一種高效製備紫杉醇的方法

2023-05-04 00:40:11

專利名稱：一種高效製備紫杉醇的方法
技術領域：
本發明涉及一種高效製備紫杉醇的方法，特別涉及一種鮮法勻漿高效製備紫杉醇的方法。
背景技術：
紫杉醇(paclitaxel)是從紅豆杉屬植物中提取的一種具有高效抗癌活性的二萜類化合物。1977年被確定為抗癌的候選藥物開始作臨床實驗，隨後發現紫杉醇對多種人體腫瘤有很強的活性。1979年Schiff和Horwitz(J Natural Prod.，1979，277，665-667)闡明了紫杉醇的獨特藥理作用機制後引起了科學家們極大興趣。經過毒理研究和多期臨床試驗，1992年12月29日，美國食品藥品管理局(FDA)批准紫杉醇上市，商品名為Taxol。
紫杉醇的來源主要有以下幾個途徑(1)全合成，1994年獲得成功，合成過程需20-30步，總收率低，費用高，只有理論意義，目前尚無商業開發價值；(2)半合成，由枝葉提取巴卡亭III(BaccatinIII)、10-脫乙醯基巴卡亭III(10-deacetylbaccatinIII)，再半合成紫杉醇，現已實現商業化生產。
(3)植物細胞培養法紅豆杉培養與次生代謝產物合成屬於非生長偶聯型，因此可採用兩段培養法，同時進行營養調控、環境控制、前體飼餵、誘導子調控、兩相培養、原位、固定化等等方法來提高紫杉醇的產量。
目前利用細胞大量培養技術生產紫杉醇研究已經進入到生物反應器放大階段，我國也把紅豆杉細胞大量培養研究列入國家「九五」研究計劃。美國某公司已經完成4000L的培養技術，正在進行20000L規模的工業放大研究。
(4)微生物培養，目前取得了一定進展，但表達量仍偏低，近期不可能商業化生產。
(5)從天然紅豆杉植物中提取紫杉醇，但由於大量砍伐，野生紅豆杉數量銳減，急需人工栽培；(6)紅豆杉人工栽培，現已進行廣泛種植，幾年後可望部分供應紫杉醇生產。
(7)尋找新的資源，最近，我國學者發現與紅豆杉科相近緣的三尖杉科植物西雙版納粗榧(Cephalotaxus manii)中也含紫杉醇，但含量較低，在高山三尖杉(C.fortunei)和海南粗榧(C.haina-nensis)和羅漢松科植物大理羅漢松(Podocarpus)莖葉中發現了紫杉醇的類似物巴卡亭(baccatin)。周榮漢等發現我國特有植物白豆杉屬(Pseud-otaxus Cheng)白豆杉(P.chienii)中含有紫杉醇及短葉醇bre-vifoliol，。目前為止，紅豆杉科5個屬中有4個屬(紅豆杉屬、澳洲紅豆杉屬、白豆杉屬及榧屬)均有紫杉醇及其同系物。最近，美國俄勒岡州波特蘭大學的化學家安傑拉·霍夫曼在美國化學協會舉行的會議上宣布說，他們已經從榛樹和其真菌中分離出了紫杉醇。
儘管紫杉醇有以上的來源，但到目前為止，市售紫杉醇還主要是從天然和栽培紅豆杉的樹皮或枝葉中直接提取而得，對於來自植物體的物料在提取之前多採用的是低溫烘乾或自然風乾，研磨成粉末等預處理，再進行提取，組培的材料有些採取是凍幹打粉，直接用鮮物料提取的很少，只有Nair(usp.5,279,949，1994)和陳建民(專利號01131862.7，2003)的專利中用的是鮮物料，陳建民將鮮物料打成糊狀，之後才加入提取液，Nair(usp.5,478,736，1995)利用含有水的溶媒浸提未經乾燥的新鮮枝葉，可以使很多的蠟質、葉綠素和親脂性化合物留在材料中不被浸提出來，從而減少了浸提液中這些雜質的含量，同時避免了由於乾燥所造成的紫杉醇含量的降低和提取成本的升高，進而充分利用有限的資源。