單克隆抗體及其應用、試劑盒、檢測銀杏葉水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法

2023-05-04 01:54:11 1

單克隆抗體及其應用、試劑盒、檢測銀杏葉水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法
【專利摘要】本發明涉及藥物製劑檢測領域，特別涉及單克隆抗體及其應用、試劑盒、檢測銀杏葉水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法。本發明提供的銀杏葉水溶性蛋白的單克隆抗體由保藏號為CGMCC?NO：8654的雜交瘤產生。本發明提供的Dot-ELISA方法檢測銀杏葉水溶性蛋白的檢測限低，檢測的靈敏度遠遠高於ELISA方法，且操作時間短。
【專利說明】單克隆抗體及其應用、試劑盒、檢測銀杏葉水溶性蛋白含量 的Dot-EL丨SA方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及藥物製劑檢測領域，特別涉及單克隆抗體及其應用、試劑盒、檢測銀杏 葉水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法。

【背景技術】
[0002] 腦梗死又稱缺血性卒中，中醫稱之為卒中或中風，它是由各種原因所致的局部腦 組織區域血液供應障礙，導致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進而產生臨床上對應的神經功 能缺失表現。腦梗死依據發病機制的不同分為腦血栓形成、腦栓塞和腔隙性腦梗死等主要 類型。其中腦血栓形成是腦梗死最常見的類型，約佔全部腦梗死的60%。腦梗死的臨床表現 主要有偏癱、失語、意識障礙等，致殘率高，給患者帶來極大的痛苦，給家庭及社會帶來沉重 的經濟負擔，因此，如何有效預防和治療腦梗死依然是現代醫學研究的熱點。
[0003] 銀杏二萜內酯葡胺注射液是用於治療腦梗死的藥物，主要功效為活血通絡，用於 輕中度腦梗死恢復期痰瘀阻絡症(症狀如半身不遂，口舌歪斜，言語蹇澀，肢體麻木等)。銀 杏二萜內酯葡胺注射液是以銀杏葉為原料，經提取純化後得到，其有效成分為銀杏二萜內 酯，銀杏二萜內酯包括銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K等。
[0004] 由於中藥注射製劑中有效成分是經過生物提取的方式獲得，具有生物提取物的特 徵，在提取的過程中不可避免地帶有一些生物大分子，比如植物蛋白質、核酸等，而蛋白質 是抗原性最強的常見物質，且蛋白質的分子量越大抗原性越強，越容易引起過敏反應或類 過敏反應。如果中藥注射製劑的活性成分在提取過程中純化不完全，中藥注射製劑成品中 帶有蛋白質雜質，致使中藥注射製劑產品的質量不合格，注射入患者體內易引起過敏反應。 因此，控制銀杏二萜內酯葡胺注射液中水溶性蛋白含量，對於提高銀杏二萜內酯葡胺注射 液的質量至關重要。目前，銀杏二萜內酯葡胺注射液的質量控制方面多以高效液相色譜法 (HPLC)和磺基水楊酸沉澱法檢測為主。高效液相色譜法需使用精密儀器，費時長，不適合 大批量樣品的快速測定；磺基水楊酸沉澱法對蛋白質產生可見沉澱(混濁）的檢測限約為 25 μ g/mL，而低於此限量的蛋白質也能夠引發過敏反應。因此，提供一種檢測限低，靈敏度 高，準確性好，操作簡便，適於大批量樣品檢測的檢測方法，用於銀杏二萜內酯葡胺注射液 中水溶性蛋白的檢測，具有重要的現實意義。


【發明內容】

[0005] 有鑑於此，本發明提供了單克隆抗體及其應用、試劑盒、檢測銀杏葉水溶性蛋白含 量的Dot-ELISA方法。該Dot-ELISA方法檢測銀杏葉水溶性蛋白的最低檢出量為9. 75ng， 檢測的靈敏度遠遠高於ELISA方法，且操作時間短。
