症狀複雜，包括腹瀉，發熱，肌痛，水腫等，令其難以正確診斷，給及時的藥物治療造成了一定困難且藥物治療不能解決該蟲的反覆感染問題(Gottstein B, Pozio E，NocklerK. Epidemiology, diagnosis, treatment, and control of trichinellosis. [J]. ClinMicrobiol Rev, 2009, 22(1) :127-145.)。旋毛蟲病的流行，不僅直接威脅著人類的身體健康，而且對畜牧業、肉食品業以及外貿出口等造成重大經濟損失，是我國「十一五」期間重點攻克的食源性寄生蟲病之一。副肌球蛋白(paramyosin，Pmy)是多種無脊椎動物主要的結構蛋白，在寄生性蠕蟲的不同發育階段呈持續性表達，是參與肌肉收縮的粗肌絲的主要成分(Epstein HF,Miller DR, Ortiz I，et al. Myosin and paramyosin are organized about a newlyidentified core structure [J]. J Cell Biol，1985，100 (3) :904-915.)。在某些寄生蠕蟲的非肌肉部位，如體表、消化道和生殖道也有副肌球蛋白的分布(Zhao Q P,Moon S U,Na BK，et al. Paragonimus westermani :biochemical and immunological characterizationsof paramyosin. [J] .Exp Parasitol，2007，115 (1) :9-18. Matsumoto Y，Perry G，LevineR J，et al. Paramyosin and actin in schistosomal teguments[J] · Nature，1988，333(6168) :76-78.)。副肌球蛋白同時也是免疫調節分子，在寄生性蠕蟲與宿主的相互作用中發揮重要功能(Loukas A, Jones M K, King L Τ, et al. Receptor for Fc on thesurfaces of schistosomes. [J]. Infect Immun,2001,69(6) :3646-3651. Deng J, GoldD, Loverde P T, et al. Inhibition of the complement membrane attack complex bySchistosoma mansoni paramyosin. [J]. Infect Immun, 2003, 71 (11) :6402-6410.)。方寵毛蟲的副肌球蛋白基因(Ts-Pmy GenBank accession No. :EF429310)全長為^96bp，其開放讀碼框架(ORF) 265^ρ，編碼885個胺基酸，理論分子量為102kDa。但是目前對旋毛蟲副肌球蛋白的抗原表位的研究尚不深入。使用旋盤尾絲蟲感染病人的血清對犬惡絲蟲副肌球蛋白的表位作圖研究顯示，感染血清主要識別副肌球蛋白分子的氨基端(Steel C，Limberger R J，Mcreynolds L A，et al. B cell responsesto paramyosin. Isotypic analysis and epitope mapping of filarial paramyosin inpatients with onchocerciasis. [J]· J Immunol，1990，145 (11) :3917-3923)，而在日本血吸蟲和豬帶絛蟲的相關研究顯示，感染血清主要識別蛋白的羧基端(Vazquez-Talavera J，Solis C F，Medina-Escutia E，et al. Human T and B cell epitopemapping of Taeniasolium paramyοs in. [J]. Parasite Immunol，2001，23(11) :575-579. Nara T，Tanabe K，Mahakunkijcharoen Y，et al· The B cell epitope of paramyosin recognized by aprotective monoclonal IgE antibody to Schistosoma japonicum[J]. Vaccine, 1997，15(1) :79-84.)。之所以識別不同的部位，可能是由於線蟲綱與吸蟲和絛蟲綱的副肌球蛋白優勢表位的分布有所不同。 故此，尚需要開發新的抗體和抗原表位，以期對旋毛蟲感染及其所致疾病進行有效地防治。