此外，在生產過程中，亦存在著原料的採集時間、地點、貯藏方式等幾方面均影響紫杉醇的含量，肖國勇等針對東北紅豆杉樹皮紫杉醇含量隨採集時間、儲存方式等預處理過程進行動態分析，發現以不同條件保管方式(置陰涼處乾燥；堆積放置；露天攤置)的紅豆杉樹皮中紫杉醇含量的改變非常大，以置陰涼處乾燥紫杉醇含量最佳。生長於背陰處的紅豆杉，其樹皮中紫杉醇含量明顯高於同一區域受光照充足的紅豆杉樹皮，採集於4月的紅豆杉樹皮中紫杉醇含量明顯高於採集於9月的樣含量品，紅豆杉樹皮在常溫避光條件下放置一年後，其紫杉醇含量明顯降低，而受不同日光照射的紅豆杉樹皮中紫杉醇含量無顯著差異。Nair(usp.5,478,736，1995)在其實驗觀察到將剪修下來的紅豆杉鮮枝葉放置在0-10℃環境條件下，紫杉醇的含量會明顯增加。但他們在提取時未能全面考慮這些影響因素，來提高紫杉醇的得率。
目前提取紫杉醇常用方法為滲漉浸提法，此法浸提時間長，提取率低，新發展了超聲萃取和超臨界流體萃取法，其中的超聲萃取可大大縮短初級萃取過程的時間，且萃取可在低溫下進行，從而避免了紫杉醇在高溫下轉化為其它物質而造成收率降低，但超聲萃取處理物料量有限，設備昂貴，尚難用於大型工業化生產。超臨界流體萃取是一種不汙染環境的新技術，在紫杉醇的提取中顯示出收率高、省時間等優點，但該方法對設備要求高，操作條件嚴格，目前還難以進行大量原料的超臨界萃取。祖元剛(專利申請號02132922.2；03210970.9，2003；03211143.6，2003)利用種芽提取喜樹鹼及10-羥基喜樹鹼過程中以超聲空化理論為基礎，提出了鮮法勻漿萃取、負壓空化混旋固液萃取和負壓空化混旋液液萃取理論及生產工藝並自行研究和設計了相應的設備，其設備具有操作簡單，快速，萃取效率高，極大地提高了物料中有效成分的提出率，具有普遍的適用性和適用於工業化生產的特點，但在應用於紫杉醇提取領域還尚屬空白。
綜上所述，在利用植物資源提取紫杉醇過程中除了現有的植物資源短缺外，一個主要的原因在於提取原料的利用率低下，提取工藝嚴重落後，原料的預處理和提取分離過程中普遍存在紫杉醇的降解或流失，尤其是結合態紫杉醇的大量丟失，前提化合物未加以利用，使得紫杉醇的得率偏低，成本升高，造成資源嚴重浪費。本發明旨在建立一種利用鮮物料通過生物半合成將物料中大量存在的前體化合物進一步轉化為紫杉醇，將結合態的紫杉醇轉變成游離態紫杉醇，通過空化強化提取，實現簡單而快速的高效製備紫杉醇。
本發明採用的技術方案鮮物料經預處理後，在一定溫度下進行勻漿空化生物半合成，得勻漿液再經負壓空化混旋生物半合成及負壓空化混旋兩相培養處理後，靜止分液，有機相濃縮至幹，水相過濾得水相濾液，濾渣加入提取溶媒進行負壓空化混旋固液萃取，合併空化混旋萃取液，經減壓濃縮後回收提取溶媒得濃縮液，濃縮液與有機相濃縮物及水相濾液合併，加入檸檬酸或食草動物的膽汁經負壓空化混旋處理，冷凍濃縮，濃縮物加入等體積甲醇，緩慢置入乙腈中，靜止，離心，得離心液，經活性炭靜止脫色，過濾得無色液體，用乙酸乙酯進行等體積萃取，萃取液水洗至中性，減壓濃幹。濃縮物用乙腈溶解，沉澱析出，過濾得析出物，為10-脫乙醯基巴卡亭III粗品，母液濃縮分別經氧化鋁柱層析和製備型高效液相層析及重結晶得紫杉醇晶體。

發明內容
