一類布魯頓酪氨酸激酶抑制劑的製作方法

2023-05-03 22:38:31

本發明屬於藥物化學領域，具體涉及一類作為布魯頓酪氨酸激酶抑制劑的化合物、其製備方法、含有這些化合物的藥物組合物、以及使用這些化合物和藥物組合物在製備預防、改善或治療與布魯頓酪氨酸激酶有關的疾病中的用途。

背景技術：

酪氨酸激酶是信號轉導通路中的重要分子，它的激活與腫瘤的發生發展密切相關，是理想的治療腫瘤的藥物靶標。酪氨酸激酶抑制劑以其高效低度超越了傳統化療藥物，成為了抗腫瘤藥物研究的熱點。

布魯頓酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase，BTK)作為一種非受體型酪氨酸激酶，是B細胞發育、激活、信號傳導和存活的關鍵調節物，此外，它在眾多其他造血細胞信號傳導途徑中也起作用。目前，BTK抑制劑單獨使用或者與其它治療藥聯合使用可用以治療自身免疫性疾病或病症、異種免疫性疾病或病症、癌症包括淋巴瘤以及炎性疾病或病症等。

現有技術中報導了一些布魯頓酪氨酸激酶抑制劑，例如，伊布替尼是一種布魯頓酪氨酸激酶抑制劑的首創新藥，它能夠與BTK形成強有力的共價鍵，從而抑制惡性B細胞中過度活躍的細胞生存信號的傳輸，從而達到抑制腫瘤生長和轉移的效果。目前已被開發用於治療套細胞淋巴瘤。伊布替尼的化學名為1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧苯基)-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮，結構式如下：

技術實現要素：

本發明提供一種式I化合物或其藥學上可接受的鹽，

其中：

R1選自氫、烷氧基羰基、烷基羰基；R2選自烷基、環烷基、烷氧基、環烷基氧基、芳基氧基。

在一些實施方案中，R1選自氫、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基羰基。在一些實施方案中，R1選自氫、C1-6烷氧基羰基。在一些實施方案中，R1為氫。

在一些實施方案中，R2選自C1-6烷基、C3-8環烷基、C1-6烷氧基、C3-8環烷基氧基、芳基氧基。在一些實施方案中，R2選自C1-6烷基、C3-6環烷基、C1-6烷氧基、C3-6環烷基氧基。在一些實施方案中，R2選自C1-6烷基、C1-6烷氧基。

在一些實施方案中，R1選自氫、正丁氧基羰基；R2選自甲基、乙基、異丙基、正丁基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁基氧基、正戊基氧基、1-甲基丁基氧基。

在一些實施方案中，式I化合物選自如下化合物：

本發明另一方面提供一種藥物組合物，其含有治療有效量的式Ⅰ化合物或其藥學上可接受的鹽，以及一種或多種藥學上可接受的載體。

本發明的藥物組合物可配製成固態、半固態、液態或氣態製劑，如片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、膏劑、乳劑、懸浮劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠劑、微球及氣溶膠等等。

給予本發明化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物組合物的典型途徑包括但不限於口服、直腸、透黏膜、經腸給藥，或者局部、經皮、吸入、腸胃外、舌下、陰道內、鼻內、眼內、腹膜內、肌內、皮下、靜脈內給藥。優選的給藥途徑是口服給藥。