[0006] 為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
[0007] 本發明提供了一種銀杏葉水溶性蛋白的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC NO :8654 的雜交瘤產生。
[0008] 該雜交瘤於2013年12月23日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心（CGMCC)，保藏中心地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研 究所，保藏號為CGMCC N0 :8654。
[0009] 本發明還提供了該單克隆抗體在製備檢測銀杏葉水溶性蛋白含量的試劑盒中的 應用。
[0010] 本發明還提供了一種檢測銀杏葉水溶性蛋白含量的試劑盒，包括本發明提供的單 克隆抗體；該單克隆抗體由保藏號為CGMCC NO :8654的雜交瘤產生。
[0011] 本發明還提供了一種檢測銀杏葉水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法，包括如下步 驟：
[0012] 獲得待測樣品；
[0013] 獲得銀杏葉水溶性全蛋白；
[0014] 取硝酸纖維素膜，劃分出第一陰性對照區、第一陽性對照區和第一檢測區，經飽 和、第一乾燥，獲得第二陰性對照區、第二陽性對照區和第二檢測區；
[0015] 以磷酸鹽緩衝液、銀杏葉水溶性全蛋白、待測樣品作為抗原，取磷酸鹽緩衝液、銀 杏葉水溶性全蛋白、待測樣品分別包被於第二陰性對照區、第二陽性對照區、第二檢測區， 經第二乾燥、封閉、洗滌、第三乾燥，獲得抗原膜片；銀杏葉水溶性全蛋白的最低包被量為 9. 75ng ；
[0016] 以本發明提供的單克隆抗體作為第一抗體，以酶標記的羊抗鼠 IgG作為第二抗 體，取第一抗體與抗原膜片結合，獲得第一抗體-抗原膜片；取第二抗體與第一抗體-抗原 膜片結合，顯色，終止顯色，觀察檢測區是否出現斑點用以檢測待測樣品中銀杏葉水溶性蛋 白含量；
[0017] 檢測區出現斑點，則待測樣品中銀杏葉水溶性蛋白含量大於或等於9. 75ng ;
[0018] 檢測區未出現斑點，則待測樣品中銀杏葉水溶性蛋白含量小於9. 75ng。
[0019] 在製備抗原膜片的過程中，取磷酸鹽緩衝液、銀杏葉水溶性全蛋白、待測樣品分別 包被於第二陰性對照區、第二陽性對照區、第二檢測區，具體為：取磷酸鹽緩衝液包被於第 二陰性對照區，取銀杏葉水溶性全蛋白包被於第二陽性對照區，取待測樣品包被於第二檢 測區。
[0020] 利用Dot-ELISA方法對待測樣品檢測的結果需要肉眼觀察，如果硝酸纖維素膜上 的斑點擴散的面積過大，則易造成串孔，對試驗結果的觀察帶來困難。經過試驗條件的優 化，抗原的點樣量為1 μ L時，試驗結果易觀察。
[0021] 如果封閉時間過長，可導致陰性對照顏色顯著，使試驗結果的準確率下降。經過試 驗條件的優化，封閉的時間為lh時，試驗結果的準確率較高。
[0022] 為了保證能夠獲得最佳的反應效果，在本發明提供的一些實施例中，第一抗體的 稀釋倍數為1:3200?1:6400。
[0023] 為了保證能夠獲得最佳的反應效果，在本發明提供的一些實施例中，第二抗體的 稀釋倍數為1:5000。
[0024] 為了保證能夠獲得最佳的反應效果，在本發明提供的一些實施例中，顯色的時間 為 15min ?20min〇
[0025] 為了保證硝酸纖維素膜平整，有利於點樣操作的進行，在本發明提供的一些實施 例中，第一乾燥為在通風櫥中乾燥。
[0026] 膜溼潤時點樣，易流淌，結果判斷時易造成陽性值下降，且影響結果美觀性。膜半 幹時點樣，擴散程度最小。膜完全乾燥時點樣，極易擴散，結果判斷時易造成陽性值判斷失 誤，且影響結果美觀性。在本發明提供的一些實施例中，經第一乾燥的硝酸纖維素膜的含水 量為10%?30%，試驗結果的陽性值較高。