將榛子、南方紅豆杉、東北紅豆杉、曼地亞紅豆杉、雲南紅豆杉等的鮮莖皮、根或枝葉在0～30℃條件下避光放置1～15天，經勻漿空化生物半合成，利用鮮物料自身所具有的豐富的紫杉醇前體與高效的生物酶體系，在生物半合成培養液中同時加入半合成前體或誘導子或混合糖原或其協同配伍，通過勻漿機刀片的高速切割與攪拌所產生的氣泡的瞬間崩解與潰滅時產生的空化效應、擾動效應，強化紫杉醇的生物半合成，勻漿空化生物半合成時間為3～30分鐘，溫度為20-29℃，料液比為1∶8～1∶15，勻漿空化生物半合成培養液可為水、pH值為4.0-5.8的磷酸緩衝液、B5培養液及B5培養液的改良配方。
將經勻漿空化生物半合成處理的物料轉入負壓空化罐中進行負壓空化混旋生物半合成，利用經勻漿粉碎後的鮮物料中自身所具有豐富的生物半合成前體和高效生物酶體系，同加入的半合成前體或誘導子或混合糖原或其協同配伍，通過負壓空化所產生氣泡的攪拌效應，空化效應、湍流效應來強化胞內及胞外紫杉醇的生成。負壓空化混旋生物半合成的溫度在20-29℃，培養時間2～5天，每間隔3～4小時空化一次，每次5～30分鐘，其餘時間在發酵罐中微混。在培養3-5天時加入有機相包括油酸、鄰苯二甲酸，體積分數為0.04～0.5，進行負壓空化兩相培養，通過負壓空化所產生氣泡的攪拌效應，空化效應、湍流效應加速紫杉醇進入有機相，從而降低水相中紫杉醇濃度，減少產物的反饋抑制和紫杉醇對自身細胞的毒害作用，進而加速紫杉醇進一步合成。其中的半合成前體可為醋酸鈉、苯丙氨酸、苯甲酸鈉等，最佳劑量均為0.08～0.2mmol/L。誘導子可為水楊酸、赤黴酸、硝酸銀、甲基茉莉酮酸、花生四烯酸及檸檬酸銨，茉莉酸甲酯。混合糖源為蔗糖與麥芽糖體積最佳配比為1∶2。協同配伍為半合成前體的兩種或兩種以上協同配伍；誘導子的兩種或兩種以上協同配伍；半合成前體和誘導子的協同配伍；混合糖原同半合成前體或/和誘導子的協同配伍；負壓空化其底部進氣的氣體類型包括空氣、氫氣、氧氣、二氧化碳和氮氣，通氣量為1-3m3/min。
兩相培養處理後，靜止分液，有機相濃縮至幹，水相過濾得水相濾液，濾渣加入50～95％乙醇、甲醇、丙酮；丙酮∶乙酸乙酯(體積比為1∶1)或乙醇∶水∶檸檬酸(體積比為80∶19∶1)等提取溶媒進行負壓空化混旋固液萃取，空化時間為10-30分鐘，通氣量為2-4m3/min，重複2-3次，料液比為1∶5-1∶20，合併空化混旋萃取液，經減壓濃縮後回收提取溶媒得濃縮液，濃縮液與有機相濃縮物及水相濾液合併，加入0.1～2％檸檬酸或10-50％食草動物的膽汁經負壓空化混旋處理，再經懸浮冷凍濃縮或降膜式漸進冷凍濃縮，濃縮物加入等體積甲醇，緩慢置入乙腈中，離心，得離心液，經活性炭靜止脫色，過濾得無色液體，用乙酸乙酯進行等體積萃取，萃取液水洗至中性，減壓濃幹。濃縮物用乙腈溶解，沉澱析出，過濾得10-脫乙醯基巴卡亭III粗品，母液濃縮分別經氧化鋁柱層析和製備型高效液相層析及重結晶得紫杉醇晶體。
實施例1取南方紅豆杉鮮枝葉20kg，在4℃條件下避光放置4天後，加入120kg的純淨水和4.236g的乙酸鈉在20-29℃條件下，在自製的勻漿機中勻漿空化生物半合成20分鐘，轉入自製的空化罐中，培養溫度同勻漿空化生物半合成，進行負壓空化混旋生物半合成，通入的氣體為空氣，通氣量為2m3/min，每間隔3小時空化一次，每次5分鐘，共培養3天，其餘時間在發酵罐中微混，在第1天、第2天分別加一次40kg的鄰苯二甲酸二丁酯，空化後靜止分層取出濃縮，回收有機相，3天後水相過濾得水相濾液，濾渣加入600kg的90％的乙醇空化6分鐘，通氣量為2.2m3/min，重複3次，合併空化混旋萃取液，經減壓濃縮後回收提取溶媒得濃縮液，濃縮液與有機相濃縮物及水相濾液合併，加入檸檬酸1.2kg負壓空化混旋處理30分鐘，冷凍濃縮，得濃縮物308g，加入300ml甲醇溶解，緩慢置入300ml乙腈中，離心，得離心液，經活性炭靜止脫色，過濾得無色液體950ml，用乙酸乙酯進行等體積萃取3次，萃取液水洗至中性，減壓濃幹。