本發明的藥物組合物可以採用本領域周知的方法製造，如常規的混合法、溶解法、制粒法、製糖衣藥丸法、磨細法、乳化法、冷凍乾燥法等。

本發明提供的化合物(優選實施例化合物)具有布魯頓酪氨酸激酶抑制活性。

本發明同時提供上述化合物或其藥學上可接受的鹽在製備用於治療與布魯頓酪氨酸激酶相關疾病的藥物中的用途。

在一些實施方式中，所述與布魯頓酪氨酸激酶相關疾病為自身免疫性疾病，例如炎性腸病、關節炎、狼瘡、類風溼性關節炎、銀屑病性關節炎、骨關節炎、斯蒂爾病(Still’s disease)、青少年關節炎、糖尿病、重症肌無力症、橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、奧德甲狀腺炎(Ord’s thyroiditis)、格雷夫斯病(Graves disease)、類風溼性關節炎症候群(syndrome)、多發性硬化症、傳染性神經元炎(Guillain-Barrésyndrome)、急性播散性腦脊髓炎、阿狄森病(Addison’sdisease)、視性眼陣攣-肌陣攣症候群、強直性脊椎炎、抗磷脂抗體症候群、再生障礙性貧血、自身免疫性肝炎、乳糜瀉(coeliac disease)、古德帕斯徹症候群(Goodpasture’s syndrome)、特發性血小板減少性紫癜、視神經炎、硬皮病、原發性膽汁性肝硬化、萊特爾症候群(Reiter’s syndrome)、高安動脈炎(Takayasu’s arteritis)、顳動脈炎、溫型自身免疫性溶血性貧血、韋格納肉芽腫病(Wegener’s granulomatosis)、銀屑病、全身脫毛、貝赫切特病(disease)、慢性疲勞、家族性自主神經功能異常、子宮內膜異位、間質性膀胱炎、神經肌強直、硬皮病或外陰痛。

在一些實施方式中，所述與布魯頓酪氨酸激酶相關疾病為異種免疫性疾病，例如移植物抗宿主病、移植、輸血、過敏反應、變態反應、I型超敏反應、過敏性結膜炎、過敏性鼻炎或特應性皮炎(atopicdermatitis)。

在一些實施方式中，所述與布魯頓酪氨酸激酶相關疾病為炎性疾病，例如哮喘、闌尾炎、瞼炎、細支氣管炎、支氣管炎、粘液囊炎、宮頸炎、膽管炎、膽囊炎、結腸炎、結膜炎、膀胱炎、淚腺炎、皮炎、皮肌炎、腦炎、心內膜炎、子宮內膜炎、腸炎、小腸結腸炎、上髁炎、附睪炎、筋膜炎、纖維織炎、胃炎、胃腸炎、肝炎、化膿性汗腺炎、喉炎、乳腺炎、腦膜炎、脊髓炎心肌炎、肌炎、腎炎、卵巢炎、睪丸炎、骨炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽炎、胸膜炎、靜脈炎、局限性肺炎(pneumonitis)、肺炎(pneumonia)、直腸炎、前列腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、輸卵管炎、鼻竇炎、口腔炎、滑膜炎、腱炎、扁桃腺炎、葡萄膜炎、陰道炎、血管炎或外陰炎。

在一些實施方式中，所述與布魯頓酪氨酸激酶相關疾病為癌症。所述癌症是B細胞增生性疾病，例如瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、慢性淋巴細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、B細胞前淋巴細胞性白血病、淋巴漿細胞淋巴瘤/瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症 (macroglobulinemia)、脾邊緣區淋巴瘤、漿細胞性骨髓瘤、漿細胞瘤、結外邊緣區B細胞淋巴瘤、淋巴結邊緣區B細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma)或淋巴瘤樣肉芽腫病。

在進一步的實施方式中，所述與布魯頓酪氨酸激酶相關疾病為血栓栓塞性疾病，例如心肌梗塞、心絞痛、血管成形術後再閉塞、血管成形術後再狹窄、主動脈冠狀動脈分流術後再閉塞、主動脈冠狀動脈分流術後再狹窄、中風、一過性局部缺血、周圍動脈閉塞性疾病、肺栓塞或深部靜脈血栓形成。

在具體的實施方式中，所述的與布魯頓酪氨酸激酶相關疾病為慢性淋巴細胞白血病、巨球蛋白血症、套細胞淋巴瘤、B-細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡中心淋巴瘤、邊緣B細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、毛細胞白血病、乳腺癌、轉移性非小細胞肺癌、胰腺癌、實體癌、全身性肥大細胞增多症、移植物抗宿主病、過敏性鼻炎。