發明內容
本發明人經過深入的研究和創造性的勞動，發現將Ts-Pmy分三段表達部分重疊的蛋白片段(rTs-Pmy-Nl-322aa、rTs-Pmy-M 286_600aa、和 rTs-Pmy-C 571_885aa)，與感染後27-45天的小鼠混合血清進行識別，發現其中主要識別副肌球蛋白的是N端片段(rTs-Pmy-Nl-322aa)。本發明人基於該N端片段進行副肌球蛋白抗原分子表位的研究，得到了抗原表位。本發明人驚奇地發現，得到的抗原表位具有有效的旋毛蟲減蟲率，從而具有作為防治旋毛蟲感染或其所致疾病的藥物(例如疫苗)的潛力。由此提供了下述發明本發明的一個方面涉及一種抗原表位，其具有SEQ ID NO :1_4中任一項所述的胺基酸序列ALSTPTFSTLPA (SEQ ID NO 1)LPffHFKSRHRYQ (SEQ ID NO 2)SHWNSHSTPARA (SEQ ID NO 3)LSTPYSKSQAST (SEQ ID NO 4) 在本發明的一個實施方案中，所述抗原表位的胺基酸序列如SEQ ID NO :1-4中任
一項所示。所述抗原表位可以通過人工化學合成的方式得到，也可以本領域技術人員知曉的其它生物化學或者分子生物學的方法得到。本發明的還涉及一種多肽，其具有SEQ ID NO :1_4中任一項所述的胺基酸序列。本發明的再一方面涉及一種核苷酸序列，其編碼本發明任一項所述的抗原表位；具體地，所述核苷酸序列分別如SEQ ID NO 8-11中任一項所示GCGCTGAGTACTCCGACTTTTTCGACTCTGCCTGCG (SEQ ID NO 8)CTTCCGTGGCATTTTAAGTCGCGTCATACGTATCAG (SEQ ID NO 9)TCTCATTGGAATAGTCATTCGACTCCTGCGCGTGCG (SEQ ID NO 10)CTGTCGACGCCTTATTCGAAGTCTCAGGCGTCGACT (SEQ ID NO 11)。本發明的另一方面涉及一種抗原，其具有本發明任一項所述的抗原表位；具體地，所述抗原的胺基酸序列如SEQ ID N0:16所示。MSLYRSPSASVMRSASMLSRSGGFDAYGFGGYGAPSLNVADLGSLTRLEDKIRLLQDDLETERELRNRIERERADLSCQLISLTDRLEEAEGTTDAQIDANRKRESELQKLRKILEDSQLESEDSLNQLRKKHQESLLDYQQQIEQLQKKNSKIDRERQRLQHEVIELTAGIDQMQKDKHAAEKAAEKHEAHARELQNRVDDLAKNLNDLASQRQRLQQENNDLMKELHDVKVQMENIQHVKTQLAQQLEEARRRLEDAERERSQMQTQLHQMQLELDSIQGALEEESSARAEAEHKLSLANTEISQffKSKFDAEVSLHQEE (SEQ ID N0:16)
本發明的還一方面涉及編碼本發明的抗原的核苷酸序列；具體地，所述抗原的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示。ATGTCTCTGTATCGCAGTCCCAGTGCGTCAGTGATGAGATCAGCAAGCATGCTCAGCCGAAGTGGCGGATTCGATGCTTACGGATTTGGAGGTTACGGTGCGCCAAGCCTCAACGTTGCCGACTTGGGTTCTTTGACCAGACTCGAGGATAAAATTCGCCTGCTTCAAGATGATTTGGAAACGGAAAGAGAATTGCGAAACCGAATTGAACGCGAACGTGCCGATTTGTCCTGCCAACTGATCAGCTTAACCGATCGATTGGAAGAGGCTGAAGGAACCACCGATGCCCAGATCGACGCCAATCGAAAGCGTGAATCCGAATTGCAAAAGTTGAGAAAAATATTGGAAGATTCGCAATTGGAAAGCGAAGATTCGCTGAACCAGCTGCGCAAGAAGCACCAAGAATCCCTTTTAGATTATCAGCAGCAAATTGAACAACTTCAAAAGAAAAATAGCAAAATCGACAGAGAACGACAACGTTTGCAGCATGAAGTCATTGAACTTACTGCCGGAATTGATCAGATGCAAAAAGACAAGCATGCCGCGGAAAAAGCTGCCGAAAAGCACGAAGCGCATGCCAGAGAGCTTCAGAACAGAGTTGACGATCTGGCAAAAAATTTGAACGACCTGGCCTCGCAGCGTCAACGTCTGCAACAGGAAAACAACGATTTGATGAAAGAGTTGCACGATGTCAAAGTGCAAATGGAAAATATTCAACACGTCAAGACTCAACTTGCTCAACAGCTCGAAGAAGCACGTCGTCGACTCGAAGATGCGGAACGTGAACGTTCGCAAATGCAAACCCAGTTGCATCAGATGCAGCTGGAATTGGATTCAATTCAAGGTGCGTTGGAAGAGGAATCGTCCGCACGTGCCGAAGCAGAGCACAAATTGTCGTTGGCAAATACGGAAATTTCCCAGTGGAAGAGCAAATTCGACGCCGAAGTTTCACTCCACCAAGAAGAA (SEQ ID NO: 15)本發明的再一方面涉及一種重組載體，其含有本發明任一項所述的核苷酸序列。在本發明的一個實施方案中，所述重組載體為重組表達載體。可以將本發明的任一項的核苷酸和調控序列連接在一起來製備重組表達載體，該載體可以包括1或多個方便的限制位點，以便在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸序列。或者，可以通過將核酸序列或包含該序列的核酸構建體插入適當表達載體而表達本發明所述核酸序列。製備表達載體時，可使編碼序列位於載體中以便與適當的表達調控序列可操作連接。其中，術語「調控序列」定義為包括表達本發明的抗原表位所必需或有利的所有組分。每個調控序列對於編碼多肽(抗原表位)的核酸序列可以是天然含有的或外來的。這些調控序列包括，但不限於，前導序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號序列和轉錄終止子。最低限度，調控序列要包括啟動子以及轉錄和翻譯的終止信號。為了導入特定的限制位點以便將調控序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區進行連接，可以提供帶接頭的調控序列。術語「可操作連接」在文中定義為這樣一種構象，其中調控序列位於相對DNA序列之編碼序列的適當位置，以使調控序列指導多肽的表達。重組表達載體可以是任何便於進行重組DNA操作並表達核酸序列的載體(例如質粒或病毒)。載體的選擇通常取決於載體與它將要導入的宿主細胞的相容性。載體可以是線性或閉環質粒。本發明的再一方面涉及一種重組宿主細胞，其含有本發明任一項所述的重組載體。可將包含本發明之核酸序列的重組載體導入宿主細胞，從而使該載體以上述染色體整合體或自我複製的染色體外載體形式得以維持。術語「宿主細胞」涵蓋任何由於複製期間發生的突變而與親本細胞不同的後代。宿主細胞的選擇很大程度上取決於多肽編碼基因及其來源。宿主細胞可以是原核細胞或者真核細胞，例如細菌或酵母細胞。可以通過本領域技術人員熟知的技術將載體導入宿主細胞。本發明的再一方面涉及一種抗原表位偶聯物，包括抗原表位和偶聯部分，其中，所述抗原表位為本發明任一項所述的抗原表位，所述偶聯部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細胞因子、酶、螢光素、載體蛋白、和生物素中的一種或多種；具體地，所述偶聯部分為載體蛋白BSA或KLH。本發明的再一方面涉及一種組合物，其包含一種或多種本發明的抗原表位，和/或一種或多種本發明的抗原，和/或一種或多種本發明的抗原表位偶聯物；具體地，所述組合物為疫苗組合物。本發明的再一方面涉及本發明任一項所述的抗原表位或者本發明任一項所述的抗原或者本發明任一項所述的抗原表位偶聯物在製備治療和/或預防旋毛蟲感染的藥物中的用途。實施例6的數據顯示，本發明的抗原表位具有有效的旋毛蟲減蟲率，能夠有效地防治旋毛蟲感染或旋毛蟲感染所致疾病，具有作為防治旋毛蟲感染或其所致疾病的藥物(例如疫苗)的潛力。本發明的再一方面涉及一種抗體，其能夠特異性地結合本發明任一項所述的抗原表位或者本發明任一項所述的抗原或者本發明任一項所述的抗原表位偶聯物。在本發明中，術語「特異性結合」具有免疫學的一般含義，例如抗原抗體間的結合。