利用液體篩選系統進行根癌農桿菌介導香蕉基因轉化的方法
2023-05-03 14:43:01
專利名稱:利用液體篩選系統進行根癌農桿菌介導香蕉基因轉化的方法
技術領域：
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本發明屬於生物技術領域：
，具體涉及一種利用液體篩選系統進行根癌農桿菌介導香蕉基因轉化的方法。
背景技術:
香蕉屬芭蕉科(Musaceae)、芭蕉屬(Musa)，是一種重要的熱帶水果和糧食作物。大多數香蕉栽培品種是通過無性繁殖育種，而通過傳統的育種方式對香蕉種質進行改良具有很大的局限性。遺傳轉化技術的發展為香蕉品種的改良提供了一種有效的手段，而農桿菌介導香蕉胚性細胞懸浮系(embryogenic cell suspensions, ECS)轉化方法的應用是香蕉品種改良的一個重大突破。但是由於香蕉不完善的遺傳轉化體系，限制了香蕉轉基因實用化進程，主要原因是香蕉屬於單子葉植物，現有技術在利用上述農桿菌介導香蕉胚性細胞懸浮系(ECS)轉化方法時，存在香蕉胚性細胞懸浮系(ECS)不易被農桿菌侵染，轉化頻率很低，ECS胚誘導和萌發率低，即使共培階段獲得了少量的轉化懸浮細胞，採用已有的方法直接轉到半固體篩選培養基進行抗性篩選，在抗性篩選過程中，由於轉化細胞數量少，抗性胚的得率自然低，加 上抗性胚萌發率低，最終很難獲得轉基因植株，並且在培養過程中褐化現象使獲得轉基因植株的機率更低。公開號CN101096673的專利公開了一種利用液體共培養系統進行根癌農桿菌介導香蕉基因轉化方法，該方法雖然利用液體共培養克服在共培階段ECS褐化死亡的問題，但是利用該方法還是沒有解決轉基因植株的得率低的問題。
發明內容
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本發明的目的是針對現有技術中存在的不足，提供了一種能極大提高香蕉轉化效率，顯著提高轉基因植株得率的方法，即利用液體篩選系統進行根癌農桿菌介導香蕉基因轉化的方法。
本發明通過以下技術方案予以實現的:
本發明的利用液體篩選系統進行根癌農桿菌介導香蕉基因轉化的方法，包括以下步驟:
a)將香蕉ECS與攜有含有目的基因的質粒的根癌農桿菌共培養；
b)將共培養後的香蕉ECS，加入到液體篩選培養基中，加入量為每30 40ml液體篩選培養基加入0.1 0.5ml細胞密實體積(packed cell volume,PCV)的ECS，27±2°C，黑暗條件下，轉速100 120rpm振蕩培養，每7 10天繼代一次，連續繼代3代以上，獲得的抗性香蕉ECS，即為轉化的香蕉ECS，所述的繼代的方法是，每30 40ml新的液體篩選培養基中加入上一代的懸浮培養物0.1 0.5ml,繼續振蕩培養；
c)將上一步驟篩選得到的轉化的香蕉ECS經體胚誘導、體胚萌發，誘導出苗，再經生根培養，得到轉基因香蕉植株。
所述的液體篩選培養基組成為每升培養基中含有Img 2、4_D、lmg生物素、IOOmg穀氨醯胺、IOOmg麥芽提取物、45g鹿糖、20 50mg頭孢黴素和相應的篩選抗生素,其餘成份為MS基本培養基,PH值為5.3。所述的相應篩選抗生素根據上述含有目的基因質粒上的篩選標記基因而定，其濃度根據香蕉ECS對其敏感性而確定，篩選標記基因可以為潮黴素抗性基因或卡那黴素抗性基因，其中潮黴素抗性基因相應的篩選抗生素為潮黴素，卡那黴素抗性基因相應的篩選抗生素為卡那黴素或G-418。如目的基因的質粒上含有潮黴素標記,那麼在液體篩選培養基中添加潮黴素，其濃度為IOmg/1。