在具體的實施方式中，所述的與布魯頓酪氨酸激酶相關疾病為肺癌、胃癌和膠質瘤。

本發明再一方面提供式I化合物的製備方法：

其中，R1和R2如上定義。

當R1選自氫時，在鹼的存在下，伊布替尼與R2-C(＝O)Cl於有機溶劑中反應生成式I化合物。

當R1選自烷氧基羰基或烷基羰基時，在鹼的存在下，伊布替尼於有機溶劑中可依次與R2-(C＝O)Cl和R1-Cl反應生成式I化合物。

上述反應還可以加入催化劑例如4-二甲氨基吡啶(DMAP)以加速反應進行。

其中，所述鹼選自吡啶、三乙胺、二異丙基乙胺、碳酸鉀、碳酸鈉，乙醇鈉、甲醇鈉。

其中，反應溶劑選自苯、甲苯、二氯甲烷、醋酸乙酯、三氯甲烷。

其中，反應在室溫下進行。

本發明的化合物或其鹽可以作為活性物質單獨給藥，優選以其藥物組合物的形式給藥。

除非另有說明，本發明所使用的術語具有下述含義。

「烷基」是指由碳原子和氫原子組成的直鏈或支鏈的飽和脂肪烴基團，其通過單鍵與分子的其餘部分連接。烷基優選為具有1-6個碳原子的烷基(也可表示為C1-6烷基)，包括但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、1,1-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基。

「烷氧基」是指烷基-O-基團。

「環烷基」是指由碳原子和氫原子組成的飽和的或不飽和的非芳香性的環狀烴基，可以是單環或稠合多環結構。環烷基的非限制性實例包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基等。

「環烷基氧基」是指環烷基-O-基團。

「烷氧基羰基」是指具有烷氧基取代的羰基，即烷基-O-C(＝O)-基團。

「烷基羰基」是指具有烷基取代的羰基，即烷基-C(＝O)-基團。

「藥學上可接受的鹽」是指本發明化合物與藥學上可接受的無機或有機酸形成的鹽，這些鹽包括但不限於：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、乙磺酸鹽、甲苯磺酸鹽和苯磺酸鹽、乙酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽和水楊酸鹽、丙二酸鹽、己二酸鹽、己酸鹽、精氨酸鹽、富馬酸鹽、煙酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、草酸鹽等。

「藥物組合物」是指一種或多種本發明的化合物或其鹽與在本領域中通常接受的用於將生物活性化合物輸送至有機體(例如人)的載體的製劑。藥物組合物的目的是有利於對有機體給予本發明的化合物。

「藥學上可接受的載體」是指對有機體無明顯刺激作用，而且不會損害該活性化合物的生物活性及性能的那些載體。「藥學上可接受的載體」是指與活性成份一同給藥的、有利於活性成份給藥的惰性物質，包括但不限於國家食品藥品監督管理局許可的可接受的用於人或動物(例如家畜)的任何助流劑、增甜劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、矯味增強劑、表面活性劑、潤溼劑、分散劑、崩解劑、助懸劑、穩定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑。所述載體 的非限制性實例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各類澱粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。

具體實施方式

本發明提供的化合物可以通過多種製備方法來合成，實施例中僅提供了合成這些化合物的代表性方法。具體實施例的目的是進一步說明本發明內容但不意味著對本發明進行限制。

本發明具體實施例中使用的初始原料、反應試劑等均為市售產品。

伊布替尼可參考已經公開的文獻例如CN101610676製備得到。

實施例1化合物1的合成

伊布替尼(2.2g，4.994mmol)和DMAP(0.61g，4.993mmol)於二氯甲烷中，加入吡啶(10ml)的二氯甲烷溶液(30ml)，攪拌溶清，得黃色透明溶液，15℃下，滴加氯甲酸甲酯(4ml)的二氯甲烷溶液。反應2h後，加20ml水終止反應，水相再用等量二氯甲烷萃取一次，合併有機相，有機相用20ml水洗滌3次，分出有機相，無水硫酸鎂乾燥。抽濾，濾液30℃以下旋蒸乾，層析柱分離，用乙酸乙酯：石油醚＝8:1到5:1洗脫，得化合物1。

MS m/z:499.37[M+H]

1H-NMR(400MHz,CDCl3)：8.801(s,1H)，7.906(s,1H)，7.662(s,2H)，7.430～7.391(m,3H)，7.285～9.193(m,3H)，7.121(d,j＝7.6Hz,2H)，6.613(s,1H)，6.356～6.284(m,1H)，5.754～5.696(m,1H)，4.967～4.903(m,1H)，4.635～4.597(m,1H)，3.697(s,3H)，2.064～1.986(m,4H)，1.779～1.751(m,2H)

