一種豬支原體肺炎滅活疫苗及其製備方法
2023-05-03 14:48:31
專利名稱:一種豬支原體肺炎滅活疫苗及其製備方法
技術領域:
本發明屬於獸醫生物新醫藥技術領域,涉及一種豬支原體肺炎滅活疫苗及其製備方法。
背景技術:
豬支原體肺炎,又稱豬喘氣病或豬地方流行性肺炎,是由豬肺炎支原體引起的一種接觸性慢性呼吸道傳染病。患病豬的主要臨床症狀為咳嗽和氣喘,體溫基本正常,生長遲緩,飼料轉化率低。剖檢時,以肺部病變為主,尤以兩肺心葉,中間葉和尖葉出現胰樣變和肉樣變為其特徵。該病存在於世界各地,其死亡率雖然不高,但由於流行的廣泛性、長期性和消耗性,可使飼料轉化率降低,並引起豬的多種並發病,是造成養豬業經濟損失的最重要的疾病之一。目前,該病的控制有改善飼養條件、藥物治療和疫苗免疫3種方式。改善飼養條件和藥物治療都不能根除該病的發生,且抗生素治療存在耐藥性問題,疫苗免疫是首選、有效的控制方式。國內自主研發的疫苗只有弱毒活疫苗,包括中國獸醫藥品監察所研製的兔肺凍幹苗、乳兔肌肉凍幹苗及雞胚卵黃囊凍幹苗,南京天邦和江蘇省農科院共同研製的豬支原體肺炎168株活疫苗。弱毒活疫苗由於需要胸腔接種,所以不易於推廣普及;國外已有多家獸藥公司研發生產了豬支原體肺炎滅活疫苗,如梅裡亞有限公司、美國先靈葆雅動物保健公司和美國富道公司等,均通過肌肉注射進行接種,易於操作,但其價格較高。
發明內容
本發明的目的在於提供一種豬支原體肺炎滅活疫苗,該疫苗免疫效果顯著,能夠有效預防豬肺炎支原體疾病發生,填補了國內自主研發豬支原體滅活疫苗空白,解決了弱毒活疫苗操作複雜、不易推廣的問題。本發明的另一目的是提供該豬支原體肺炎滅活疫苗的製備方法。本發明的目的是通過如下技術方案實現的:本發明提供一種豬支原體肺炎滅活疫苗,該疫苗所用的菌種為豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae) DJ-166株,菌種的保藏號為CGMCC N0.4545,上述菌種經滅活後作為水相,佐劑作為油相,水相與油相按配比乳化而成。其中,所述的佐劑為礦物油佐劑。進一步,礦物油佐劑為白油、206佐劑、50V佐劑(即MontanideISA 50V佐劑)中的任一種。本發明的豬支原體肺炎滅活疫苗中水相與油相按1:1 1: 3體積配比進行乳化。進一步, 水相與油相按1:1體積配比進行乳化。本發明製備的疫苗每頭份疫苗抗原含量不小於lOOug。進一步,每頭份疫苗抗原含量為100 500ug。
更進一步,每頭份疫苗抗原含量為300ug。本發明免疫接種方式為每頭豬I次肌肉注射2.0毫升,免疫期為6個月;種豬群
每半年重複接種一次。本發明還提供了該豬支原體肺炎滅活疫苗的製備方法,其製備步驟如下:(1)製備豬肺炎支原體DJ-166株菌液,培養至菌液pH值降至6.5 7.0 ;A.菌液培養按培養基量的8% 10%接種菌液,置37±1°C培養5 9日,待培養基顏色變黃、呈輕度渾濁,pH值降至6.50 7.00之間收穫菌液。B.純粹檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行純粹檢驗,應純粹。C.CCU 測定將收穫菌液接種液體培養基,並進行10倍系列稀釋至10_12,置37± 1°C培養14日,活菌滴度應≥108CCU/mL。(2)將步驟(1)得到的菌液進行濃縮、純化,並進行滅活;A.濃縮、純化將菌液以10000r/min離心30分鐘,棄掉上清液,沉澱菌體用PBS(pH7.2 7.4)緩衝液懸浮,配製成為原培養物體積1/100菌懸液,-40°C保存。B.滅活經濃縮的菌液加入1.0%的硫柳汞溶液使其終濃度為0.01 %,混合均勻,2 8°C放置12 24小時,期間振搖1 3次,然後在冰水浴上超聲波裂解4 6次,每次I分鐘,功率250 300W,超聲5 8秒,間歇5 8秒。(3)將滅活後的菌液進行半成品檢驗,包括:無菌檢驗,滅活檢驗和蛋白濃度測定;A.