[0027] 本發明提供了單克隆抗體及其應用、試劑盒、檢測銀杏葉水溶性蛋白含量的 Dot-ELISA方法。本發明提供的銀杏葉水溶性蛋白的單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0: 8654的雜交瘤產生。通過對銀杏二萜內酯葡胺注射液中銀杏葉水溶性蛋白含量的檢測試 驗，結果顯示該方法最低檢出量為9. 75ng，而同法操作的間接ELISA方法最低檢出量為 156ng，表明本發明提供的Dot-ELISA方法的靈敏性遠遠高於ELISA方法；Dot-ELISA方法 操作時間短，比ELISA方法節約2h ;密封后的硝酸纖維素膜片在4°C條件下可保存至少3周 時間而不影響試驗結果的觀察。由此可見，本發明提供的Dot-ELISA方法檢測銀杏葉水溶 性蛋白的檢測限低，檢測的靈敏度遠遠高於ELISA方法，且操作時間短。
[0028] 生物保藏說明
[0029] 分類命名：抗銀杏葉蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株，於2013年12月23日保藏在 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏中心地址為北京市朝陽區 北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC N0 :8654。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1示實施例5中經過顯色的硝酸纖維素膜；其中，A示陰性對照區，B示陽性對 照區1、C示陽性對照區2、D示陽性對照區3、E示陽性對照區4、F示陽性對照區5、G示陽 性對照區6、Η示檢測區1、I示檢測區2、J示檢測區3。

【具體實施方式】
[0031] 本發明公開了單克隆抗體及其應用、試劑盒、檢測銀杏葉水溶性蛋白含量的 Dot-ELISA方法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指 出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括 在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫 離本
【發明內容】
、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實 現和應用本發明技術。
[0032] 本發明提供的單克隆抗體及其應用、試劑盒、檢測銀杏葉水溶性蛋白含量的 Dot-ELISA方法中所用試劑均可由市場購得。其中，含高糖的DMEM培養基購自GIBC0公司； 次黃嘌呤（H) (U^yg/mL)、胸腺嘧啶核苷（Τ) (3·88μ8/πιυ購自Sigma公司；L-穀氨醯 胺（L.G)(0. 29mg/mL)購自華美生物工程公司；雙抗(青黴素 G100U/mL，硫酸鏈黴素 100μ g/ mL)購自AMERSC0公司；HAT培養基：在HT培養基中加入氨基蝶呤（A) (1. 76 μ g/mL)購自 Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP)標記的山羊抗鼠 IgG (全分子)、鹼性磷酸酶（AP)標記羊 抗鼠 IgG、氨基碟呤（A)、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT)購自Sigma公司；McAb亞類鑑定試 劑盒購自Thermo公司；50%聚乙二醇4000 (PEG1500)購自Sigma公司；新生小牛血清為蘭 州民海生物工程有限公司產品；顯色液BCIP/NBT購自AMERSC0公司；TMB (四甲基聯苯胺)、 十二烷基磺酸鈉 （SDS)、丙烯醯胺等購自上海生工生物公司；普通蛋白質Marker、預染的蛋 白質Marker購自Fermentas公司；考馬斯亮藍R-250購自上海思吉生物製品有限公司；硝 酸纖維素膜（NC膜)購自WHATMAN公司；蛋白酶抑制劑購自羅氏公司；脫脂乳購自伊利公司； 其它有關試劑均為國產分析純試劑。