實施例2化合物2的製備

參考實施例1中化合物1的合成方法，使用氯甲酸異丙酯代替氯甲酸甲酯，製備得到化合物2。

MS m/z:527.23[M+H]

1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.793(s,1H)，7.688～7.658(m,3H)，7.431～7.392(m,2H)，7.217～7.177(m,3H)，7.117(d,j＝8.0Hz,2H)，6.616(s,1H)，6.356～6.328(m,1H)，5.734～5.704(m,1H)，4.957～4.896(m,3H)，3.849～3.788(m,1H)，3.457～3.429(m,1H)，3.237～3.233(m,1H)，3.202～2.934(m,1H)，2.430～2.289(m,1H)，2.068～2.027(s,1H)，1.629(s,1H)，1.301～1.253(m,6H)

實施例3化合物3的製備

伊布替尼(2.2g，4.994mmol)和DMAP(0.61g，4.993mmol)於二氯甲烷中，加入吡啶(10ml)的二氯甲烷溶液(30ml)，攪拌溶清，得黃色透明溶液，15℃下，滴加氯甲酸正丁酯(5ml)的二氯甲烷溶液。反應2h後，加20ml水終止反應，水相再用等量二氯甲烷萃取一次，合併有機相，有機相用20ml水洗滌3次，分出有機相，無水硫酸鎂乾燥。抽濾，濾液30℃以下旋蒸乾，層析柱分離，用乙酸乙酯：石油醚＝8:1到5:1洗脫，得化合物3。

MS m/z:641.01[M+H]

1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.935(s,1H)，7.635(d,j＝14Hz,3H)，7.415～7.286(m,2H)，7.192～7.155(m,3H)，7.100～7.070(m,2H)，6.695～6.600(m,1H)，6.375～6.334(m,1H)，5.788～5.679(m,1H)，5.021～4.986(m,2H)，4.042～3.978(m,4H)，3.862～3.789(m,1H)，3.414～3.402(m,1H)，3.290～3.199(m,1H)，3.266～3.188(m,1H)，2.974～2.889(m,1H)，2.334～2.310(m,2H)，2.059～1.802(m,2H)，1.669～1.649(m,1H)，1.494(d,j＝18.4Hz,4H)，0.970(s,6H)

實施例4化合物4的合成

伊布替尼(2.2g，4.994mmol)和DMAP(0.61g，4.993mmol)於二氯甲烷中，加入吡啶(10ml)的二氯甲烷溶液(30ml)，攪拌溶清，得黃色透明溶液，15℃下，滴加乙醯氯(4ml)的二氯甲烷溶液。反應2h後，加20ml水終止反應，水相再用等量二氯甲烷萃取一次，合併有機相，有機相用20ml水洗滌3次，分出有機相，無水硫酸鎂乾燥。抽濾，濾液30℃以下旋蒸乾，層析柱分離，用乙酸乙酯：石油醚＝8:1到5:1洗脫，得化合物4。

MS m/z:483[M+H]

1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.685(s,1H)，8.183(s,1H)，7.642(d,j＝7.8Hz,2H)，7.429～7.390(m,2H)，7.210～7.172(m,3H)，7.125(d,j＝8.4Hz,2H)，6.636～6.544(m,1H)，6.348～6.289(m,1H)，5.755～5.670(m,1H)，4.951～4.889(m,1H)，4.636～4.610(m,1H)，2.549(s,3H)，2.302～2.278(m,3H)，2.059～2.021(m,2H)，1.780～1.748(m,2H)

實施例5化合物5的合成

參考實施例4中化合物4的合成方法，使用異丁醯氯代替乙醯氯，製備得到化合物5。

MS m/z:511.2[M+H]

1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.746(s,1H)，8.130(s,1H)，7.649(d,j＝8.4Hz,2H)，7.211～7.163(m,3H)，7.106(d,j＝7.8Hz,2H)，6.658～6.548(m,1H)，6.358～6.290(m,1H)，5.766～5.703(m,1H)，4.942～4.622(m,2H)，3.804～3.787(m,1H)，3.417～3.232(m,1H)，2.992～2.888(m,2H)，2.438～2.305(m,2H)，2.065～2.021(m,2H)，1.781(m,2H)，1.176(d,j＝6.8Hz,6H)