滅活檢驗取5.0ml滅活菌液接種於45ml液體培養基,置37°C培養14日,觀察培養基顏色變化。同時設未滅活菌液為陽性對照,液體培養基為陰性對照。培養5 7日,取出0.2ml接種固體培養基,置5% CO2環境,37°C培養10日。液體培養基應無顏色變化,固體培養基上應無菌落生長為滅活完全。B.無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗,應無細菌、黴菌生長。C.蛋白濃度測定用紫外分光光度計檢測樣品在260nm和280nm波長下的吸收值,計算:蛋白濃度(mg/mL) = 1.45 X OD280-0.74X OD260, OD260/OD280 < 1.4。(4)將步驟(3)得到的滅活後的菌液與佐劑按比例配比乳化,得到豬支原體肺炎滅活疫苗。A.水相製備將滅活菌液用PBS (pH7.2 7.4)緩衝液稀釋,每頭份疫苗蛋白抗原含量應不低於100 μ gB.油相製備
將礦物油佐劑裝入滅菌瓶內,在121°C滅菌30分鐘,冷卻後備用。C.乳化將水相與油相按1:1 1: 3的體積比配比乳化。先將油相加入剪切機內,在低速攪拌的同時緩緩加入水相後,以lOOOOr/min攪拌5 8分鐘,即成乳白色油乳劑滅活疫苗。
有益效果:本發明的疫苗採用I次單劑量2.0ml肌肉注射,操作簡便;該疫苗所用菌種免疫原性好,免疫持續期可達6個月,能夠有效預防豬肺炎支原體疾病發生。本發明疫苗解決了國內弱毒活疫苗操作複雜、不易推廣的問題,填補了國內自主研發豬支原體肺炎滅活疫苗的空白。本發明疫苗所用的菌種豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)DJ-166株為申請人從山西養豬場35日齡二元雜交病豬肺臟組織分離得到,其免疫原性好。本發明的豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株申請人已於2011年01月19日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號,中國科學院微生物研究所,簡稱CGMCC,保藏編號為=CGMCC N0.4545。
圖1抗體消長曲線圖
具體實施例方式實施例1豬支原體肺炎滅活疫苗的製備(I)菌(CGMCC N0.4545)液製備A.菌液培養按培養基量10%比例接種豬肺炎支原體CGMCC N0.4545菌液,置37土 1°C培養5日,培養基顏色變黃、呈輕度渾濁,PH值降至7.00收穫菌液。B.純粹檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行純粹檢驗,應純粹。C.CCU 測定取收穫的菌液接種液體培養基,並進行10倍系列稀釋至10_1(1,置37±1°C培養14日,活菌滴度為101QCCU/ml。D.濃縮、純化將菌液以10000r/min離心30分鐘,棄掉上清液,沉澱菌體用PBS(pH7.2 7.4)緩衝液懸浮,配製成為原培養物體積1/100菌懸液,-40°C保存。E.滅活經濃縮的菌液加入1.0%的硫柳汞溶液使其終濃度為0.01 %,混合均勻,2 8°C放置12小時,期間振搖I次,然後在冰水浴上超聲波裂解4次,每次I分鐘(功率250 300W,超聲5秒,間歇5秒)。(2)半成品檢驗A.滅活檢驗取5.0ml滅活菌液接種於45ml液體培養基,置37°C培養14日,觀察培養基顏色變化。同時設未滅活菌液為陽性對照,液體培養基為陰性對照。培養5 7日,取出0.2ml接種固體培養基,置5% CO2環境,37°C培養10日。液體培養基應無顏色變化,固體培養基上應無菌落生長為滅活完全。B.無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗,無細菌、黴菌生長。C.蛋白濃度測定用紫外分光光度計檢測樣品在260nm和280nm波長下的吸收值,計算:蛋白濃度(mg/mL) = 1.45 X OD280-0.74X OD260, OD260/OD280 < 1.4。