絲裂原活化蛋白激酶的新磷酸化位點、經修飾的蛋白和用途的製作方法

2023-05-03 17:18:46

專利名稱：：絲裂原活化蛋白激酶的新磷酸化位點、經修飾的蛋白和用途的製作方法絲裂原活化蛋白激酶的新磷酸化位點、經修飾的蛋白和用途發明領域本發明涉及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的新磷酸化位點、在所述磷酸化位點修飾的MAPKs及其用途。發明背景^襲j活必蛋冷激爽fM4屍。術語MAPK包括三種激酶級聯ERK、JNK和p38及其各自的亞型[PearsonG,，etal"2001,"Mitogen-activatedprotein(MAP)kinasepathways:RegulationandPhysiologicalFunctions(絲裂原活化蛋白(MAP)激酶路徑調節和生物學功能)"，EndocrineReviews22(2):153-183]。這些激酶介導的細胞效應有多種並且覆蓋細胞的整個生命周期生長、分裂、分化、能動性、滲透反應、應激反應、炎症、癌等。對特定細胞外刺激的4企測被傳遞至第一激酶，其稱為MAPKKK，其標靶為另一激酶MAPKK的絲氨酸和蘇氨酸。該磷酸化通過對有限的T-Xaa-Y三聯體或三胺基酸基序(其中T是蘇氨酸、Y是酪氨酸並且Xaa是胺基酸如天冬氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸或脯氨酸的殘基)中的絲氨酸和蘇氨酸殘基進行磷酸化而決定MAPKK的活化，所述有限的T-Xaa-Y三聯體或三胺基酸基序稱為活化區段，攜帶該三組件級聯的最終標靶。MAPK是負責在絲氨酸和蘇氨酸上磷酸化數種底物如轉錄因子、其它激酶、結構元件等的效應物激酶。，蛋白p38MAPK，或p38,是屬於絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的酶，並且其在對外部應激信號例如紫外光、滲透性休克、熱等的細胞響應中起重要作用。由於此原因，該蛋白還被稱為應激活化蛋白激酶或SAPK。p38通過對轉錄因子、其它激酶進行磷酸化和活化從而控制基因表達來完成其調節作用，並且還通過調節重要信使RNA的穩定性來完成其調節作用。儘管p38亞型中研究最多的並且因此了解最多的是a亞型，用適當的刺激處理後在多種細胞類型中觀察到其活化(在造血和非造血組織中)，但存在四種p38亞型，其在不同組織中的分布不同，並且對不同p38抑制劑的敏感性不同。然而，儘管有這些不同，所有的p38亞型具有由12個胺基酸形成的活化結構域，其含有被MKK6/MKK3磷酸化的活化區段Thr-Gly-Tyr，所述MKK6/MKK3是在細胞信號傳導級聯中p38上遊發現的激酶家族的酶。p38是細胞功能必不可少的調節物，其介導細胞因子及其它分子的產生，這些分子是造成炎性過程發展的原因，並參與由細胞應激誘導的不同生理學狀態，如在某些心臟病和炎症現象的情況下和在細胞周期控制中。在最近數年中，分析了p38在不同疾病的發展或進化中的作用。已確立了p38活化在心力衰竭的建立和發展中的重要性。在小鼠試驗模型中和在高鹽食i昝的高血壓大鼠模型中已觀察到在大動脈縮窄後的持續活化。在人中，p38在受晚期冠心病之後的心力衰竭影響的心臟中活化。p38活化的調節在心臟病的發展中似乎是必不可少的，這是由於數個研究小組已在人和大鼠心肌中的晚期心力衰竭中觀察到p38活性的降低。現有技術中還通過使用p38MAPK抑制劑，描述了p38MAPK在不同於心臟病的其它病理狀態例如炎症、肺病或神經元疾病中的作用。所有這些病理狀態的特徵在於其具有活化的p38，即具有磷酸化的Thrl80和Tyrl82殘基。另一方面，在來自癌症患者的細胞中觀察到化學療法和放射療法均產生p38活化，這似乎是造成誘導腫瘤細胞死亡的信號的原因。在治療以活性p38的存在為特徵的不同疾病中最普遍的策略在於藥理學抑制其活性或如WO2005/032551、WO2004/021988、EP1534282或CA2497448中所述，與其它治療劑4關合抑制其活化。G衡G蛋白偶聯受體(GPCR)介導在心血管系統或免疫系統功能中起必不可少作用的不同信使的作用。除了與異三聚體G蛋白相互作用之外，活化的GPCRs與G蛋白偶聯受體激酶(GRKs)及與稱為視紫紅質抑制蛋白的調節蛋白相互作用。基於結構相似性，將GRK家族的7個成員(GRKl-7)分為4個亞家族GRK1、GRK2/3、GRK4/5/6和GRK7，其中GRK2/3和GRK5/6在生物體中具有普遍的分布。然而，改變GPCR信號傳導和促成這些病理狀態的觸發和/或進展的機理是未知的。除了允許其它細胞蛋白的募集和調節，開始新的信號傳導途徑之外，這些蛋白在細胞內功能的快速調節和被配體活化後的受體動力學中起著必不可少的作用，因此它們是GPCR介導的信號傳導的必不可少的調節物和成分。在病理狀態，例如充血心力衰竭、心臟肥大、高血壓或諸如類風溼性關節炎的炎性過程中，數種GRKs的水平和功能被改變。另一方面，SAPKs在心肌病和心力衰竭的發展中的重要作用是已知的，並且還已知選擇性GPCR活化促進這些激酶在心肌中的慢性活化，該步驟在心室肥大引起的心力衰竭的發展中是必不可少的。附圖的簡要說明圖1顯示GRK2在體外直接磷酸化p38。圖1A顯示p38被GRK2磷酸化。為了抑制GRK2活性的目的，於30。C下將用杆狀病毒體系純化的重組GRK2(50nM)與50nM的重組p38(GST-p38)在p38磷酸化緩沖液(25mMHepes、pH7.5、10mM乙酸鎂、50jhMATP,2000-3000cpm/pmo1[7-32p]ATP)中以40jLd的最終體積，與或不與肝素(50ng/jid)孵育30分鐘。在相同的條件下進行激酶自身磷酸化對照。通過加入SDS上樣緩衝液終止反應，在8%SDS-聚丙烯醯胺凝膠中分離蛋白，並通過放射自顯影法顯影。圖lB顯示GRK2直接磷酸化p38並且不促進其自身磷酸化。如與圖1A相關的描述進4亍磷酸化反應。以IC5Q濃度的10倍使用GRK2的抑制劑肝素和p38的抑制劑SB203580化合物，以保證完全抑制相應的激酶，即，對於肝素為1.5/xM以及對於SB203580為0.5gM。所用的底物對於p38為MBP(每點14pg)，以及酪蛋白(每點7.5jLig)。通過加入SDS上樣緩衝液終止反應，在10%SDS-聚丙烯醯胺凝膠中分離蛋白，並通過放射自顯影法檢測。圖lC顯示GRK2不在p38的活化區段中磷酸化p38。在上述條件下，但不存在放射性ATP的條件下開始磷酸化反應。使用40ng的MKK6cAM(MKK6/MKK3,Upstate)在體外磷酸化GST-p38。電泳分離後用於檢測的抗體在較大蛋白的情況下識別GRK2和GST-p38(抗-PF2抗體，在本發明人的實驗室中製得的多克隆血清，其含有抗GST-PF2融合蛋白的抗體，其中PF2是GRK2的C末端片段)。用於檢測p38活化狀態的T180/Y182磷特異性抗體是Ce11Signaling的。圖1D顯示GRK2磷酸化p38的時間依賴性。如前述在相同的條件進行磷酸化，除了孵育時間，如所指明的，其為0至90分鐘。用箭頭表示兩種蛋白(GRK279.6kDa;GST-p3868kDa)的遷移率。通過Cerenkov對切出的凝膠帶進行定量後得到的數據示於右側。圖1E顯示磷酸化動力學參數。考慮到D部分的數據，15分鐘的反應被認為是在初始速度條件下測定磷酸化動力學常數的時間長度。如已描述地進行磷酸化反應，保持GRK2濃度固定(25nM)並改變p38濃度，從12.5nM至400nM。通過加入SDS上樣緩衝液終止反應，在8%SDS-聚丙烯醯胺凝膠中分離蛋白，通過》文射自顯影法才全測並通過Cerenkov定量。該圖是用Kaleidagraph程序製作的，其提供能夠導出下列動力學參數的算法Michaelis國Menten常數(Km-79.56nM)和最大速度(Smax=每mgGRK2每分鐘摻入0.9nmolP043-)。圖2顯示GRK2和p38依賴性地與j82-腎上腺素能(仏-AR)受體刺激相關。圖2A:用pCDNA3國GRK2、pBC12BI-i82-AR和pCDNA3誦Flag誦p38a(lpg每種DNA每p60)載體瞬時轉染HEK293細胞。轉染後48小時後並在血清飢餓2小時後，用腎上腺素能激動劑異丙腎上腺素(ISO，10juM)刺激細胞5分鐘或10分鐘，或者不進行刺激(O分鐘ISO)。同樣地，用0.5MNaCl刺激不具有過表達的/VAR受體的細胞15分鐘。將細胞溶於適於用結合於瓊脂糖的M2抗Flag抗體進行免疫沉澱的緩衝液中，並且在取等份的這些溶解產物(10%)用於過度表達對照(溶解產物圖)之後，將這些免疫複合物在4。C孵育過夜。將免疫沉澱的蛋白(Ip抗Flag)重新懸浮在電泳裂解緩沖液(breakingbuffer)中並且將結合蛋白在10%SDS-聚丙烯醯胺凝膠中分離。電轉移之後，用抗p38以及用抗GRK2的抗體抗PFZ來檢測蛋白(分別為上圖和下圖)。該圖中還包括了沒有Flag-p38a的存在下以及不用IOpM的異丙腎上腺素刺激時的陰性免疫沉澱對照(Cneg)。在溶解產物圖中，通過抗磷酸化p38抗體檢測GRK2(上圖)以及p^活化狀態(下圖)(參見表l)。圖2B:在與2八中所述相同的方法中，用抗GRK2的抗體抗PF2免疫沉澱過表達的蛋白，並且在每一刺激點(接觸異丙腎上腺素後0分鐘和5分鐘，左上圖)用抗p38檢測後者的共免疫沉澱。Flag-p38表達對照(上圖)和GRK2表達對照(下圖)以及總免疫沉澱GRK2(左下圖)顯示於相鄰的圖中。在接觸10/iM異丙腎上腺素後刺激5分鐘，再次檢測兩種蛋白之間的結合。圖2C:此時，只將編碼/VAR和Flag-p38ce的載體引入HEK293細胞中以確保內源GRK2以低於p38的總量共免疫沉澱(0.5/ig的DNA)。用10MM異丙腎上腺素處理後5分鐘產生Flag-p38a與GRK2之間的最大結合(參見左上圖和左下圖)。右圖證實了細胞溶解產物中的GRK2表達(上圖，抗PF2)和p38表達(下圖，抗p38)。圖2D:在與A部分所述相同的實驗中，檢測了失去催化活性的GRK2-K220R突變體與Flag-p38共免疫沉澱的能力。上部分兩張圖別顯示兩個GRK2亞型的共免疫沉澱和總免疫沉澱的p38。兩張溶解產物圖顯示在每一點GRK2和GRKLKM0R的過表達(上圖，抗PF2)以及Flag-p38活化狀態(下圖，抗磷酸化p38)。如A中所述，進行M2抗-Flag-瓊脂糖抗體的非特異性免疫沉澱對照(Cneg)。圖3顯示GRK2如何能夠通過MKK6cAM降低p38活化。圖3A:用pCDNA3-Flag-p38a、pCDNA3-MKK6CAM以及增加量的pCDNA3-GRK2載體瞬時轉染通常接種於具有6孔或12孔的多孔4反(M6或M12)中的HEK293細胞。在此實驗中，使用M6板並且引入的DNA量為100ng的Flag-p38、100ng的MKK6cAM和0至lgg的GRK2。在所有的點，用pCEFL-EGFP來補足DNA總量，並且在對照組(CTRL)的情況下用空pCDNA3代替pCDNA3-MKK6cAM。48小時後，通過將細胞溶解於M2緩沖液中而收集細月包。上圖顯示過表達的GRK2劑量。用CellSignaling的抗磷酸化p38評價p38活化狀態，並且在放出首次免疫檢測的抗體之後，用同一公司的總抗p38對其進行檢測。注意顯示了輕微曝光的放射自顯影以避免顯影的^f氐分辯率飽和。圖3b:用pCDNA3-GRK2穩定轉養被Flag-p38和MKK6cAM轉染。以與A中相同的方式測定Flag-p38活化狀態。此外，用UpstateBiotechnology的抗MKK6/SKK3抗體確認MKK6cAM的正確表達。在圖4中，實驗顯示GRK2降低p38的催化活性。圖4a:用0.5的pCDNA3-Flag-p38a、0.5/Ag的pCDNA3-MKK6cAM(或在對照組CTRL中為0.5/xg的空pCDNA3)以及用1pg或2gg的pCDNA3-GRK2(+)載體對接種於p60中的HEK293細胞進行瞬時轉染，每一點重複兩次。以平行的方式進4亍對照，用pCEFL-EGFP(-)代替pCDNA3-GRK2。用空pCDNA3補足DNA總量。48小時後，將細胞溶解，取等份的溶解產物並從中免疫沉澱Flag-p38。A中的圖顯示GRK2(抗PF2)和MKK6cam(抗MKK6)的過表達以及Flag-p38(抗磷酸化p38)活化。圖4b:將免疫沉澱物用15ml的M2緩衝液洗滌三次並用15ml的不含ATP的磷酸化緩衝液(15mMNaF、25mMHepespH7.5和10mM乙酸鎂)洗滌兩次。在最後的洗滌步驟中，將瓊脂糖免疫複合物重新懸浮在lml的緩衝液中，並且分離每一點的10。/。以對照Flag-p38的免疫沉澱(B部分圖中的插圖)。用免疫沉澱的Flag-p38進行激酶測定，使用APRTPGGRR肽(最初由CalbioChem提供，然後由CBMSO的ServiciodeQuimicadeProtdnas〈蛋冷^化夢應J^合成)作為底物。在由25mMHepespH7.5;10mM乙酸鎂、15mMNaF、50/*MXtP和500國1000cpm/pmol[y32p]atp和2mM的肽底物形成的磷酸化緩衝液中以25/xl的最終濃度進行該反應。當指出(+SB)時，以0.5jiiM的最終濃度向體外反應中加入SB203580。使磷酸化在30。C進行30分鐘，然後通過加入15jiil的30。/。TCA使其終止。通過離心(25000xg，15分鐘，4。C)使蛋白沉澱，並且從每一反應中回收含有石岸酸化的肽的上清液。將正方形(1cmx1cm)WhatmanP81紙切片用肽溶液浸漬。將其B京幹，用75mM磷酸充分洗滌，並且通過Cerenkov對摻入被吸附的肽的放射性進行定量。活性水平被定義為在不存在MKK6CAM時(CTRL)Flag-38對肽底物的磷酸化。圖5顯示GRK2水平的降低允許在原位MKK6cAM對p38的更高的活化。圖5A:用150ng的pCDNA3-Flag-p38a、50ng的pCDNA3國MKK6cAM以及用增加量的pCEFL-GRK2反義(AS)載體0.5/ig至2/xg或等量的pCEFL-EGFP作為對照(C)對接種於M6板中的HEK293細胞進行瞬時轉染。在所有的點，用空pCEFL載體補足DNA總量。將細胞溶解並且在每一點對GRK2總量(上圖，抗PF2)、p38活化(中圖，抗磷酸化p38)和總p38(下圖，抗p38N)進行免疫檢測。圖中顯示了來自代表性實驗的2/xg(對於GFP和反義)點的數據。在兩種條件下每一種中p38活化水平均指其各自的不存在MKK6cAM時的對照。圖5B:基礎p38活化被GRK2的量調節。用100ng的pCDNA3-Flag-p38a以及用0.5jng至2/xg的pCEFL-GRK2反義或pCEFL-EGFP對HEK293細胞的M6板進行瞬時轉染。用pCEFL補足每一點的DNA總量。在這些條件下通過電轉移和免疫檢測評價GRK2的總量(抗PF2，上圖)、p38活化狀態(中圖，抗磷酸化p38，在化學發光顯影中過度曝光的放射自顯影)和總p38(下圖，抗p38)。來自三次獨立研究的數據的平均值(土SEM)—式兩份顯示於圖的下部。應用fpO.005的雙邊學生t檢驗統計來確定顯著性。圖6顯示僅帶有其整體結構決定子的p38為GRK2的底物。圖6A:從用質粒pGEX2T-p38a、pGEX4T-Mxi2和pGEX4T畫Mxi2A17:p38a、Mxi2和Mxi2A17轉化的細菌中純化與GST(蛋白示意圖中的黑色矩形)融合的蛋白。Mxil亞型被用作C-末端截短的突變體，以試圖限制GRK2磷酸化位點。將重組GRK2(200nM)與0.5/ig的每一融合蛋白在磷酸化緩衝液(25mMHepespH7.5，10mM乙酸鎂，50/xMATP，2000-3000cpm/pmo1[7-32p]ATP)中在30。C孵育30分鐘。還包括肝素(150nM)作為特異性GRK2抑制劑。通過加入SDS裂解緩衝液終止反應。將樣品在8%SDS-PAGE上分離。為了確保包含相同量的蛋白，首先通過考馬斯亮藍(CBB)染色在凝膠中對其進行觀察。然後將凝膠乾燥並檢測摻入蛋白的》文射性(32p)。圖6B:通過InvitrogenGateway系統產生對應於p38a的最後80個胺基酸的截短的GST-280-360p38蛋白。在與A部分中所述相同的條件下，使用Mxi2A17作為p38N-末端、280-360p38作為C-末端以及使用完整p38a進行磷酸化測定。通過放射自顯影("P)檢測磷酸化，並且通過使用抗GST抗體的Western印跡，同時進行對測定中所用蛋白的量的對照的檢測。清楚觀察到未磷酸化的GST-280-360p38蛋白的存在。STD，標準分子量蛋白的遷移率。圖7顯示GRK2使p38在單個殘基上磷酸化p38。圖7A:在二維電泳中分析GRK2對p38的磷酸化並且該反應在與前述相同的條件下進行。通過加入等電聚焦上樣緩衝液而終止反應。第一電泳維度具有pH3至pHIO的兩性電解質梯度。通過8%聚丙烯醯胺凝膠分離第二維度。用箭頭表示兩種蛋白(GRK2，79.6kDa;GST-p38,68kDa)的遷移率。圖7B:在凝膠中分離來自非放射性磷酸化測定的樣品，旨在進行蛋白質組序列分析。將凝膠染色以觀察條帶，並且將與GST-p38對應的條帶從凝膠上切出並進行胰蛋白酶消化。通過MALDI-TOF分析得到的肽。顯示了所得質i普的區域的放大，其中檢測到磷酸化的肽(質量對應於1,945.330)，其只存在於#皮GRK2磷酸化的樣品中。圖8顯示GRK2在單個殘基上磷酸化p38。利用MALDI-TOF(BrokerAutoflex型號)中得到的數據，鑑定了進行磷酸化的候選者，胰蛋白酶肽LTDDHVQFLIYQILR。為了證實這些跡象，用HPLC-ESI國IT(Thermo-FinniganDeca-XP型號)分離樣品，該儀器以SIM(單離子監測)模式工作，使得分析器僅片段化候選肽。為可識別的肽質量分配系列(根據片段化的行為稱為bn或y，，n)。與Ab8系列(橙色盤中)對應的質量表明在得自磷酸化樣品的下方譜帶中觀察到存在於被分析肽中的蘇氨酸上的磷酸化。同樣地，在兩種情況下均確定了肽的總質量(黃色橢圓內部)。該圖右側插入的縮孩史窗口顯示了來自磷酸化的樣品和對照樣品中的相同的肽在HPLC柱中的差異洗脫的信息。考慮到其更大的親水性，磷酸化的肽被洗脫的時間要早幾十秒。圖9顯示p38T123A和T123D突變體在體外未被GRK2磷酸化。圖9A:與GST融合的p38T123A和p38T123D蛋白在原核表達質粒pGEX2T中通過定點誘變製備。測定了在圖中所表明的最終濃度下與野生型GST-p38WT蛋白相比，重組GST-p38T123A和GST-p38T123D蛋白作為GRK2底物的能力。上圖代表得到的磷酸化("P)，並且下圖通過抗p38NWB顯示測定中所用的重組蛋白的量。圖9B:p38a的代表性示意圖，其中突出顯示了功能特徵，例如激酶結構域延伸、TGY活化區段和推測被GRK2調節的LTDD序列中相同的位置。還突出顯示了最初涉及調節底物和活化劑結合的CD基序。圖10顯示蘇氨酸123是高度保守的殘基，位於用於p38活化劑和底物的對接槽的外表面。顯示的多序列比對由Dr.Perdiguero通過ClustalX程序(http:〃www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/)完成。虛線引入用於調整比對的空位(gap)。用紅色寫在黃色背景上來突出顯示所有亞型中相同的殘基，藍色和綠色背景分別表示排列的蛋白之間根據大或小分布的保守置換。非保守的胺基酸留在白色背景上。在每一多序列比對的底部表明共有序列，並且通過紅色橢圓，突出顯示了蘇氨酸123區域，還在下部的序列比較中用箭頭指出。圖ll顯示p38T123D突變體在體外沒有被MKK6cAM活化，並缺乏對ATF2的激酶活性。圖11A:用融合蛋白GST-p38WT、GST-p38T123A和GST-p38T123D(150nM)作為重組MKK6cam(40ng)的磷酸化底物(UpstateBiotechnology),在體外進行磷酸化測定(25mMHepespH7.5;10mM乙酸4美，15mMNaF，ATP50^M和1000-2000cpm/pmo1[7-32P]ATP)。在30。C進行反應30分鐘，並且在8。/。SDS-PAGE凝膠中分離蛋白。通過考馬斯藍染色在觀察每一點的p38的量。然後測定每一p38亞型中的放射性。放射自顯影("P)顯示三個獨立測定的代表性實驗，每一實驗重複兩次。圖11B:在這些相同的測定中，評價了MKK6cAM活化的GST-p38WT、GST-p38T123A和GST-p38T123D磷酸化2/xg的GST-ATF2的能力。附上總GST-ATF2對照(考馬斯藍)的代表性放射自顯影(3卞)。圖12顯示p38蘇氨酸123對於其在MEF2A底物上的正確催化活性是必需的。圖12A:用圖中所示的融合蛋白在存在(+)或不存在(-)重組MKK6CAM(40ng)和2pg的GST-MEF2A時進行體外磷酸化。測定進行30分鐘。將蛋白在8。/。SDS-PAGE中分離，用CBB染色，並檢測摻入的放射性("P)。提供了獨立進行的三個測定的代表性實驗的圖。圖12B:在前述條件下評價了沒有MKK6cAM活化劑的存在下三種p38融合蛋白的基線活性。顯示了長時間曝光後的代表性放射自顯影。圖13顯示p38T123D突變體與野生型p38相比4交少地孚皮MKK6cam原位活化。在與前述類似的過表達實驗中，用150ng的pCDNA3-Flag-p38aWT或pCDNA3-Flag-p38aT123D和50ng的pCDNA3-MKK6CAM(或空pCDNA3)轉染接種在M6中的HEK293細胞，並總是重複兩次。評價了p38被抗磷酸化p38抗體的活化。對於兩種亞型的每一種，通過MKK6CAM的活化均相對於基線條件，得到特定的活化水平。在每一實驗中，100%活化被建立為p38aWT活化。顯示了三次獨立實驗的數據(士SEM)。進行雙邊學生t檢驗，得到*p<0.0001。右圖(Western印跡法)例示了這些實-瞼之一。圖14顯示p38T123D突變體不與底物結合，並且其不與MKK6結合，也不被MKK6磷酸化。在結合洗脫測定(pulldownassay)中用GST作為陰性對照，將純化的GST-p38及其T123突變體(300nM)在純化的MKK6(3nM)或His標記的MAPKAPK2(MK2，20nM)的存在下孵育。通過Western印跡法使用抗MKK6、抗組氨酸(對於His-MK2)或抗GST(對於GST-p38s總量)抗體使沉澱的蛋白顯影。在所有圖中，結果是三個重複兩次的獨立實驗的代表。圖15顯示GRK2如何降低結締組織細胞向脂肪細胞的p38依賴性分化。製備了被pCDNA3-GRK2和pCDNA3-GRK2K220R穩定轉染的3T3L1系。包括了在細胞系中得到的與3T3L1水平相比的GRK2(抗GRK2)表達對照。將細胞進行標準分化處理，並且在處理後第15天將細胞用福馬林固定並用油紅染色，油紅為親脂性染料，其與脂肪細胞積蓄的脂肪結合。在顯微鏡下對總共25個視野中具有脂肪細胞表型的細胞(紅色)進行計數。以兩個重複顯示兩個獨立實驗的代表性照片。還包括了分化過程中不受胰島素刺激的(對照)3T3L1細胞的照片。本圖反映了這些實驗中的脂肪細胞計數(士SEM)。對於每一穩定系進行關於3T3L1細胞的雙邊學生t4企驗並得到*p<0.0001。通過用10/iM的SB203580的藥理學處理而平行進行p38依賴性對照。圖16代表抗磷酸化Thrl23抗體對從培養物中的人細胞免疫沉澱的p38的識別以及p38被GRK2體外磷酸化。圖16A:用小鼠Flag-p38a和GRK2或其無活性突變體(GRK2-K220R)的表達載體轉染HEK293細胞。在細胞溶解之前將細胞在沒有血清的條件下培養16小時。通過抗flag(M2)抗體將Flag-p38進行免疫沉澱(IPP)並且在電泳和轉移之後，通過Western印跡法(WB)用在親和柱中純化的特異性抗體(P-p38-T123，稀釋l:200)檢測在Thrl23磷酸化的蛋白。用總抗p38(p38)將同一張膜進行顯影，並且用抗GRK2436-689(GRK2)顯影對應於包含在免疫沉澱之前的細胞提取物(溶解產物)中的蛋白的另一張膜。圖16B:將SGST-p38(50nM)單獨地、與純化的GRK2(150nM)—起或與40ng的組成型活化的MKK6cAM—起在磷酸化緩沖液中在非放射性標記的ATP的存在下於30。C孵育30分鐘。上圖用抗磷酸化形式的p38的Thrl23的多克隆抗體顯影。中圖用p38的Thrl80/Tyr182殘基的磷酸特異性抗體(抗Pp38)孵育，並且在下方顯影中使用抗總p38的抗體。圖17顯示抗磷酸化抗體識別被GRK2在蘇氨酸123處磷酸化的p38，這是因為p38的T123A突變體的在該條件下不被識別。將GST-p38wt和GST-p38T123A(70nM)分別與純化的GRK2(25nM)或與重組MKK6CAM(2ng)孵育；當特別指明時，加入特異性GRK2抑制劑肝素(IOOng爾l)。通過Western印跡用抗磷酸化T123分析GSTp38蛋白的磷酸化，並用抗GST分析總GST-p38。數據為3次獨立實驗的代表。圖18顯示響應從GRK2部分缺乏的小鼠中提取的巨噬細胞的脂多糖的p38活化水平和TNF分泌水平。腹膜小噬細胞來自野生型C57BL/6(+/+)或GRK2半合子(+/-)小鼠。將其置於無刺激下2小時後，向培養基中加入細菌脂多糖(LPS:0.5ng/ml),保持16小時。通過可商購的ELISA試劑盒(AmershamBiotrak)對炎性細胞因子(TNFce)的產生進行定量。為了確認該過程對p38的依賴，在加入LPS之前使用SB203580(30pM)30分鐘。顯示了4個獨立實驗中處理的IO只小鼠的平均值土SD。數據對應於來自M24的每孔106個細胞的TNFa分泌。*p<0.005(根據學生t檢驗)。發明的詳細描述一方面，本發明涉及MAPK蛋白，在本說明書中有時稱為"本發明的MAPK蛋白"，其選自a)在磷酸化位點中包含磷酸化的殘基的MAPK蛋白，所述磷酸化位點不同於存在於所述MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，或者所述MAPK蛋白是包含所述磷酸化的殘基的所述蛋白的片段，其中-所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的123位的蘇氨酸殘基(Thrl23)，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對來定義，並且-在所述不同磷酸化位點的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化及其對其底物的活性；以及b)在磷酸化位點中或所述磷酸化位點的周圍區域包含負電荷或大殘基的MAPK蛋白，所述磷酸化位點不同於存在於所述MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，或者所述MAPK蛋白是包含所述磷酸化的殘基的所述蛋白的片段，其中-所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的123位的蘇氨酸殘基(Thrl23)，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對來定義，並且-向所述磷酸化位點或所述磷酸化位點的周圍區域引入負電荷或大殘基防止所述MAPK蛋白的活化及其對其底物的活性。本文所用的術語"位置等同"是指MAPK蛋白的胺基酸的位置，其通過MAPK蛋白的胺基酸序列的多序列比對，對應於小鼠p38、a亞型的Thrl23。術語"MAPK蛋白"包括任何物種的ERK、JNK和p38蛋白激酶，以及其各自的亞型。關於所述激酶及其功能以及其細胞效應的信息能夠在Pearson等人的綜述中找到[PearsonG.，etal.，2001,"Mitogen-activatedprotein(MAP)kinasepathways:RegulationandPhysiologicalFunctions(絲裂原活化蛋白(MAP)激酶調節和生理學功能)"，EndocrineReviews22(2):153-183]。關於所述MAPK蛋白的胺基酸序列的信息能夠在本領域技術人員已知的適當的資料庫中找到(如Swissprot、NCBI等)。MAPK激酶在不同物種中廣泛分布，並且其一級結構在不同家族的不同成員(ERK、JNK和p38)中是廣泛保守的。MAPK蛋白的特徵之一是存在包含至少一個易於被適當的激酶磷酸化的殘基的活化區段。在具體實施方案中，所述活化區段包含通式(I)的胺基酸三聯體formulaseeoriginaldocumentpage22其中Thr是蘇氨酸，Tyr是酪氨酸，並且Xaa是胺基酸殘基。在具體實施方案中，Xaa是選自天冬氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸和脯氨酸的胺基酸的殘基。在哺乳動物p38、a亞型的具體情況下，所述活化區段在其胺基酸序列的180-182位置包含通式(I)的胺基酸三聯體。在另一具體實施方案中，所述活化區段包含式(II)的胺基酸三聯體formulaseeoriginaldocumentpage22其中Ser是絲氨酸，Glu是穀氨酸，並且Gly甘氨酸。在本發明的實施方案中，本發明的MAPK蛋白選自ERK、JNK和p38激酶。以例示的方式，在具體實施方案中，本發明的所述MAPK蛋白是p38。p38激酶在不同的物種中廣泛分布並且其一級結構是廣泛保守的(圖10)。在具體實施方案中，所述p38是以其任何亞型(a、/3、7或S)存在的哺乳動物p38，例如人、齧齒動物等的p38。在特定實施方案中，所述p38是小鼠p38的Q!亞型(小家鼠(Mwm^sci//1^)),其胺基酸序列示於SEQIDNO:1(GenBank，登記號P478U)。本發明人驚訝地發現，MAPK蛋白在易於磷酸化的位點的磷酸化能夠抑制所述MAPK蛋白的活化，所述易於磷酸化的位點不同於所述MAPK蛋白的活化區段中存在的一個或多個磷酸化位點，已知所述活化是通過對所述活化區段中，例如尤其是在上文所提到的所述胺基酸三聯體中存在的易於磷酸化的殘基(如蘇氨酸或酪氨酸)進行磷酸化而發生的。事實上，本發明人進行的研究已清楚地顯示小鼠p38、a亞型的123位的蘇氨酸殘基(Thrl23)的磷酸化防止在所述p38的活化區段中存在的通式(I)胺基酸三聯體中的180和182位分別存在的蘇氨酸和酪氨酸殘基的磷酸化。結果是p38不能被活化，並且因此其不能在信號轉導級聯中實現其功能，這對於治療那些涉及在細胞信號傳導級聯中所述MAPK的活化的疾病可能是特別有用的。本領域技術人員會理解，不僅在所述新磷酸化位點的磷酸化，而且在所述新磷酸化位點或所述位點的周圍區域引入負電荷或大殘基，也可以產生防止MAPK蛋白活化及其對其底物的活性的效果。因此，本發明教導MAPK蛋白中新磷酸化位點的存在，其中所述磷酸化位點不同於存在於所述MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，所述磷酸化位點例如小鼠p38、a亞型的Thr123，或者是存在於另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同是通過胺基酸序列的多序列比對所定義的，並且所述磷酸化位點的進一步特徵是，一旦其被磷酸化，其能夠抑制所述MAPK蛋白的活化。所述不同的磷酸化位點的具體位置可根據所討論的MAPK蛋白(ERK、JNK或p38)、亞型和動物物種而不同，儘管在其磷酸化之後(或在所述磷酸化位點或所述位點的周圍區域中引入負電荷或大殘基之後)其防止所討論的MAPK蛋白活化的功能不變，其位置等同或對應也不變。含有具有上述位置和功能特徵的所述磷酸化位點的MAPK蛋白被包括在本發明的範圍內。因此，本發明的MAPK蛋白不僅包括在Thrl23上磷酸化的小鼠p38蛋白a亞型，還包括其直系同源蛋白，即來自共同祖先基因的、在不同物種中實現相同功能的蛋白，以及其亞型和包括在MAPK蛋白的組中的其它激酶(ERK和JNK)，而不論磷酸化位點是否在所述位置(Thrl23)或在另一不同位置並且磷酸化的胺基酸是否是不同於蘇氨酸的胺基酸。此外，本發明的MAPK蛋白還包括在新的磷酸化位點或在所述位點的周圍區域具有負電荷或大殘基的經修飾的MAPK蛋白，如在Thr123或所述位點的周圍區域含有負電荷或大殘基的經修飾的小鼠p38蛋白，a亞型，還包括其直系同源蛋白以及其亞型和包括在MAPK蛋白類群中的其它激酶(ERK和JNK),而不論該負電荷或大殘基是否在所述位置(Thrl23)或在另一不同位置並且經修飾的胺基酸是否是不同於蘇氨酸的胺基酸。根據本發明可被引入所述新磷酸化位點或所述位點的周圍區域的負電荷的示例性、非限制性實例對於本領域技術人員是很顯然的，例如，任何能夠提供負電荷的分子或化合物，如帶有磷酸鹽基團的肽，所述肽能夠與所述磷酸化位點結合或與其周圍區域結合，並在該位點模擬磷酸化的效果。根據本發明可被引入所述新磷酸化位點或所述位點的周圍區域的大殘基的示例性、非限制性實例對於本領域技術人員是很顯然的，例如，任何能夠與所述磷酸化位點結合或與其周圍區域結合，並在該位點模擬磷酸化的效果的分子，如肽或低分子量化合物；儘管本發明人不想提出任何理論，但相信所述大殘基可在MAPK蛋白中產生構象變化，這防止了所述MAPK蛋白的活化以及其對其底物的活性。本文中所用的表達"在(新)磷酸化位點的周圍區域"是指磷酸化位點周圍的區域，其中通過負電荷或大殘基在其中引起的修飾防止所述MAPK蛋白的活化及其對其底物的活性。能夠在所附的實施例中找到用於測定防止或抑制MAPK蛋白的活化及其對其底物的活性的效果的適當測定方法；因此所述信息能夠被本領域技術人員用於識別所述的"磷酸化位點的周圍區域"。