一種含氮雜環化合物降解菌及其應用的製作方法
2023-05-03 16:08:01
本發明屬於生物技術領域，涉及一種含氮雜環化合物降解菌及其應用。
背景技術：
含氮雜環化合物是主要的雜環化合物，多數氣味惡臭且毒性大，不僅對人體健康與生態環境造成威脅，還對微生物產生抑制作用。其通常被用作醫藥和農藥的結構單元，是焦化廢水有機汙染物質的主要組分，佔總有機組分的20-30%，含量超過200mg/l，廣泛存在於染料廢水、醫藥廢水、農藥廢水等工業廢水及木材防腐處理場地周圍的土壤和地下水中，易於進行結構修飾，可方便地引入各種功能基。
廢水處理中常見的含氮雜環化合物主要有吡咯、吡啶、喹啉、甲基喹啉及其衍生物等。由於吡啶與喹啉是含氮雜環化合物的典型代表，又是大量複雜含氮雜環化合物的基本結構單元，而且這兩類化合物均屬於難降解有機物，在普通生物處理單元中不易徹底去除，同時吡啶與喹啉對許多微生物還會產生毒害作用，從而影響其它化合物的去除效果。另外這些物質在環境中長期積累，不僅汙染環境，而且影響人類生活，損害人體健康。
含吡啶環的氮雜環化合物(簡稱吡啶類化合物)數目尤其龐大，且易溶於水，化學性質穩定，極易通過擴散進入地下水系統導致水環境的汙染。呈中度急性毒性，有明顯的致畸變性，神經系統有致毒作用，對人類的健康構成潛在的威脅。另外吡啶對微生物呈強烈抑制作用，並且難於被空氣氧化，因而給地面水的自淨及汙水的無害化處理過程造成困難，是造成這類廢水難生物降解的主要原因。喹啉是一種典型的含氮雜環化合物，在化工工業、醫藥及農藥生產中經常用作溶劑和原材料。煉焦企業生產過程產生的焦化廢水中含有喹啉類雜環化合物，是典型的有毒難降解汙染物，也是造成其出水不能達標的關鍵因素。因此，隨著工業生產中廢水的排放，喹啉已成為土壤、地表水及地下水中常見的汙染物。
與脂肪族或芳香族化合物相比，含氮雜環化合物不易受到代謝過程的破壞，其生物降解性能也很差，並且此類物質中許多有致癌、致畸、致突變的性質，對環境和人體健康會產生潛在的危害，因此很多研究者對含氮雜環化合物的生物降解特性展開了研究。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種含氮雜環化合物降解菌及其應用，所述阿氏芽孢桿菌（bacillusaryabhattai）faq-7在好氧條件下降解吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為：
一種含氮雜環化合物降解菌，其分類命名為阿氏芽孢桿菌（bacillusaryabhattai）faq-7，其已於2017年5月15日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（cgmcc），地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號：cgmccno.14162。所述阿氏芽孢桿菌（bacillusaryabhattai）faq-7能以含氮雜環化合物為唯一碳源、氮源。
本發明所得菌株篩選自農藥廢水和焦化廢水處理池的活性汙泥，經過含吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉混合汙染物的富集培養基富集培養，再以含氮雜環化合物為唯一碳源、氮源的無機鹽培養基分別馴化培養、篩選、分離、純化獲得。具體方法如下：
1)取農藥廢水和焦化廢水處理池活性汙泥10ml，加入到100ml含氮雜環化合物濃度300mg/l無機鹽液體培養基中，於30℃、160r/min條件下富集培養。以10%接種量轉入到新的含氮雜環化合物無機鹽液體培養基中，富集轉接4次，獲得富集液；
2)取富集液1ml進行梯度稀釋，取10-1~10-8稀釋後的液體0.2ml塗布於含氮雜環化合物固體培養基，挑取單菌落分離純化。所述無機鹽培養基組成：每1l培養基含k2hpo41.5g，kh2po41g，nacl1g，mgso4·7h2o0.2g，cacl20.02g以及1ml微量元素溶液，ph=7.0，121℃滅菌20min。固體培養基為在無機鹽培養基基礎上加2.0%的瓊脂。
該菌株為革蘭氏陽性、具有運動性，菌落圓形、平滑、呈淡黃色、直徑2-3mm，能夠在10℃-37℃、ph6-10蛋白腖瓊脂培養基上生長，耐受11.6%的鹽，從各種碳源中產酸並且利用一些糖類、胺基酸和其它碳物質作為唯一的碳源。
所述菌株能以吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉為唯一碳源、氮源和能源生長，在無機鹽培養基中，當吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉的濃度300mg/l時，接種阿氏芽孢桿菌能明顯促進含氮雜環化合物的降解，72h內吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉的降解率分別為92.19%、100%、100%、92.68%和93.27%。
所述菌株的培養方法：將所述菌株在lb培養基上進行活化。挑取單菌落接種於5mllb培養基中，於30℃、160r/min震蕩培養至對數期。按2%接種量接種於無機鹽培養基中於30℃、160r/min震蕩培養得到相應菌劑。所述lb培養基組成：每1l培養基含nacl10g，蛋白腖10g，酵母粉5g，固體培養基加2%瓊脂。無機鹽培養基組成：每1l培養基含k2hpo41.5g，kh2po41g，nacl1g，mgso4·7h2o0.2g，cacl20.02g以及1ml微量元素溶液，ph=7.0。121℃滅菌20min。