本發明所述的將香蕉ECS與攜有含有目的基因的質粒的根癌農桿菌共培養優先實施方式如下:將攜有含有目的基因的質粒的根癌農桿菌於YEB固體培養基上劃線，27土1°C條件下培養，然後挑取單個菌落接種於YEB液體培養基中，27±1°C，100 150rpm振蕩培養到菌液OD26tl值為0.5 0.8時，菌液離心去上清後，收集菌體，然後用原菌液20倍體積的香蕉ECS液體培養基重懸菌體，得到工程菌液。取在香蕉ECS液體培養中繼代培養7 10天的香蕉ECS，然後將該香蕉ECS靜置去上清，以每20 40ml工程菌液中加入Iml細胞密實體積的上述靜置去上清的香蕉ECS，27±2°C，黑暗靜置I 2小時，然後將其轉入共培養，培養條件為27±2°C，黑暗條件下，40 60rpm轉速下振蕩培養12 24小時，然後將培養物靜置去上清，再加入新的與初始共培養時的工程菌液等體積的香蕉ECS液體培養基，提高轉速至100 120rpm，繼續共培養6 10天。採用這種液體共培養的方式，可以有效的防止共培階段香蕉ECS褐化死亡的問題。
本發明所述的轉化的香蕉ECS經體胚誘導是將篩選得到的轉化的香蕉ECS，靜置去上清，然後將其均勻鋪於體胚誘導培養基上，黑暗條件下，培養2 3個月，每個月更換一次體胚誘導培養基，培養成成熟的抗性體胚。將此成熟的抗性體胚轉移至體胚萌發培養基上，光暗交替條件下培養至體胚萌發得到小苗，然後將小苗轉移至生根培養基上，光暗交替條件下進行培養，獲得轉基因香蕉植株。
所述的MS基本培養基為國際通用的培養基，其成分和配製方法參見譚文澄、戴策剛主編，《觀賞植物組織培養技術》，北京:中國林業出版社，1991。
所述的YEB培養基(髮根農桿菌培養基)的配方為Beef extract (牛肉浸膏)5g/L, Yeastextract (酵母膏)lg/L, Peptone (蛋白腺)5g/L, Sucrose (鹿糖)5g/L, MgSO4.7H2O4g/L，pH 7.4，其固體培養基是在上述培養基的基礎上加入常量的瓊脂。
所述的香蕉ECS液體培養基組成為每升培養基中含有Img 2、4-D、lmg生物素、IOOmg穀氨醯胺、IOOmg麥芽提取物、45g蔗糖，其餘為MS基本培養基，PH值為5.3。
所述的體胚誘導培養基組成為:每升培養基中含有SH培養基中的大量兀素和微量元素及其鐵鹽、MS培養基的維生素、Img生物素、IOOmg穀氨醯胺、IOOmg麥芽提取物、
0.2mgNAA( a -奈乙酸)、0.1mg Kinetin (激動素)、45g鹿糖、7g瓊脂粉、20 50mg頭孢黴素，PH 5.8。所述的SH培養基為國際通用的培養基，其成分和配製方法參見利容千、王明全主編，《植物組織培養簡明教程》，武漢:武漢大學出版社，2004。
所述的體胚萌發培養基組成為每升體胚萌發培養基含有0.1mg 6-BA(6_節氨基嘌呤)，0.2mg IAA (生長素)，IOOmg穀氨醯胺，IOOmg麥芽提取物，30g蔗糖，7g瓊脂粉，其餘為MS基本培養基，pH 5.8。
所述生根培養基組成為:每升生根培養基含有IOOmg穀氨醯胺，IOOmg麥芽提取物，30g蔗糖，7g瓊脂粉，其餘為MS基本培養基，pH 5.8。[0018]本發明通過對香蕉ECS與攜有含有目的基因質粒的根癌農桿菌共培養後的香蕉ECS，採用液體篩選培養系統，與現有技術中採用的半固體篩選培養基進行抗性篩選相比，本發明能將共培階段獲得的極少量轉化細胞利用液體篩選得到擴大增殖，非轉化細胞通過篩選剔除，經過3代以上的篩選，最終獲得的香蕉ECS均為轉化的香蕉ECS，因此本發明可以通過液體篩選系統實現了轉化的香蕉ECS的增殖，為後續的體胚誘導、體胚萌發，誘導出苗，再經生根培養，得到轉基因香蕉植株，提供了豐富的轉化的香蕉ECS，從而大大地提高了轉基因香蕉植株的得率，極大地提高了轉化效率。同時建立起的轉基因香蕉ECS，可作為進一步的科研材料。
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圖1是未經轉化的香蕉ECS ；
圖2是共培養8天後，培養物經GUS染色後的圖，圖中箭頭所指的藍色點為轉化的香蕉ECS ；
圖3是經過液體篩選，篩選到第三代，培養物經GUS染色後的圖，圖中藍色點為轉化的香蕉ECS ；