(3)油乳 劑滅活疫苗的配製A.水相製備將滅活菌液用PBS (pH7.2 7.4)緩衝液稀釋至蛋白濃度300 μ g/ml。B.油相製備將注射用白油裝入滅菌瓶內,在121°C滅菌30分鐘,冷卻後備用。C.乳化將水相成分與油相成分按1:1的體積比配比乳化。先將油相加入剪切機內,在低速攪拌的同時緩緩加入水相後,以lOOOOr/min攪拌5 8分鐘,即成乳白色油乳劑滅活疫苗。實施例2豬支原體肺炎滅活疫苗的製備(I)菌液製備A.菌液培養按培養基量的8%接種豬肺炎支原體CGMCC N0.4545菌液,置37± 1°C培養9日,待培養基顏色變黃、呈輕度渾濁,PH值降至6.50收穫菌液。B.純粹檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行純粹檢驗,應純粹。C.CCU 測定取收穫的菌液接種液體培養基,並進行10倍系列稀釋至10_1(1,置37±1°C培養14日,活菌滴度為101QCCU/ml。D.濃縮將菌液以10000r/min離心30分鐘,棄掉上清液,沉澱菌體用PBS(pH7.2 7.4)緩衝液懸浮,配製成為原培養物體積1/100的菌懸液,-40°c保存。E.滅活經濃縮、純化的菌液加入1.0 %的硫柳汞溶液使其終濃度為0.01%,混合均勻,2 8°C放置24小時,期間振搖3次,然後在冰水浴上超聲波裂解6次,每次I分鐘(功率250 300W,超聲8秒,間歇8秒)。(2)半成品檢驗A.滅活檢驗取5.0ml滅活菌液接種於45ml液體培養基,置37°C培養14日,觀察培養基顏色變化。同時設未滅活菌液為陽性對照,液體培養基為陰性對照。培養5 7日,取出0.2ml接種固體培養基,置5% CO2環境,37°C培養10日。液體培養基應無顏色變化,固體培養基上應無菌落生長為滅活完全。B.無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗,應無細菌、黴菌生長。C.蛋白濃度測定用紫外分光光度計檢測樣品在260nm和280nm波長下的吸收值,計算:蛋白濃度(mg/ml) = 1.45 X OD280-0.74X OD260, OD260/OD280 < 1.4。(3)油乳劑滅活疫苗的配製A.水相製備將滅活菌液用PBS(pH7.2 7.4)緩衝液稀釋至蛋白濃度750 μ g/ml。B.油相製備將50V佐劑裝入滅菌瓶內,在121°C滅菌30分鐘,冷卻後備用。C.乳化 將水相成分與油相成分按1: 2的體積比配比乳化。先將油相加入剪切機內,在低速攪拌的同時緩緩加入水相後,以lOOOOr/min攪拌5 8分鐘,即成乳白色油乳劑滅活疫苗。實施例3豬支原體肺炎滅活疫苗製備(I)制苗用囷液製備A.菌液培養按培養基量的9%接種豬肺炎支原體CGMCC N0.4545菌液,置37±1°C培養7日,培養基顏色變黃、呈輕度渾濁,PH值降至6.82收穫菌液。B.純粹檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行純粹檢驗,應純粹。C.CCU 測定取收穫的菌液接種液體培養基,並進行10倍系列稀釋至10_1Q,置37±1°C培養14日,活菌滴度為10nCCU/ml。D.濃縮將菌液以10000r/min離心30分鐘,去掉上清液,沉澱菌體用PBS(pH7.2 7.4)緩衝液懸浮,配製成為原培養物體積1/100菌懸液,-40°C保存。E.滅活經濃縮的菌液加入1.0%的硫柳汞溶液使其終濃度為0.01 %,混合均勻,2 8°C放置18小時,期間振搖2次,然後在冰水浴上超聲波裂解5次,每次I分鐘(功率250 300W,超聲6秒,間歇6秒)。(2)半成品檢驗A.滅活檢驗取5.0ml滅活菌液接種於45ml液體培養基,置37°C培養14日,觀察培養基顏色變化。同時設未滅活菌液為陽性對照,液體培養基為陰性對照。培養5 7日,取出0.2ml接種固體培養基,置5% CO2環境,37°C培養10日。液體培養基應無顏色變化,固體培養基上應無菌落生長為滅活完全。B.無菌檢驗