所述含氮雜環化合物降解菌在降解氮雜環化合物中的應用。
所述含氮雜環化合物降解菌在修復含氮雜環化合物汙染土壤或者水體中的應用。
將阿氏芽孢桿菌（bacillusaryabhattai）faq-7在lb培養基中培養到對數期，然後接種至氮雜環化合物培養基或者含氮雜環化合物汙染土壤或者水體中，進行降解反應。
所述降解反應過程的溫度為20℃-30℃，優選為30℃，ph5.0-7.0，優選為ph7.0。
所述含氮雜環化合物為單雜環化合物中的六元雜環或者稠雜環化合物。
所述含氮雜環化合物為吡啶及其衍生物甲基吡啶和甲基哌嗪等，或者喹啉及其衍生物甲基喹啉等。
所述阿氏芽孢桿菌能以含氮雜環化合物為唯一碳源、氮源，可以直接將菌液加入到待處理的土壤或汙染水中，降解汙染物。
有益效果：
本發明所述阿氏芽孢桿菌株降解性能穩定，降解底物範圍較廣，適用於含氮雜環化合物汙染土壤及水的生物修復。本發明所所述菌株能使焦化廠廢水中喹啉等含氮雜環化合物的降解率達到95%以上。在無機鹽培養基中，當吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉的濃度300mg/l時，接種阿氏芽孢桿菌能明顯促進含氮雜環化合物的降解，72h內吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉的降解率分別為92.19%、100%、100%、92.68%和93.27%，降解效率高。
附圖說明
圖1阿氏芽孢桿菌菌落形態圖；
圖2阿氏芽孢桿菌株對含氮雜環化合物的降解率圖；
圖3溫度對阿氏芽孢桿菌降解效率的影響；
圖4ph對阿氏芽孢桿菌降解效率的影響。
具體實施方式
為進一步了解本發明的內容，下面結合實施例對本發明作進一步的描述。
實施例1阿氏芽孢桿菌的分離與鑑定
現場採集農藥廢水和焦化廢水處理池的活性汙泥各5ml，加入到100ml含氮雜環化合物總濃度300mg/l的無機鹽培養基中，在30℃、160r/min條件下進行富集培養。以10%接種量轉入到新的含氮雜環化合物無機鹽液體培養基中，經過4次連續轉接，獲得富集液。取富集液1ml進行梯度稀釋，取10-1~10-8稀釋後的液體0.2ml塗布於含氮雜環化合物固體培養基，挑取單菌落分離純化，得到純菌，純菌再接種至液體培養中驗證其降解含氮化合物能力。最後得到一株能夠高效降解含氮化合物的菌株，如圖1所示。經過16srdna鑑定為阿氏芽孢桿菌（bacillusaryabhattai）faq-7；所述無機鹽培養基組成：每1l培養基含k2hpo41.5g，kh2po41g，nacl1g，mgso4·7h2o0.2g，cacl20.02g以及1ml微量元素溶液，ph=7.0，固體培養基再加2.0%的瓊脂，121℃滅菌20min。
該菌株為革蘭氏陽性、具有運動性，菌落圓形、平滑、呈淡黃色、直徑2-3mm，能夠在10℃-37℃、ph6-10蛋白腖瓊脂培養基上生長，耐受11.6%的鹽，從各種碳源中產酸並且利用一些糖類、胺基酸和其它碳物質作為唯一的碳源。
實施例2阿氏芽孢桿菌降解含氮化合物能力實驗
將上述鑑定為阿氏芽孢桿菌的菌株faq-7以6%接種量分別接種至含有300mg/l含氮雜環化合物吡啶、甲基吡啶、哌嗪、喹啉和甲基喹啉培養基中，在30℃、160r/min條件下搖床中培養。72h後分別測定含氮化合物含量。由圖2可知72h內，降解率分別達到92.19%、100%、100%、92.68%和93.27%。
實施例3溫度對降解效率的影響
將在lb培養基中培養到對數期的阿氏芽孢桿菌（bacillusaryabhattai）faq-7的菌株，以6%的接種量接到含有300mg/l的培養基中，分別置於20℃、25℃、30℃、35℃、37℃，160r/min搖床上，72h後測定含氮雜環化合物的含量，如圖3所示。在20℃-30℃範圍內降解率在不斷上升，在30℃時，降解率幾乎都達到100%；當溫度為35℃和37℃時，降解率下降。以上結果表明含氮雜環化合物的最適降解溫度都為30℃。
實施例4ph對降解效率的影響
將在lb培養基中培養到對數期的阿氏芽孢桿菌faq-7的菌株，以6%的接種量接到含有300mg/l的培養基中，ph值分別調至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，160r/min搖床上，72h後測定含氮雜環化合物的含量，如圖4所示。在ph5.0-7.0範圍內阿氏芽孢桿菌對吡啶、甲基吡啶、哌嗪、喹啉和甲基喹啉的降解率在不斷上升，在ph7.0時，降解率幾乎都接近100%；當ph8.0-9.0時，降解率明顯下降。以上結果表明含氮雜環化合物的最適降解ph都為ph7.0。
實施例5阿氏芽孢桿菌對汙染水體中含氮雜環化合物的降解
取廣東省某焦化汙水廠的活性汙泥5g加入100ml無機鹽培養基中，測定其中喹啉、吡啶等含氮雜環化合物的含量，並且以6%接種量接種阿氏芽孢桿菌faq-7菌株。置於30℃、160r/min條件下搖床中培養。72h後再次測定其中喹啉、吡啶等含氮雜環化合物的含量，降解率達到95%以上。所述無機鹽培養基組成：每1l培養基含k2hpo41.5g，kh2po41g，nacl1g，mgso4·7h2o0.2g，cacl20.02g以及1ml微量元素溶液，ph=7.0，121℃滅菌20min。