圖4是利用液體篩選系統獲得的轉⑶S基因過山香，其中A為獲得的轉⑶S基因過山香ECS經⑶S染色後的圖，B為未經轉化的過山香ECS對照；
圖5是利用液體篩選系統獲得的轉⑶S基因巴西蕉，其中C為獲得的轉⑶S基因巴西蕉ECS經⑶S染色後的圖，D為未經轉化的巴西蕉ECS對照；
具體實施方式
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實施例1
(I)將攜有含有⑶S基因的質粒pCAMBIA1301 (質粒上具有的抗性標記為潮黴素抗性基因)的根癌農桿菌EHA105於YEB固體培養基上劃線，28°C條件下培養，然後挑取單個菌落接種於YEB液體培養基中，280C，120rpm振蕩培養到菌液OD26tl值為0.5，菌液離心去上清後，用原菌液20倍體積的香蕉ECS液體培養基重懸菌體，得到工程菌液；
(2)取在香蕉ECS液體培養中繼代培養7天的貢蕉(Pisang Mas，基因型AA)ECS，靜置去上清後，在40ml經步驟(I)獲得的工程菌液中加入Iml細胞密實體積(packedcellvolume, PCV)的貢蕉 ECS，27±2°C，黑暗靜置 1.5 小時；
(3)然後將其轉入共培養，共培養條件為:27±2°C，黑暗條件下，50rpm轉速下振蕩培養12小時，然後將培養物靜置去上清，再加入40ml的新的香蕉ECS液體培養基，然後提高轉速至IlOrpm,繼續共培養8天。8天後,取Iml培養物⑶S染色,結果可以看到極少量被染成藍色的轉化細胞(如圖2所示，箭頭所指的部分)，而未經轉化的ECS沒有染上色(如圖1所示)；
(4)共培養完成後，將培養物靜置去上清，取0.2ml細胞密實體積的共培養後的貢蕉ECS,加入到40ml液體篩選培養基(篩選培養基添加的抗生素為潮黴素，濃度為10mg/l)中，27±2°C，黑暗條件下，轉速IOOrpm振蕩培養，每10天繼代一次，連續繼代3次，獲得的貢蕉抗性ECS即為轉化的貢蕉ECS。所述的繼代方法是取上一代的懸浮培養物0.1ml加入到40ml的新鮮的液體篩選培養基，繼續振蕩培養。取Iml繼代三代後的培養物GUS染色檢測，結果可以看到貢蕉ECS全部被染成藍色，證明獲得的ECS即為貢蕉轉GUS基因的ECS(如圖3所示)；
(5)取篩選培養3代的培養物靜置去上清，將其均勻鋪於體胚誘導培養基上，黑暗條件下，常規培養3個月，每個月更換一次體胚誘導培養基，獲得成熟的抗性體胚；
(6)將成熟的抗性體胚轉移至體胚萌發培養基上，光暗交替條件下，常規培養至體胚萌發得到小苗，然後將小苗轉移至生根培養基上，光暗交替條件下進行培養即獲得完整的貢蕉轉GUS基因植株。
從本實施例中及其圖1、2、3中可以看出，通過液體篩選系統，可以將經過液體共培後獲得的少量轉化的貢蕉ECS(如圖2中經GUS染色後的藍色點，即圖2中顏色比較深的點，箭頭所指的部分)進行增殖，從而獲得大量的轉化的貢蕉ECS(如圖3所示)用於培育轉基因的貢蕉。
實施例2
(I)將攜有含有⑶S基因的質粒pCAMBIA1301 (質粒上具有的抗性標記為潮黴素抗性基因)的根癌農桿菌EHA105於YEB固體培養基上劃線，26°C條件下培養，然後挑取單個菌落接種於YEB液體培養基中，270C，140rpm振蕩培養到菌液OD26tl值為0.8，菌液離心去上清後，用原菌液20倍體積的香蕉ECS液體培養基重懸菌體，得到工程菌液；
(2)取在香蕉ECS液體培養中繼代培養9天的香蕉主栽品種過山香(Musa SilkCV.Guoshanxiang,基因型AAB) ECS，靜置去上清後，在20ml經步驟⑴獲得的工程菌液中加入Iml細胞密實體積(packed cell volume,PCV)的過山香ECS，27±2°C，黑暗靜置1.8小時；
(3)然後將其轉入共培養，共培養條件為:27±2°C，黑暗條件下，45rpm轉速下振蕩培養24小時，然後將培養物靜置去上清，再加入20ml的香蕉ECS液體培養基，提高轉速至120rpm，繼續共培養10天。10天後，取Iml培養物⑶S染色，結果可以看到極少量被染成藍色的轉化細胞；
(4)共培養完成後，將培養物靜置去上清，取0.5ml細胞密實體積的共培養後的ECS，加入到30ml液體篩選培養基(篩選培養基添加抗生素為潮黴素，濃度為10mg/L)中，27±2°C，黑暗條件下，轉速120rpm振蕩培養，每8天繼代一次，連續繼代5代，獲得的抗性ECS即為轉化的過山香ECS。所述的繼代的方法是，取上一代的懸浮培養物0.3ml加入到30ml新鮮的液體篩選培養基中，繼續振蕩培養。取Iml繼代5代後的培養物GUS染色檢測，結果可以看到ECS全部被染上藍色(如圖4-A所示)，而未經轉化的ECS沒有染上色(如圖4-B所示)，證明獲得的轉化ECS即為過山香轉GUS基因的ECS，由此可見，通過液體篩選系統，本實施例將共培養後獲得的少量的轉化過山香ECS增殖成大量的轉化過山香ECS ;
(5)取篩選培養5代的培養物靜置去上清，然後將其均勻鋪於體胚誘導培養基上，黑暗條件下，常規培養2個月，每個月更換一次體胚誘導培養基，2個月後，獲得成熟的抗性體胚；
(6)將成熟的抗性體胚轉移至體胚萌發培養基上，光暗交替條件下，常規培養至體胚萌發得到小苗，然後 將小苗轉移至生根培養基上，光暗交替條件下進行培養，獲得完整的過山香轉⑶S基因植株。
實施例3[0040](I)將攜有含有⑶S基因的質粒pCAMBIA1301 (質粒上具有的抗性標記為潮黴素抗性基因)的根癌農桿菌EHA105於YEB固體培養基上劃線，27°C條件下培養，然後挑取單個菌落接種於YEB液體培養基中，260C，150rpm振蕩培養到菌液OD26tl值為0.6，菌液離心去上清後，用原菌液20倍體積的香蕉ECS液體培養基重懸菌體，得到工程菌液；
(2)取在香蕉ECS液體培養中繼代培養8天的香蕉主栽品種巴西蕉(MusaCavendish cv.Baxi，基因型AAA)的ECS，靜置去上清後，在30ml經步驟(I)獲得的工程菌液中加入Iml細胞密實體積(packed cell volume, PCV)的巴西蕉ECS，27±2°C，黑暗靜置I小時。
(3)然後將其轉入共培養，共培養條件為:27±2°C，黑暗條件下，60rpm轉速下振蕩培養18小時，然後將培養物靜置去上清，再加入30ml新的香蕉ECS液體培養基，提高轉速至120rpm，繼續共培養6天。6天後，取Iml培養物GUS染色，結果可以看到極少量被染成藍色的轉化細胞；
(4)共培養完成後，將培養物靜置去上清，取0.3ml細胞密實體積的共培養ECS，加入到30ml液體篩選培養基(篩選培養基添加抗生素為卡那黴素，濃度為10mg/L)中，27±2°C，黑暗條件下，轉速IlOrpm振蕩培養，每7天繼代一次，連續繼代9代，獲得的抗性ECS即為轉化的香蕉ECS。所述的繼代的方法是，取上一代的懸浮培養物0.5ml加入到40ml新鮮的液體篩選培養基中，繼續振蕩培養。取Iml繼代9代後的培養物GUS染色檢測，結果可以看到，ECS全部被染上藍色(如圖5-C所示)，而未經轉化的ECS沒有染上色(如圖5-D所示)。證明本實施例通過液體篩選，將共培養後獲得的少量的抗性ECS增殖獲得大量的抗性ECS即為巴西蕉轉⑶S基因的ECS ；
(5)取篩選培養9代的培養物靜置去上清，然後將其均勻鋪於體胚誘導培養基上，黑暗培養3個月，每個月更換一次體胚誘導培養基，獲得成熟的抗性體胚；
(6)將成熟的抗性體胚轉移至體胚萌發培養基上，光暗交替條件下，常規培養至體胚萌發得到小苗，然後將小苗轉移至生根培養基上，光暗交替條件下進行培養，獲得完整的巴西蕉轉⑶S基因植株。
權利要求