得濃縮物200g，用1.5L乙腈溶解，溶液在0-5℃下放置24h，10-脫乙醯基巴卡亭III沉澱析出，沉澱物再在二氯甲烷/己烷混合液中重結晶得到2.0g純度為98％白色粉末10-脫乙醯基巴卡亭III，母液濃縮，分別經氧化鋁柱層析和製備型高效液相層析及重結晶得純度為98％紫杉醇晶體0.7g。
實施例2取東北紅豆杉鮮枝葉20kg，在6℃條件下避光放置5天後，加入120kg的B5培養液、29.16g的檸檬酸銨和1.656g水楊酸在20-29℃條件下，在自製的勻漿機中勻漿空化生物半合成25分鐘，轉入自製的空化罐中，培養溫度同勻漿空化生物半合成，進行負壓空化混旋生物半合成，通入的氣體為氧氣，通氣量為2m3/min，每間隔3.5h空化一次，每次5分鐘，共培養5天，其餘時間在發酵罐中微混，在第1天-4天分別加一次20kg的油酸，空化後靜止分層取出油酸濃縮，回收有機相，5天後水相過濾得水相濾液，濾渣加入660kg的90％的乙醇空化10分鐘，通氣量為2.8m3/min，重複3次，合併空化混旋萃取液，經減壓濃縮後得濃縮液，濃縮液與有機相濃縮物及水相濾液合併，加入牛膽汁5kg負壓空化混旋處理30分鐘，冷凍濃縮，得濃縮物350g，加入320ml甲醇溶解，緩慢置入320ml乙腈中，離心，得離心液，經活性炭靜止脫色，過濾得無色液體950ml，用乙酸乙酯進行等體積萃取3次，萃取液水洗至中性，減壓濃幹。得濃縮物223g，用1.6L乙腈溶解，溶液在0-5℃下放置24h，10-脫乙醯基巴卡亭III沉澱析出，沉澱物再在二氯甲烷/己烷混合液中重結晶得到1.9g純度為98％白色粉末10-脫乙醯基巴卡亭III，母液濃縮，分別經氧化鋁柱層析和製備型高效液相層析及重結晶得純度為98％紫杉醇晶體0.8g。
實施例3取曼地亞紅豆杉鮮枝葉10kg，在4℃條件下避光放置5天後，加入80kg的pH為5.8的磷酸緩衝液、3.2g的β-苯丙氨酸在20-29℃條件下，在自製的勻漿機中勻漿空化生物半合成25分鐘，轉入自製的空化罐中，培養溫度同勻漿空化生物半合成，進行負壓空化混旋生物半合成，通入的氣體為空氣，通氣量為2m3/min，每間隔3.5h空化一次，每次5分鐘，共培養5天，其餘時間在發酵罐中微混，在第1天-4天分別加一次5kg的鄰苯二甲酸二丁酯和5kg油酸，其他同實施例2，得98％紫杉醇0.6g。
權利要求
1.一種高效製備紫杉醇的方法，其特徵是將鮮物料在一定溫度下進行勻漿空化生物半合成，得勻漿液再經負壓空化混旋生物半合成及負壓空化混旋兩相培養處理；靜止分液，有機相濃縮至幹，水相過濾得水相濾液，濾渣加入提取溶媒進行負壓空化混旋固液萃取；合併空化混旋萃取液，經減壓濃縮後回收提取溶媒得濃縮液，濃縮液與有機相濃縮物及水相濾液合併，加入檸檬酸或食草動物的膽汁經負壓空化混旋處理，冷凍濃縮；濃縮物加入等體積甲醇溶解，緩慢置入等體積乙腈中，離心，得離心液，經活性炭靜止脫色，過濾得無色液體，用乙酸乙酯進行等體積萃取，萃取液水洗至中性，減壓濃幹。濃縮物用乙腈溶解，沉澱析出，過濾得10-脫乙醯基巴卡亭III粗品，母液濃縮分別經氧化鋁柱層析和製備型高效液相層析及重結晶得紫杉醇晶體。
