一種木瓜蛋白酶的精製方法

2023-05-03 14:48:26

專利名稱:一種木瓜蛋白酶的精製方法
技術領域：
本發明涉及酶的精製，具體地說，本發明涉及一種木瓜蛋白酶的精製方法。
技術背景
木瓜蛋白酶(Papain)簡稱木瓜酶，又稱為木瓜酵素，是利用未成熟的番木瓜果實 中的乳汁，採用現代生物工程技術提煉而成的純天然生物酶製品。它是一種含疏基(-SH) 肽鏈內切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對動植物蛋白、多肽、酯、醯胺 等有較強的水解能力，同時，還具有合成功能，能把蛋白水解物合成為類蛋白質。它所應用 的行業領域比較廣泛，包括醫藥工業、食品工業、美容化妝品工業、飼料工業、皮革工業、紡 織工業等領域。由於木瓜蛋白酶涉及領域的廣泛，人們對它的認識越來越深刻，其應用價值 和領域也越來越大。現在國內已有一部分企業開始生產木瓜蛋白酶，但大部分產品仍屬於 粗加工產品，應用領域有限。
木瓜蛋白酶主要存在於未成熟番木瓜果實的乳汁中，它能有效地分解明膠、酪蛋 白、谷蛋白、彈性蛋白、球蛋白和肌纖維蛋白等常用蛋白質，被廣泛應用於肉類嫩化、啤酒澄 清、明膠製造、蠶繭脫膠、皮革脫毛等工業，在醫療衛生方面用途更廣，但因番木瓜種植區主 要分布在經濟不發選地區.所以蛋白酶生產工藝相對落後，很多地區仍採用太陽暴曬的方 式生產木瓜蛋白酶。按此法生產的產品質量不穩定，多數產品達不到質量要求，因此，如何 改進生產工藝、提高產品質量已成為當前急需解決的課題。
木瓜蛋白酶的提取、提純方法很多，其分離提取方法主要有親和層析分離法、超 濾膜分離法、沉澱分離法、萃取分離法以及絮凝法等。如CN1908164公開了一種木瓜蛋白 酶的製備方法，包括離心、微濾、三級超濾；CN1944640也公開了一種木瓜蛋白酶的物理提 取方法，它包括以下步驟木瓜漿、冷凍、預處理、粗過濾、精過濾、兩級超濾，採用超濾技術 純化木瓜蛋白酶，操作條件溫和，不易引起生化物質破壞，但由於木瓜蛋白酶屬於大分子物 質，在超濾過程中會在膜表面聚積而產生濃差極化現象，使超濾速率逐漸下降，且存在有機 溶劑的殘留等問題；公開號為CN 1597946A的專利申請公開了一種木瓜蛋白酶的製備方 法，它採用鹽析法進行粗酶及精酶製備，精酶活力200萬單位/克，採用鹽析法提取的木瓜 蛋白酶活性較低，與藥用要求相差較遠，且由於用了大量的鹽，使酶中灰分增加，同時降低 了每克木瓜蛋白酶活性，利用有機溶劑提取木瓜蛋白酶，程序複雜，提取率較低，存在有機 溶劑的殘留等問題；絮凝法提取專一性不強，製得的木瓜蛋白酶純度不高，雜質含量較高。 親和層析分離法提取的木瓜蛋白酶雖然純度較高，但操作複雜，不易工業上的放大生產，且 用於親和層析的前處理液需是經過初步純化的酶液。
上述提取方法大多需經過各種分級沉澱、鹽析、結晶、洗滌、層析等過程，這些方法 提取成本高，產量低，操作較繁瑣，而且經割採乳汁後的番木瓜果實未能得到充分的利用， 從而造成浪費。
發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明者在生產工藝上作了改進，改變了傳統的加工 工藝，設計出了一種木瓜蛋白酶的精製方法，該方法工藝簡單、生產成本低、產量高。
本發明的目的在於提供所述一種木瓜蛋白酶的精製方法。
根據本發明提供的一種木瓜蛋白酶的精製方法，所述方法包括以下步驟
1)碾磨將木瓜漿倒入膠體磨中，充分磨碎，得到木瓜酶料液；
2)離心通過不斷連續分離，得到得到澄清的木瓜酶料理；