[0033] 磷酸鹽緩衝液（PBS，pH7. 4) :Na2HP04l. 44g，ΚΗ2Ρ040· 24g，NaC18. 0g，KC10. 2g，加蒸 餾水定容至l〇〇〇mL。1M Tris-Hcl (pH8.0):12.11g Tris，加入80mL雙蒸水，充分攪拌溶 解，緩慢加入 4.2mL 濃 HC1，定容至 100mL，4°C保存。TBS:NaC18.8g，lM Tris-Hcl (ρΗ8·0) 20mL，加入適量雙蒸水，充分攪拌溶解，定容至1L。TBST :TBS+0. 05%Tween-20。5%TBST脫脂 乳：5g脫脂乳粉，加入適量TBST，充分攪拌溶解，定容至100mL。
[0034] 小鼠骨髓瘤細胞系（SP2/0)細胞由揚州大學動物預防醫學重點實驗室提供；6周 齡雌性BALB/C小鼠、8周齡以上雄性ICR小鼠由揚州大學比較醫學中心提供。
[0035] C02恆溫培養箱、超低溫冰箱（-70°C )均為REVC0公司產品，4°C冷凍離心機為 Eppendorf公司產品；紫外分光光度計為美國Nanodrop公司產品；SW-CJ-2F型醫用淨化工 作臺為蘇州安泰空氣技術公司產品。
[0036] 下面結合實施例，進一步闡述本發明：
[0037] 實施例1銀杏葉水溶性全蛋白（抗原）的製備
[0038] 採摘新鮮銀杏葉，-70°C保存；將其剪碎，加入適量液氮研磨成粉末狀；取研磨好 的銀杏葉粉末〇· lg，加入1. 5mL10%的三氯乙酸（TCA)-丙酮，-20°C 2h ;4°C、12000rpm/min， 離心lh，棄掉上清，加入1. 5mL冰浴丙酮，-20°C 2h ;重複前一步操作直至上清變為清亮，4°C 離心棄掉上清；沉澱置於通風廚中風乾，得到含銀杏葉全蛋白沉澱粉末，-70°C保存。
[0039] 取含銀杏葉全蛋白沉澱粉末0. 15g，用lmL pH7.4磷酸鹽緩衝液（PBS)裂解， 12000rpm/min，離心0. 5h，取上清，得到銀杏葉水溶性全蛋白溶液，為防止蛋白質降解，加入 蛋白酶抑制劑，-20°C保存備用。以Bradford方法對銀杏葉水溶性全蛋白溶液進行蛋白質 定量，結果顯示銀杏葉水溶性全蛋白溶液中蛋白質濃度為6. 3mg/mL。
[0040] 實施例2單克隆抗體的製備
[0041] 選取6周齡雌性BALB/C小鼠，以實施例1提供的銀杏葉水溶性全蛋白溶液腹腔免 疫注射，間隔14天一次，共免疫三次，免疫的劑量分別為100 μ g/只，200 μ g/只，200 μ g/ 只。三次免疫後再進行一次加強免疫，加強免疫的劑量為300yg/只。首免時與完全弗氏 佐劑（1:1. 1)混合，再次免疫時與不完全弗氏佐劑（1:1. 5)混合，之後免疫不加佐劑。
[0042] 取加強免疫後72?96h的小鼠，經眼採血，麻醉後頸脫位將小鼠致死，用事先準 備好的75%酒精浸泡，仰面用針頭固定於事先消毒滅菌好放於超淨臺的泡沫板上，無菌剪 開小鼠腹部皮膚，取出脾臟，置於含少量無血清DMEM細胞培養基的無菌平皿中，用剪刀和 鑷子將表面的結締組織去除，用彎頭注射器針頭擠壓脾臟，使得脾細胞釋放，製成脾細胞懸 液，備用。
[0043] 選擇7瓶處於對數生長期，密度在80%?90%的骨髓瘤細胞（SP2/0細胞)，用不含 血清的DMEM培養基吹下計數，備用。