按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗,無細菌、黴菌生長。C.蛋白濃度測定用紫外分光光度計檢測樣品在260nm和280nm波長下的吸收值,計算:蛋白濃度(mg/ml) = 1.45 X OD280-0.74X OD260, OD260/OD280 20101005 (實施例2製備)和20101106(實施例3製備),進行性狀檢驗、無菌檢驗、安全性檢驗、效力檢驗和硫柳萊殘
留量檢驗。(I)性狀檢驗疫苗外觀為油包水(0/W)型乳白色乳劑,久置後上層有少量油質,振搖後呈均勻乳狀液。以3000r/min離心15分鐘,管底部無水相析出,疫苗穩定性良好。(2)無菌檢驗製備的3批疫苗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗,均無細菌、黴菌生長。(3)安全性檢驗A.小白鼠安全性試驗製備的3批疫苗分別皮下注射18 22g小白鼠各8隻,每隻0.5ml,同時設對照組小白鼠8隻,每隻皮下注射生理鹽水0.5ml, 14日觀察期內,小白鼠均全部健活,疫苗對非靶動物小白鼠使用安全。結果見表I。表I 3批疫苗注射小白鼠安全性試驗
權利要求
1.一種豬支原體肺炎滅活疫苗,其特徵在於菌種為豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)DJ-166株,菌種的保藏號為CGMCCN0.4545,上述菌種經滅活後作為水相,佐劑作為油相,水相與油相按配比乳化而成。
2.權I所述的豬支原體肺炎滅活疫苗,其特徵在於所述的佐劑為礦物油佐劑。
3.權2所述的豬支原體肺炎滅活疫苗,其特徵在於所述的礦物油佐劑為白油、206佐劑、50V佐劑中的任一種。
4.權I所述的豬支原體肺炎滅活疫苗,其特徵在於水相與油相按1:1 1: 3體積配比進行乳化。
5.權4所述的豬支原體肺炎滅活疫苗,其特徵在於水相與油相按1:1體積配比進行乳化。
6.權I所述的豬支原體肺炎滅活疫苗,其特徵在於每頭份疫苗抗原含量不小於lOOug。
7.權6所述的豬支原體肺炎滅活疫苗,其特徵在於每頭份疫苗抗原含量為100 500ugo
8.權7所述的豬支原體肺炎滅活疫苗,其特徵在於每頭份疫苗抗原含量為300ug。
9.一種如權利要求1-8任一項所述的豬支原體肺炎滅活疫苗的製備方法,其特徵在於步驟如下: (1)製備豬肺炎支原體DJ-16 6株菌液,培養至菌液pH值降至6.5 7.0 ; (2)將步驟(I)得到的菌液進行濃縮、純化,並進行滅活; (3)將滅活後的菌液進行半成品檢驗,包括:無菌檢驗,滅活檢驗和蛋白濃度測定; (4)將步驟(3)得到的滅活後的菌液與佐劑按比例配比乳化,得到豬支原體肺炎滅活疫苗。
10.權9所述的製備方法,其特徵在於,滅活方式為濃縮、純化後的抗原加入終濃度0.01 %硫柳汞溶液,混勻後2 8°C放置12 24小時,期間振搖I 3次,然後在冰水浴上超聲波裂解4 6次,每次I分鐘,功率250 300W,超聲5 8秒,間歇5 8秒。
全文摘要
本發明屬於獸醫生物新醫藥技術領域,涉及一種豬支原體肺炎滅活疫苗及其製備方法。該疫苗所用菌種免疫原性好,採用1次單劑量2.0ml肌肉注射,免疫持續期可達6個月,能夠有效預防豬肺炎支原體疾病發生。本發明解決了國內弱毒活疫苗操作複雜不易推廣的問題,填補了國內自主研發豬支原體肺炎滅活疫苗的空白。
文檔編號A61K39/02GK103182076SQ20111045215
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者車豔傑, 王海燕, 張鋒, 王勇鶼, 閆國暉, 高玉梅, 石松, 高潔, 趙亞榮 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 福州大北農生物技術有限公司