3)超濾去除小分子量雜質和水，濃縮料液，體積比為4 6 1 ；
4)乾燥抽真空，在-30°C冷凍3小時，再緩慢加熱至30°C，得木瓜蛋白酶乾燥固體。
根據本發明所述的精製方法，在所述離心步驟中，採用碟式離心機或管式離心機。
根據本發明所述的精製方法，離心速率為3000_5000rpm。
根據本發明所述的精製方法，在所述超濾步驟前進行微濾。
根據本發明所述的精製方法，在所述超濾步驟中，採用截留分子量為8000-16000 的超濾膜組件。
本發明對木瓜蛋白酶的生產工藝進行了突破性的改進，不僅有效降低了生產成 本，而且大幅度提升了產品的質量，在酶的活性、純度、溶解性、有效成分保護技術等方面有 著出色的表現，與市場現有的木瓜蛋白酶產品比較，具有如下特點
1、通過膠體磨的磨碎作用將木瓜酶儘量溶解到料液中，利於後續提取。
2、通過超濾膜組件可去除微生物和小分子雜質，保證產品質量；濃縮料液體積比 為4 6 1，增加物料比重，降低乾燥成本。
3、採用真空冷凍乾燥，通過物料中的水變成冰時直接升華被排走，保證酶在乾燥 過程中在低溫條件下進行，減少烘乾過程中的酶質量的損失和酶質量的降低。
4、採用本發明精製方法得到的木瓜蛋白酶純度高、活力高(最高活力達到300萬 u/g)、熱穩定性好，外觀、理化、微生物限度等指標均達到或超過國內外相關食品藥品標準， 且該方法工藝簡單、生產成本低，產量高，可工業化生產。
具體實施方式
以下用實施例對本發明作更詳細的描述。這些實施例僅僅是對本發明最佳實施方 式的描述，並不對本發明的範圍有任何限制。
實施例1
將木瓜漿倒入膠體磨中，充分磨碎，得到木瓜酶料液；木瓜酶料液通過板式換熱器 迅速降低溫度至12°C，並且在此後的提取分離過程通過冷水循環系統維持料液在這個溫 度範圍；木瓜酶料液通過碟式離心機的不斷連續分離，離心速率為3000rpm，得到澄清的木 瓜酶澄清料液；木瓜酶澄清料液通過截留分子量為10000的超濾膜組件去除小分子量雜質 和水，濃縮料液，體積比為5 1 ；將木瓜蛋白酶濃縮液放入真空冷凍乾燥機或超低溫冰箱 (冷庫)中速凍至溫度為-30°C，開始抽真空，繼續維持製冷3小時，再將製冷變為加熱，緩 慢加熱使料液溫度上升至30°C時即得木瓜蛋白酶乾燥固體。
木瓜蛋白酶乾燥固體經過粉碎、添加輔料、混勻後就可以包裝成不同規格的成品。
實施例2[0027]將木瓜漿倒入膠體磨中，充分磨碎，得到木瓜酶料液；木瓜酶料液通過板式換熱器 迅速降低溫度至12°C，並且在此後的提取分離過程通過冷水循環系統維持料液在這個溫度 範圍；木瓜酶料液通過管式離心機的不斷連續分離，離心速率為4500rpm，得到澄清的木瓜 酶澄清料液木瓜酶澄清料液通過微濾膜組件去除微生物和大分子量雜質，再通過截留分 子量為15000的超濾膜組件去除小分子量雜質和水，濃縮料液，體積比為4. 5 1 ；將木瓜 蛋白酶濃縮液放入真空冷凍乾燥機或超低溫冰箱(冷庫)中速凍至溫度為-30°C，開始抽真 空，繼續維持製冷3小時，將製冷變為加熱，緩慢加熱使料液溫度上升至30°C時即得木瓜蛋 白酶乾燥固體。
木瓜蛋白酶乾燥固體經過粉碎、添加輔料、混勻後就可以包裝成不同規格的成品。
實施例3