[0044] 將上述製備的骨髓瘤細胞與脾細胞(細胞數比例約為5?10:1)混合於一支50mL 的的融合管中，lOOOrpm離心10min，棄去培養基，輕拍管底，使沉澱均勻鬆散成糊狀，在 42?45s內加入lmL37°C預熱的PEG-4000試劑，並立即由慢到快加入DMEM培養液使融合終 止，於37°C培養箱靜置20min後離心，棄上清加入約lOmL HAT培養基，輕輕吹吸混勻，此時 不能用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開。再移到約80mL HAT培養基中，取約2mL含巨 噬細胞的HAT培養基加入上述含融合細胞的培養基中，分裝於96孔培養板，置於37°C 5%C02 培養箱培養，5天後HAT補液，10天後用HT培養基換液，同時吸出上清檢測篩選。
[0045] 當雜交瘤細胞的上清開始變黃或細胞長滿至孔底1/10以上時吸取上清進行間接 ELISA檢測。將銀杏葉水溶性全蛋白溶液作為包被抗原（以建立好的間接ELISA篩選方法 確定最佳包被抗原濃度)。包被銀杏葉水溶性全蛋白溶液時包被液為0. 05M、pH9. 6的碳酸 鈉-碳酸氫鈉緩衝液，100 μ L/ 孔，37°C水浴 2h 包被，PBST (0· 01M ρΗ7· 4, Tween-200. 05%) 洗滌三次，加 5%脫脂乳的PBST於37°C封閉2h，PBST洗滌三次後加入雜交瘤細胞上清，同 時分別以高免血清和ICR小鼠血清作陽性、陰性對照，37°C作用lh ;PBST洗滌三次後，力口 入1:10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠 IgG，37°C作用lh，PBST洗滌五次後，加入新鮮配製的 lmg/mL的底物顯色液TMB (10mL顯色母液+0· lmL TMB使用液+42J0. 74%H202，顯色母液： 25. 7mL0. 2MNa2HP04 · 12Η20+0· 1M 檸檬酸，TMB 使用液：10mg TMB+lmL DMS0)顯色 20min，2M H2S04終止後ELISA讀值儀測定0D45(I。選取上清只與包被抗原反應的培養孔細胞繼續培養。
[0046] 採用有限稀釋法對ELISA檢測為陽性的雜交瘤細胞進行克隆化。首先製備小鼠腹 腔飼養細胞，具體方法為：取一隻健康的ICR小鼠，經眼採血，麻醉後頸脫位將小鼠致死，體 表消毒和固定後，從胸部剪開皮膚，並將皮膚向尾巴拉，暴露整個腹膜，酒精棉球消毒腹膜。 用5mL注射器，注射5mL HAT培養基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球輕輕按摩腹 部，抽回腹腔內液體，置於10mL離心管中備用。將篩選得到的疑似陽性孔雜交瘤細胞轉移 至24孔細胞培養板中擴大培養，對重複篩選陽性的雜交瘤細胞進行亞克隆，具體操作步驟 如下：將細胞上清吸去，用lmL的HT生長液將細胞輕輕吹起，以血球計數板四周的16孔為 準，共計數4個16孔。結果得到細胞總數為1 X 104。先加 lOmLHT到離心管中，1 X 104/4=2500 個細胞/mL，需要三倍稀釋：先20滴HT培養基，再滴加10滴細胞懸液得到800個左右細胞 /mL，吸取2滴此濃度細胞加入到9. 5mL HT中，再加入0. 5mL巨噬細胞，充分混勻，每孔2滴 加入96孔板中，再每孔補加1滴(邊緣補加2滴)。然後置37°C，5%C02培養箱培養，期間切 忌移動細胞板。5?6d數亞克隆，10d後根據克隆的生長情況，吸取單克隆細胞孔的上清 進行篩選。每株細胞克隆2?3次，直至抗體陽性率達100%，得到單克隆抗體，並採用間接 ELISA檢測單克隆抗體的0D45Q。