1.一種利用液體篩選系統進行根癌農桿菌介導香蕉基因轉化的方法，其特徵在於包括以下步驟: a)將香蕉ECS與攜有含有目的基因的質粒的根癌農桿菌共培養； b)將共培養後的香蕉ECS，加入到液體篩選培養基中，加入量為每30 40ml液體篩選培養基加入0.1 0.5ml細胞密實體積的ECS，27±2°C，黑暗條件下，轉速100 120rpm振蕩培養，每7 10天繼代一次，連續繼代3代以上，獲得的抗性香蕉ECS，即為轉化的香蕉ECS，所述的繼代的方法是，每30 40ml新的液體篩選培養基中加入上一代的懸浮培養物0.1 0.5ml，繼續振蕩培養； c)將轉化的香蕉ECS經體胚誘導、體胚萌發，誘導出苗，再經生根培養，得到轉基因香蕉植株； 所述的液體篩選培養基組成為每升培養基中含有Img2、4-D、lmg生物素、IOOmg穀氨醯胺、IOOmg麥芽提取物、45g蔗糖、2(T50mg頭孢黴素和相應的篩選抗生素，其餘成份為MS基本培養基，PH值為5.3，所述的相應的篩選抗生素根據含有上述含有目的基因的質粒上的篩選標記基因而定。
2.根據權利要求
1所述的利用液體篩選系統進行根癌農桿菌介導香蕉基因轉化的方法，其特徵在於所述的共培養步驟如下: a)將攜有含有目的基因的質粒的根癌農桿菌於YEB固體培養基上劃線，27土 1°C條件下培養，然後挑取單個菌落接種於YEB液體培養基中，27 ± I °C，100 150rpm振蕩培養到菌液OD26tl值為0.5 0.8時，菌液離心去上清後，收集菌體，然後用原菌液20倍體積的香蕉ECS液體培養基重懸菌體，得到工 程菌液； b)取在香蕉ECS液體培養中繼代培養7 10天的香蕉ECS,然後將該香蕉ECS靜置去上清； c)以每20 40ml步驟a)得到的工程菌液中加入Iml細胞密實體積的步驟b)靜置去上清的香蕉ECS，27±2°C，黑暗靜置I 2小時，然後將其轉入共培養，培養條件為27±2°C，黑暗條件下，40 60rpm轉速下振蕩培養12 24小時，然後將培養物靜置去上清，再加入新的與初始共培養時的工程菌液等體積的香蕉ECS液體培養基，提高轉速至100 120rpm，繼續共培養6 10天； 所述的香蕉ECS液體培養基組成為每升培養基中含有Img2、4-D、lmg生物素、IOOmg穀氨醯胺、IOOmg麥芽提取物、45g蔗糖，其餘為MS基本培養基，pH值為5.3。
3.根據權利要求
1所述的利用液體篩選系統進行根癌農桿菌介導香蕉基因轉化的方法，其特徵在於所述的篩選標記基因為潮黴素抗性基因，在液體篩選培養基中加入的相應的篩選抗生素為潮黴素。
4.根據權利要求
1所述的利用液體篩選系統進行根癌農桿菌介導香蕉基因轉化的方法，其特徵在於所述的篩選標記基因為卡那黴素抗性基因，在液體篩選培養基中加入的相應的篩選抗生素為卡那黴素。
5.根據權利要求
1或2所述的利用液體篩選系統進行根癌農桿菌介導香蕉基因轉化的方法，其特徵在於所述的香蕉為貢蕉(Pisang Mas)、過山香(Musa Silk cv.Guoshanxiang)或巴西蕉(Musa Cavendish cv.Baxi)。
6.根據權利要求
1或2所述的利用液體篩選系統進行根癌農桿菌介導香蕉基因轉化的方法，其特徵在於所述的質粒為質粒PCAMBIA1301。
專利摘要
本發明公開了一種利用液體篩選系統進行根癌農桿菌介導香蕉基因轉化的方法，旨在提供一種能極大提高香蕉轉化效率，顯著提高轉基因植株得率的方法。它包括將香蕉ECS與攜有含有目的基因的質粒的根癌農桿菌共培養；將共培養後的香蕉ECS，利用液體篩選系統對其進行篩選、增殖，獲得的抗性香蕉ECS，即為轉化的香蕉ECS，將篩選得到的轉化的香蕉ECS經體胚誘導、體胚萌發，誘導出苗，再經生根培養，得到轉基因香蕉植株。本發明可用於香蕉品種的改良。
文檔編號A01H4/00GKCN101654684 B發布類型授權 專利申請號CN 200910192122
公開日2013年5月8日 申請日期2009年9月7日
發明者胡春華, 易幹軍, 魏嶽榮, 黃永紅 申請人:廣東省農業科學院果樹研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),