本發明的再一方面涉及一種抗體偶聯物，包括抗體部分和偶聯部分，其中，所述抗體部分為本發明任一項所述的抗體，所述偶聯部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細胞因子、酶、螢光素、載體蛋白、和生物素中的一種或多種。本發明的再一方面涉及一種藥物組合物，其包含本發明任一項所述的抗體或者本發明任一項所述的抗體偶聯物；可選地，所述藥物組合物還包含藥學上可接受的載體或輔料。本發明的再一方面涉及一種試劑盒，其包含本發明任一項所述的抗體或者本發明任一項所述的抗體偶聯物。在本發明的一個實施方案中，所述試劑盒為旋毛蟲感染或旋毛蟲感染所致疾病的檢測或診斷試劑盒。本發明的再一方面涉及本發明任一項所述的抗體或者本發明任一項所述的抗體偶聯物在製備治療和/或預防旋毛蟲感染的藥物中的用途。發明的有益效果本發明的抗原表位具有效的旋毛蟲減蟲率，從而具有作為防治旋毛蟲感染或其所致疾病的藥物(例如疫苗)的潛力。


圖1 :SDS-PAGE鑑定純化的腹水8F12mAb。1，低分子量蛋白marker ；2，8F12株未純化腹水；3，8F12株柱純化後抗體。注65kDa處的雜帶應該是血清中白蛋白的位置，含量很大，所以純化中很難完全去除。圖2 :8F12抗體親和力常數測定。注C。為抗體初始濃度，C為抗體稀釋後濃度。圖3:mAb 8F12及自然感染血清抗旋毛蟲感染的被動免疫保護性。肌幼蟲蟲荷(LPG)為每克肌肉的肌幼蟲數。以均數士標準差(n = 6)表示。注廣是與PBS對照組比較，ρ < 0. 01。圖4 :mAb 8F12與陽性噬菌體克隆的特異性識別(ELISA法鑑定)。以野生噬菌體M13作為陰性對照，BSA包被孔用以排除交叉反應。圖5 :mAb 8F12與陽性噬菌體克隆的特異性識別(Western blot)泳道1 噬菌體克隆8JJ ；泳道2 噬菌體克隆8A1 ；泳道3 噬菌體克隆8A9 ；泳道4 噬菌體克隆8F1 ；泳道5 噬菌體克隆8F6 ；泳道6 噬菌體克隆8F7 ；泳道7 噬菌體克隆8F10 ；泳道8 :M13野生噬菌體克隆。圖6 合成多肽與mAb 8F12特異性結合的ELISA檢測(多肽偶聯載體BSA包被)。注mAb 5A3作為無關腹水對照。圖7 各組免疫小鼠的肌幼蟲數。注與KLH對照組比較，< 0. 01，*p < 0. 05。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例1 :rI~s-Pmy-Nl-322aa 蛋白的製備如下面的步驟1-6順序所示。1. Ts-Pmy-Nl-322aa 基因片段的擴增根據副肌球蛋白基因(Ts-PmyGenBank accession No. :EF429310)讀碼框序列，可得到Ts-Pmy-Nl-32ha的核苷酸序列，如下ATGTCTCTGTATCGCAGTCCCAGTGCGTCAGTGATGAGATCAGCAAGCATGCTCAGCCGAAGTGGCGGATTCGATGCTTACGGATTTGGAGGTTACGGTGCGCCAAGCCTCAACGTTGCCGACTTGGGTTCTTTGACCAGACTCGAGGATAAAATTCGCCTGCTTCAAGATGATTTGGAAACGGAAAGAGAATTGCGAAACCGAATTGAACGCGAACGTGCCGATTTGTCCTGCCAACTGATCAGCTTAACCGATCGATTGGAAGAGGCTGAAGGAACCACCGATGCCCAGATCGACGCCAATCGAAAGCGTGAATCCGAATTGCAAAAGTTGAGAAAAATATTGGAAGATTCGCAATTGGAAAGCGAAGATTCGCTGAACCAGCTGCGCAAGAAGCACCAAGAATCCCTTTTAGATTATCAGCAGCAAATTGAACAACTTCAAAAGAAAAATAGCAAAATCGACAGAGAACGACAACGTTTGCAGCATGAAGTCATTGAACTTACTGCCGGAATTGATCAGATGCAAAAAGACAAGCATGCCGCGGAAAAAGCTGCCGAAAAGCACGAAGCGCATGCCAGAGAGCTTCAGAACAGAGTTGACGATCTGGCAAAAAATTTGAACGACCTGGCCTCGCAGCGTCAACGTCTGCAACAGGAAAACAACGATTTGATGAAAGAGTTGCACGATGTCAAAGTGCAAATGGAAAATATTCAACACGTCAAGACTCAACTTGCTCAACAGCTCGAAGAAGCACGTCGTCGACTCGAAGATGCGGAACGTGAACGTTCGCAAATGCAAACCCAGTTGCATCAGATGCAGCTGGAATTGGATTCAATTCAAGGTGCGTTGGAAGAGGAATCGTCCGCACGTGCCGAAGCAGAGCACAAATTGTCGTTGGCAAATACGGAAATTTCCCAGTGGAAGAGCAAATTCGACGCCGAAGTTTCACTCCACCAAGAAGAA (SEQ ID NO: 15)其編碼的胺基酸序列如下MSLYRSPSASVMRSASMLSRSGGFDAYGFGGYGAPSLNVADLGSLTRLEDKIRLLQDDLETERELRNRIERERADLSCQLISLTDRLEEAEGTTDAQIDANRKRESELQKLRKILEDSQLESEDSLNQLRKKHQESLLDYQQQIEQLQKKNSKIDRERQRLQHEVIELTAGIDQMQKDKHAAEKAAEKHEAHARELQNRVDDLAKNLNDLASQRQRLQQENNDLMKELHDVKVQMENIQHVKTQLAQQLEEARRRLEDAERERSQMQTQLHQMQLELDSIQGALEEESSARAEAEHKLSLANTEISQffKSKFDAEVSLHQEE (SEQ ID NO: 16)I~S-Pmy-Nl-322aa基因片段可以根據SEQ ID NO :15通過人工合成得到，也可以採用下面的PCR擴增的方法得到。引物設計如下面的表1所示。引物合成與序列測定均由上海英駿公司完成。表1:引物數據
權利要求
1.一種抗原表位，其胺基酸序列如SEQ ID NO :1-4中任一項所示。
2.編碼權利要求1所述抗原表位的核苷酸序列；具體地，所述核苷酸序列分別如SEQID NO 8-11中任一項所示。
3.—種抗原，其具有權利要求1所述的抗原表位；具體地，所述抗原的胺基酸序列如SEQ ID NO 16 所示。
4.編碼權利要求3所述抗原的核苷酸序列；具體地，所述核苷酸序列如SEQID NO 15所示。
5.一種重組載體，其含有權利要求2或4所述的核苷酸序列。
6.一種重組宿主細胞，其含有權利要求5所述的重組載體。
7.—種抗原表位偶聯物，包括抗原表位和偶聯部分，其中，所述抗原表位為權利要求1所述的抗原表位，所述偶聯部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細胞因子、酶、螢光素、載體蛋白、和生物素中的一種或多種；具體地，所述偶聯部分為載體蛋白BSA或KLH。
8.一種組合物，其包含一種或多種權利要求1所述的抗原表位，和/或一種或多種權利要求3所述的抗原，和/或一種或多種權利要求7所述的抗原表位偶聯物；具體地，所述組合物為疫苗組合物。
9.權利要求1所述的抗原表位或者權利要求3所述的抗原或者權利要求7所述的抗原表位偶聯物在製備治療和/或預防旋毛蟲感染的藥物中的用途。
10.一種抗體，其能夠特異性地結合權利要求1所述的抗原表位或者權利要求3所述的抗原或者權利要求7所述的抗原表位偶聯物。
11.一種抗體偶聯物，包括抗體部分和偶聯部分，其中，所述抗體部分為權利要求10所述的抗體，所述偶聯部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細胞因子、酶、螢光素、載體蛋白、和生物素中的一種或多種。
12.—種藥物組合物，其包含權利要求10所述的抗體或者權利要求11所述的抗體偶聯物；可選地，所述藥物組合物還包含藥學上可接受的載體或輔料。
13.—種試劑盒，其包含權利要求10所述的抗體或者權利要求11所述的抗體偶聯物。
14.權利要求10所述的抗體或者權利要求11所述的抗體偶聯物在製備治療和/或預防旋毛蟲感染的藥物中的用途。
全文摘要
本發明屬於免疫生物學領域，涉及用於防治旋毛蟲病的抗原表位、其組合物及用途。具體地，本發明涉及一種抗原表位，其胺基酸序列如SEQ ID NO1-4中任一項所示。本發明的抗原表位具有效的旋毛蟲減蟲率，從而具有作為防治旋毛蟲感染或其所致疾病的藥物(例如疫苗)的潛力。
文檔編號C07K14/435GK102558306SQ201110448420
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者李強, 楊靜, 諸欣平, 顧園, 魏駿飛 申請人:首都醫科大學