[0047] 腹水型單抗的效價的檢測：取8?10周齡的Balb/c小鼠，腹腔注射礦物油0. 5mL， 兩周後，取抗體陽性率達100%的雜交瘤細胞100萬稀釋於DMEM培養基，腹腔注射，待小 鼠腹部明顯膨大後多次抽取腹水，將腹水5000rpm離心5min，取上清，得到腹水型單抗， 於-70°C凍存備用。以實施例1提供的銀杏葉水溶性全蛋白溶液作為抗原，按5 μ g/孔37°C 水浴2h進行包被。將腹水型單抗1:200稀釋後再倍比稀釋（1:200、1:400、1:800、1:1600、 1:3200、1:6400、1:25600、1:102400、1:409600、1:1638400)，按照間接 ELISA 方法測定第一 抗體(一抗）的效價，以辣根過氧化物酶（HRP)標記的羊抗鼠全分子IgG作為二抗，採用TMB 顯色，用2mol/L的硫酸終止反應，測定各孔0D45(I，檢測細胞上清的單抗效價。同時設高免血 清為陽性對照，正常ICR小鼠血清為陰性對照，稀釋腹水0D 45(/陰性對照0D45(I彡2. 1為陽 性，對應的抗體最高稀釋倍數作為該抗體的效價。
[0048] 經過檢測後，獲得了 1株能夠產生抗銀杏葉水溶性蛋白的單克隆抗體(單抗）的 雜交瘤細胞，保藏編號為CGMCC NO :8654,其產生的單克隆抗體命名為抗銀杏葉蛋白單抗 8cl0。抗銀杏葉蛋白單抗8cl0的間接ELISA檢測結果見表1。表1中的結果顯示抗銀杏葉 蛋白單抗8cl0與包被抗原呈強陽性反應。應用間接ELISA方法證明，腹水型單抗的效價可 以達到1:102400 (陽性血清A450為2. 385,陰性對照A450為0. 253)。
[0049] 表1銀杏葉蛋白單抗8cl0的間接ELISA檢測結果
[0050]

【權利要求】
1. 一種銀杏葉水溶性蛋白的單克隆抗體，其特徵在於，由保藏號為CGMCC NO :8654的 雜交瘤產生。
2. 如權利要求1所述的單克隆抗體在製備檢測銀杏葉水溶性蛋白含量的試劑盒中的 應用。
3. -種檢測銀杏葉水溶性蛋白含量的試劑盒，其特徵在於，包括如權利要求1所述的 單克隆抗體。
4. 一種檢測銀杏葉水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法，其特徵在於，包括如下步驟： 獲得待測樣品； 獲得銀杏葉水溶性全蛋白； 取硝酸纖維素膜，劃分出第一陰性對照區、第一陽性對照區和第一檢測區，經飽和、第 一乾燥，獲得第二陰性對照區、第二陽性對照區和第二檢測區； 以磷酸鹽緩衝液、所述銀杏葉水溶性全蛋白、所述待測樣品作為抗原，取所述磷酸鹽緩 衝液、所述銀杏葉水溶性全蛋白、所述待測樣品分別包被於所述第二陰性對照區、所述第二 陽性對照區、所述第二檢測區，經第二乾燥、封閉、洗滌、第三乾燥，獲得抗原膜片；所述銀杏 葉水溶性全蛋白的最低包被量為9. 75ng ; 以權利要求1所述的單克隆抗體作為第一抗體，以酶標記的羊抗鼠 IgG作為第二抗體， 取所述第一抗體與所述抗原膜片結合，獲得第一抗體-抗原膜片；取所述第二抗體與所述 第一抗體-抗原膜片結合，顯色，終止顯色，觀察所述檢測區是否出現斑點用以檢測所述待 測樣品中銀杏葉水溶性蛋白含量； 所述檢測區出現斑點，則所述待測樣品中銀杏葉水溶性蛋白含量大於或等於9. 75ng ; 所述檢測區未出現斑點，則所述待測樣品中銀杏葉水溶性蛋白含量小於9. 75ng。
5. 根據權利要求4所述的Dot-ELISA方法，其特徵在於，所述抗原的點樣量為1 μ L。
6. 根據權利要求4所述的Dot-ELISA方法，其特徵在於，所述封閉的時間為lh。
7. 根據權利要求4所述的Dot-ELISA方法，其特徵在於，所述第一抗體的稀釋倍數為 1:3200 ?1:6400。
8. 根據權利要求4所述的Dot-ELISA方法，其特徵在於，所述第二抗體的稀釋倍數為 1:5000。
9. 根據權利要求4所述的Dot-ELISA方法，其特徵在於，所述顯色的時間為15min? 20min〇
10. 根據權利要求4所述的Dot-ELISA方法，其特徵在於，所述第一乾燥為在通風櫥中 乾燥。
【文檔編號】G01N33/68GK104140465SQ201310740803
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】蕭偉, 秦愛建, 王振中, 趙妮, 李芳 , 錢琨, 周軍, 劉秋 申請人:江蘇康緣藥業股份有限公司, 揚州大學