實施例6化合物6的合成

參考實施例1中化合物1的合成方法，使用氯甲酸乙酯代替氯甲酸甲酯，製備得到化合物6。

MS m/z:513[M+H]

1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.780(s,1H),7.684(s,2H)，7.425～7.385(m,3H)，7.190～7.169(m,3H)，7.112(d,j＝7.8Hz,3H)，6.682～6.543(m,1H)，6.357～6.285(m,1H)，5.759～5.733(m,1H)，4.939～4.909(m,2H)，4.728～4.202(m,1H)，3.813～3.810(m,1H)， 3.416～3.228(m,2H)，3.228～2.935(m,1H)，2.434～2.284(m,2H)，2.022～1.812(s,2H)，1.780～1.727(m,2H)

實施例7化合物7的合成

參考實施例1中化合物1的合成方法，使用氯甲酸正丙酯代替氯甲酸甲酯，製備得到化合物7。

MS m/z:527.1[M+H]

1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.794(s,1H)，7.855(s,1H)，7.685(d,j＝7.6Hz,2H)，7.429～7.390(m,2H)，7.214～7.177(m,3H)，7.118(d,j＝8.8Hz,2H)，6.656～6.574(m,1H)，6.360～6.291(m,1H)，5.763～5.675(m,1H)，4.959～4.608(m,2H)，4.229(d,j＝0.8Hz,1H)，4.151～4.037(m,3H)，3.810(m,3H)，3.422～3.230(m,2H)，1.688～1.647(m,2H)，1.351～1.280(s,3H)

實施例8化合物8的合成

參考實施例1中化合物1的合成方法，使用氯甲酸異丁酯代替氯甲酸甲酯，製備得到化合物8。

MS m/z:541.1[M+H]

1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.788(s,1H)，7.682～7.613(m,2H)，7.428～7.389(m,2H)，7.217～7.170(m,3H)，7.113～7.096(m,2H)，6.651～6.549(m,1H)，6.357～6.290(m,1H)，5.763～5.674(m,1H)，4.984～4.898(m,2H)，3.899(d,j＝6.8Hz,2H)，2.939(m,1H)，2.755(m,1H)，2.498～2.067(m,3H)，2.025～1.955(m,2H)，1.816～1.639(m,2H)，1.298～1.280(m,6H)

實施例9化合物9的合成

參考實施例4中化合物4的合成方法，使用正戊醯氯代替乙醯氯，製備得到化合物9。

MS m/z:525.2[M+H]

1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.715(s,1H)，8.119(s,1H)，7.639(d,J＝7.8Hz,2H)，7.434～7.394(m,2H)，7.191～7.170(m,3H)，7.123(d,j＝7.8Hz,3H)，6.642～6.574(m,1H)，6.354～6.290(m,1H)，5.761～5.698(m,1H)，4.623(m,1H)，3.801(m,1H)，3.415～3.228(m,1H)，2.919(m,1H)，2.777～2.764(m,2H)，2.303～2.066(m,2H)，1.781(s,2H)，1.677～1.622(m,4H)，1.338～1.297(m,3H)

實施例10化合物10的合成

參考實施例1中化合物1的合成方法，使用氯甲酸正戊酯代替氯甲酸甲酯，製備得到化合物10。

MS m/z:555.62[M+H]

1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.744(s,1H)，7.656～7.635(m,1H)，7.379～7.344(m,2H)，7.184～7.177(m,3H)，7.155～7.045(m,2H)，6.667～6.568(m,1H)，6.330～6.288(m,1H)，5.713～5.674(m,1H)，4.957～4.868(m,2H)，2.379～2.212(m,4H)，2.059～1.979(m,2H)，1.881～1.687(m,2H)，1.661～1.642(m,3H)，1.403～1.308(m,3H)，1.308～1.236(m,6H)

實施例11化合物11的合成

參考實施例1中化合物1的合成方法，使用氯甲酸異戊酯代替氯甲酸甲酯，製備得到化合物11。

MS m/z:555.44[M+H]

1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.742(s,1H)，7.669～7.639(m,1H)，7.387～7.352(m,2H)，7.199～7.188(m,3H)，7.166～7.125(m,2H)，6.698～6.518(m,1H)，6.336～6.297(m,1H)，5.728～5.699(m,1H)，4.978～4.887(m,2H)，2.389～2.222(m,4H)，2.129～1.989(m,2H)，1.852～1.677(m,2H)，1.652～1.638(m,3H)，1.400～1.355(m,3H)，1.318～1.276(m,6H)

實施例12化合物12的合成

參考實施例4中化合物4的合成方法，使用丙醯氯代替乙醯氯，製備得到化合物12。

MS m/z:497.47[M+H]

1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝8.872(s,1H)，7.652(d,J＝7.8Hz,2H)，7.431～7.396(m,2H)，7.220～7.180(m,3H)，7.130(d,J＝8.4Hz,2H)，6.640～6.540(m,1H)，6.349～6.290(m,1H)，5.752～5.671(m,1H)，4.952～4.889(m,2H)，4.647～4.619(m,1H)，3.853～3.781(m,1H)，3.422(s,1H)，3.240(s,1H)，2.555(s,1H)，2.309～2.279(m,1H)，2.060～2.030(m,4H)，1.200～1.188(m,3H)

實施例13測定本發明化合物對體外細胞增殖的抑制活性

A549細胞、N87細胞和U251細胞均由購買獲得。以下為一般性實驗步驟：

取處於指數生長期、狀態良好的貼壁細胞，用PBS(磷酸鹽緩衝液)洗兩遍，加入0.05％胰蛋白酶消化液(Gibco公司，貨號25300-062)2ml，消化使貼壁細胞脫落，再加入2ml完全培養基(含10％胎牛血清，Gibco公司，貨號：10099-141)終止消化。

取出消化好的細胞懸液離心，1000轉/分鐘，離心5分鐘，培養基重懸後計數至所需濃度後，接種至96孔細胞培養板；對於懸浮細胞，直接取細胞懸液離心，1000轉/分鐘，離心5分鐘，培養基重懸後計數至所需濃度，每孔100μL接種至96孔細胞培養板。CO2培養箱中(Thermo公司，型號371)培養24小時，配製待測化合物，使其濃度為終濃度的10倍，加入到細胞培養板中，11μL/孔，CO2培養箱中繼續培養72小時，期間貼壁細胞使用活細胞工作站進行實時拍照，8小時拍照一次，軟體計算其融合度，根據融合度值的大小計算抑制率，懸浮細胞使用CCK-8(Dojindo公司，貨號：CK04)檢測試劑進行檢測，每孔加入10μL，37℃孵育3小時，全波長酶標儀(Thermo公司，型號Varioskan Flash)在450nm處讀取吸光值，計算抑制率。採用四參數擬合方式，對檢測結果的抑制率擬合曲線計算IC50值，結果如下表1、2、3。

表1

表2

表3

實施例14測定本發明化合物的藥代動力學

取健康的SD雄性大鼠，體重200～220g，每天定時飼以大滑鼠準配方顆粒飼料，實驗前禁食12h，給藥後4h恢復供食，實驗前後和實驗過程中均自由飲水。

隨機分組，每組4隻，分別單劑量灌胃給予待測化合物。每組大鼠的給藥劑量均按摩爾濃度折算為相當於依布替尼20mg/kg，分別於給藥前(0h)和給藥後0.0833、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、24h由眼底靜脈叢取血約0.2～0.3ml，EDTA-K2抗凝，離心分離血漿，準確量取50μL，加入500μL內標溶液，用渦旋混合器高速混勻3min，離心10min(4℃，13800rpm)，收集上清液，轉移100μL上清液至進樣瓶，LC-MS/MS進樣0.5μL檢測，記錄色譜圖，得到每個時間點的血漿中的血藥濃度。

根據所得的給藥後平均血藥濃度-時間數據，採用Winnonin軟體，按非房室統計矩理論求算相關藥代動力學參數，詳見下表4、5、6、7。

表4

表5

表6

表7