將木瓜漿倒入膠體磨中，充分磨碎，得到木瓜酶料液；木瓜酶料液通過板式換熱器 迅速降低溫度至12°C，並且在此後的提取分離過程通過冷水循環系統維持料液在這個溫 度範圍；木瓜酶料液通過管式離心機的不斷連續分離，離心速率為5000rpm，得到澄清的木 瓜酶澄清料液；木瓜酶澄清料液通過截留分子量為13000的超濾膜組件去除小分子量雜質 和水，濃縮料液，體積比為6 1 ；將木瓜蛋白酶濃縮液放入真空冷凍乾燥機或超低溫冰箱 (冷庫)中速凍至溫度為-30°C，開始抽真空，繼續維持製冷3小時，再將製冷變為加熱，緩 慢加熱使料液溫度上升至30°C時即得木瓜蛋白酶乾燥固體。木瓜蛋白酶乾燥固體經過粉 碎、添加輔料、混勻後就可以包裝成不同規格的成品。
試驗例
1、木瓜蛋白酶酶活力的測定
在每支試管中加入250酪蛋白(1.0mg/ml)，37°C保溫lOmin，各試管中加入適量的 實施例1得到的木瓜蛋白酶，37°C精確保溫lOmin，之後加入5ml考馬斯亮藍溶液(IOOmg 考馬斯亮藍，50ml 95%乙醇，IOOml 85%磷酸，定容至IOOOml)，混勻，室溫放置20min，測 595nm的光吸收，對照蛋白濃度標準曲線查出相應的蛋白濃度，並計算酶活力平均值為290 萬u/g。一個酶活力單位定義為37°C，Imin內水解Img酪蛋白所需酶量。
2、測量木瓜蛋白酶純度
FPLC中的離子交換層析可計算木瓜蛋白酶的純度。25ul的純化木瓜蛋白酶05G 蛋白)在PH為10. 6的20ml甘氨酸-氫氧化鈉緩衝區緩衝，木瓜蛋白酶和其他蛋白隨後洗 脫後，使用編程線性梯度氯化鈉從O至0. 5米(總量約2細1)在液相色譜中的流速為1. Oml/ min。記錄色譜小塊A280和梯度組成與洗脫量，計算得出蛋白酶純度為99. 69%。
本發明對木瓜蛋白酶的生產工藝進行了突破性的改進，不僅有效降低了生產成 本，而且大幅度提升了產品的質量，在酶的活性、純度、溶解性、有效成分保護技術等方面有 著出色的表現，採用本發明精製方法得到的木瓜蛋白酶純度高、活力高(最高活力達到300 萬u/g)、熱穩定性好，外觀、理化、微生物限度等指標均達到或超過國內外相關食品藥品標 準，且該方法工藝簡單、生產成本低，產量高，可工業化生產。
權利要求
1.一種木瓜蛋白酶的精製方法，其特徵在於，所述精製方法包括以下步驟1)碾磨將木瓜漿倒入膠體磨中，充分磨碎，得到木瓜酶料液；2)離心通過不斷連續分離，得到澄清的木瓜酶料理；3)超濾去除小分子量雜質和水，濃縮料液，體積比為4 6 1 ；4)乾燥抽真空，在-30°C冷凍3小時，再緩慢加熱至30°C，得木瓜蛋白酶乾燥固體。
2.根據權利要求
1所述的精製方法，其特徵在於，在所述離心步驟中，採用碟式離心機 或管式離心機。
3.根據權利要求
1或2所述的精製方法，其特徵在於，離心速率為3000-5000rpm。
4.根據權利要求
1所述的精製方法，其特徵在於，在所述超濾步驟前進行微濾。
5.根據權利要求
1所述的精製方法，其特徵在於，在所述超濾步驟中，採用截留分子量 為8000-16000的超濾膜組件。
專利摘要
本發明提供了一種木瓜蛋白酶的精製方法。所述方法包括以下步驟1)碾磨；2)離心；3)超濾；4)乾燥。採用本發明精製方法得到的木瓜蛋白酶純度高、活力高(最高活力達到300萬u/g)、熱穩定性好，外觀、理化、微生物限度等指標均達到或超過國內外相關食品藥品標準，且該方法工藝簡單、生產成本低，產量高，可工業化生產。
文檔編號C12N9/50GKCN102108349SQ200910200750
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月25日
發明者羌利民 申請人:南通遠大生物科技發展有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan