一種木瓜蛋白酶的純化方法
2023-05-03 14:54:51 2
專利名稱：一種木瓜蛋白酶的純化方法
技術領域：
本發明涉及一種木瓜蛋白酶的純化方法。
背景技術：
木瓜蛋白酶是存在於木瓜果實中的一種半胱氨酸蛋白酶，由212個胺基酸殘基組成，並含有3對二硫鍵。它的三維結構是由兩個不同的結構域所組成，兩個結構域之間形成一個縫隙；縫隙內含有酶的活性位點，包括一個與胰凝乳蛋白酶中所含的相似的催化三聯體。木瓜蛋白酶中的催化三聯體由25位的半胱氨酸(Cys-2Q、159位的組氨酸(His_159) 和158位的天冬醯胺(Asn-158)這三個胺基酸所組成。木瓜蛋白酶的剪切肽鍵的機制包括 在His-159作用下Cys-25去質子化，而Asn-158能夠幫助His_159的咪唑環的擺放，使得去質子化可以發生；然後Cys-25親核攻擊肽主鏈上的羰基碳，並與之共價連接形成醯基-酶中間體；接著酶與一個水分子作用，發生去醯基化，並釋放肽鏈的羰基末端。值得注意的是酶解劑應控制其微生物限度和內毒素，以控制生物指標，目前國內的木瓜蛋白酶基本為食品級，在醫藥行業使用往往需要控制其內毒素和微生物，直接出售的木瓜蛋白酶很難符合藥用標準，所以在使用時必要的純化工藝是必須的，以往的公開的文獻中，木瓜蛋白酶的製備方法一般是烘乾，噴霧乾燥與凍幹，只有簡單的純化工序，這種缺點是1.生產環境與作業方式決定了細菌不能被有效控制。2.菌落數超標後採用鈷60輻照的方式進行滅菌，但會帶來內毒素的升高，同時酶解力會下降。3.生產工藝中對內毒素不做控制。
發明內容
本發明的目的是提高一種木瓜蛋白酶的純化方法，以克服木瓜蛋白酶原生產工藝方法中的不足，本方法純化所得的木瓜蛋白酶雜質含量少，尤其是木瓜蛋白酶中的內毒素和細菌含量明顯減少。為實現本發明的目的，本發明所採用的技術方案是一種木瓜蛋白酶的純化方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)將木瓜蛋白酶溶解於水中，攪拌至溶解完全後，加入活性炭和硅藻土，充分攪拌後，進行脫碳循環至木瓜蛋白酶溶液澄清；(2)使用濾芯進行除菌過濾。在本發明的一優選實施例中步驟(1)中，所述水是注射用水，其用量是木瓜蛋白酶重量的25-35倍。在本發明的一優選實施例中步驟(1)中，所述活性炭是針用活性炭，其用量是木瓜蛋白酶重量的30-40倍。在本發明的一優選實施例中步驟(1)中，硅藻土的用量是木瓜蛋白酶重量的30-40 倍。在本發明的一優選實施例中步驟(1)中，用鈦棒進行脫碳循環。在本發明的一優選實施例中步驟O)中，所述濾芯為0. 45+0. 22 μ m。本發明的純化方法將木瓜蛋白酶預溶於注射用水中，進行活性炭吸附，硅藻土助濾後再經濾芯進行過濾所得的木瓜蛋白酶雜質含量少，尤其是木瓜蛋白酶中的內毒素和細菌含量明顯減少，酶活力高。
具體實施例方式通過下面給出的本發明的具體實施例可以進一步清楚地了解本發明，但它們不是對本發明的限定。實施例1將3kg木瓜蛋白酶溶解於90kg注射用水中，攪拌30分鐘至溶解完全後，加入135g 針用活性炭，135g硅藻土，充分攪拌2小時後，用單芯10 μ m鈦棒進行脫碳循環至藥液澄清， 使用0. 45 μ m+0. 22 μ m濾芯進行除菌過濾，過濾結束後，將木瓜蛋白酶過濾液進行真空低溫乾燥後送檢，檢驗項目為細菌內毒素，無菌，酶活力。 將實施例1重複做3次，得到三批樣品，對其進行細菌內毒素，無菌，酶活力的檢測結果見表1
表 1
權利要求
1.一種木瓜蛋白酶的純化方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)將木瓜蛋白酶溶解於水中，攪拌至溶解完全後，加入活性炭和硅藻土，充分攪拌後， 進行脫碳循環至木瓜蛋白酶溶液澄清；(2)使用濾芯進行除菌過濾。
2.根據權利要求1所述的木瓜蛋白酶的純化方法，其特徵在於，步驟(1)中，所述水是注射用水，其用量是木瓜蛋白酶重量的25-35倍。
3.根據權利要求1所述的木瓜蛋白酶的純化方法，其特徵在於，步驟(1)中，所述活性炭是針用活性炭，其用量是木瓜蛋白酶重量的30-40倍。
4.根據權利要求1所述的木瓜蛋白酶的純化方法，其特徵在於，步驟(1)中，硅藻土的用量是木瓜蛋白酶重量的30-40倍。
5.根據權利要求1所述的木瓜蛋白酶的純化方法，其特徵在於，步驟(1)中，用鈦棒進行脫碳循環。
6.根據權利要求1所述的木瓜蛋白酶的純化方法，其特徵在於，步驟O)中，所述濾芯為 0. 45+0. 22 μ m。
全文摘要
本發明涉及一種木瓜蛋白酶的純化方法，首先，將木瓜蛋白酶溶解於水中，攪拌至溶解完全後，加入活性炭和硅藻土，充分攪拌後，進行脫碳循環至藥液澄清，然後用濾芯進行除菌過濾。本方法純化所得的木瓜酶的純度和活力較高，內毒素和細菌含量都得到了有效的控制。
文檔編號C12N9/50GK102392009SQ20111038557
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月28日 優先權日2011年11月28日
發明者汪洋, 錢正祥, 馬賢鵬 申請人:上海景峰製藥有限公司