2.根據權利要求書1所述的鮮物料包括榛子、南方紅豆杉、東北紅豆杉、曼地亞紅豆杉、雲南紅豆杉等的莖皮、根或枝葉，並在0～30℃條件下避光放置1～15天。
3.根據權利要求書1所述的勻漿空化生物半合成其特徵是在生物半合成培養液中加入半合成前體或誘導子或混合糖原或其協同配伍，通過勻漿機刀片的高速切割與強力攪拌時所產生的負壓氣泡的瞬間崩解與潰滅時產生的空化效應、擾動效應作用，強化紫杉醇的生物半合成，其條件為溫度20-29℃，時間3～30分鐘，料液比1∶4～1∶15。
4.根據權利要求書3所述的生物半合成培養液其特徵是生物半合成培養液為水、pH值為4.0-5.8的磷酸緩衝液、B5培養液及其改良配方。
5.根據權利要求書1所述的負壓空化混旋生物半合成其特徵是利用外加入的半合成前體或誘導子或混合糖原或其協同配伍，通過負壓空化所產生氣泡的攪拌效應，空化效應、湍流效應來強化胞內及胞外紫杉醇的生成，其條件是培養溫度為20-29℃，時間2～5天，每間隔3～4小時空化一次，每次5～30分鐘，其餘時間在發酵罐中微混。
6.根據權利要求書3或5所述的半合成前體為醋酸鈉、苯丙氨酸、苯甲酸鈉。
7.根據權利要求書3或5所述誘導子為水楊酸、赤黴酸、硝酸銀、甲基茉莉酮酸、花生四烯酸及檸檬酸銨，茉莉酸甲酯。
8.根據權利要求書3或5所述混合糖源為蔗糖與麥芽糖。
9.根據權利要求書3或5所述協同配伍為半合成前體的兩種或兩種以上協同配伍；誘導子的兩種或兩種以上協同配伍；半合成前體和誘導子的協同配伍；混合糖原同半合成前體或/和誘導子的協同配伍。
10.根據權利要求書1所述的負壓空化兩相培養是通過負壓空化所產生氣泡的攪拌效應、空化效應、湍流效應加速紫杉醇進入包括油酸或鄰苯二甲酸為主的有機相，降低水相中紫杉醇濃度，減少產物的反饋抑制和紫杉醇對自身細胞的毒害作用，加速紫杉醇合成。且有機相在培養體系中的體積分數為0.04～0.5。
11.根據權利要求書5或10所述的負壓空化其底部進氣的氣體類型包括空氣、氫氣、氧氣、二氧化碳、氮氣，通氣量為1-3m3/min。
12.根據權利要求書1所述的提取溶媒可為50～95％乙醇、甲醇、丙酮；丙酮∶乙酸乙酯(體積比為1∶1)或乙醇∶水∶檸檬酸(體積比為80∶19∶1)。
13.根據權利要求書1所述的檸檬酸濃度為0.1～2％，食草動物的膽汁濃度為10-50％。
14.根據權利要求書1所述的負壓空化混旋固液萃取其特徵在於料液比為1∶5-1∶20，在自製的空化罐中空化10-30分鐘，通氣量為2-4m3/min，重複2-3次。
全文摘要
本發明涉及一種高效製備紫杉醇的方法。其特徵在於將鮮物料進行勻漿空化生物半合成，再經負壓空化混旋生物半合成及負壓空化混旋兩相培養處理；有機相濃縮至幹，水相過濾得水相濾液，濾渣加入溶媒進行負壓空化混旋固液萃取，合併萃取液，濃縮後與有機相濃縮物及水相濾液合併，加入檸檬酸或食草動物的膽汁經負壓空化混旋處理，冷凍濃縮；濃縮物加入甲醇溶解，置入乙腈中，離心，活性炭脫色，得液體用乙酸乙酯萃取，萃取液水洗至中性，減壓濃幹。濃縮物用乙腈溶解，沉澱析出10－脫乙醯基巴卡亭III，母液濃縮分別經氧化鋁柱層析和製備型高效液相層析及重結晶得紫杉醇晶體。
文檔編號C07D305/00GK1534032SQ200410013559
公開日2004年10月6日 申請日期2004年2月18日 優先權日2004年2月18日
發明者祖元剛, 薛豔華, 史權, 付玉傑, 唐中華, 祖柏實, 韓梅, 劉麗娜 申請人:東北林業大學, 祖元剛