在具體實施方案中，本發明的MAPK蛋白是在磷酸化位點包含磷酸化的殘基的MAPK蛋白的片^爻，所述磷酸化位點不同於存在於所述MAPK蛋白的活化區IS:中的一個或多個磷酸化位點，其中，如前所述，所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thrl23或者另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對來定義，並且在所述不同的磷酸化位點的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化。所述片段的長度可在很寬的範圍內變化，例如3個至30個胺基酸殘基，通常為5個至25個胺基酸殘基，優選10個至20個胺基酸殘基。然而，如果需要，所述片段可包含更大數目的胺基酸殘基。所述片段有利地包含本發明的MAPK蛋白的表位。在具體實施方案中，所述片段包含對應於表位QKLpTDDHVQFLIY的SEQIDNO:2，其中"pT，，代表磷酸化的Thrl23殘基並且剩餘的字母表明基於小鼠p38激酶，a亞型的單字母編碼的胺基酸註解。所述表位在進化中是高度保守的，因此所述SEQIDNO:2能夠被認為是不同物種的p38的直系同源蛋白中所述表位的共有序列。在另一具體實施方案中，本發明的MAPK蛋白是在磷酸化位點(或在所述位點的周圍區域)包含負電荷或大殘基的MAPK蛋白片>^,所述磷酸化位點不同於存在於所述MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中，如前所述，所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thrl23或者另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對來定義，並且在所述不同的磷酸化位點處的所述修飾(負電荷或大殘基)防止所述MAPK蛋白的活化。所述片段的長度可在很寬的範圍內變化，例如3個至30個胺基酸殘基，通常為5個至25個胺基酸殘基，優選10個至20個胺基酸殘基。然而，如果需要，所述片段可包含更大數目的胺基酸殘基。所述片段有利地包含本發明的MAPK蛋白的表位。已知多種涉及MAPK活化的病理狀態。通過非限制性的示例性實例，已知不同疾病與活化的p38之間存在的關係，所述活化的p38即在存在於活化區段中的磷酸化殘基，例如哺乳動物(小鼠)p38、a亞型的Thrl80和Tyrl82殘基上磷酸化的p38。因此，通過在本發明所鑑定的所述MAPKs的所述新磷酸化位點或在新磷酸化位點的周圍區域進行磷酸化或引入負電荷或大殘基能夠防止MAPK活化(防止在存在於MAPK的活化區段中的磷酸化位點上的磷酸化)的事實(如在哺乳動物(小鼠)p38、a亞型的Thrl23上的磷酸化防止Thrl80和Tyrl82殘基上的磷酸化)，以及在Thrl23或在Thrl23的周圍區域進行磷酸化或引入負電荷或大殘基能夠防止p38對其底物的對接及其對其底物的活性的事實具有重要的生物學意義，其可用於診斷由活性MAPK介導的病理狀態，或用於確定個體患所述病理狀態的風險或易患病體質，或用於評價或監控對患有所述病理狀態的個體進行治療的效果，或用於分析所述病理狀態的階段或嚴重性和/或發展，以及用於識別潛在的可用於治療所述病理狀態的化合物，以及其它應用。在這種意義上，本發明的MAPK蛋白可起重要的作用。術語"個體"包括任何動物物種，包括人；以示例的方式，所述個體能夠是哺乳動物，例如人、家畜、齧齒動物等，優選任何年齡和種族的男人或女人。本文所用的表達"由活性MAPK介導的病理狀態"包括任何病理狀態，其中涉及活性MAPK或者活性MAPK起某種作用，所述活性MAPK即在存在於活化區段中的磷酸化殘基上磷酸化的MAPK。由活性MAPK介導的所述病理狀態的示例性、非限制性實例包括癌症和心臟的、傳染性的、神經元的、肺的和炎性的疾病。所述疾病的示例性、非限制性實例包括心肌梗塞、肥大、高血壓、心肌炎、血管成形術談發的病變、心肌功能障礙、病毒或細菌感染、神經元死亡或其它細胞類型的死亡、阿爾茨海默病、銀屑病、類風溼性關節炎、自體免疫神經炎、克隆病、癌(腫瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤等)、血凝塊形成、對化學治療劑和放射治療劑的反應、對缺血/再灌的反應等。因此，本發明的MAPK蛋白是可用作診斷標記或用作個體對由活性MAPK介導的病理狀態具有易患病體質的標記的蛋白，所述病理狀態例如癌症或心臟的、傳染性的、神經的、神經元的、肺的或炎性的疾病。由於活性MAPK的存在與上述由活性MAPKs介導的病理狀態相關，本發明的MAPK蛋白的檢出表明對於患所述病理狀態的較低風險或易患病體質，因為在本發明鑑定的磷酸化位點中的磷酸化，或在所述磷酸化位點或在所述位點的周圍區域中引入負電荷或大殘基會防止所述MAPK的活化。在具體實施方案中，本發明的所述MAPK蛋白是在磷酸化位點磷酸化的哺乳動物p38蛋白，所述磷酸化位點不同於存在於所述哺乳動物p38的活化區段中的磷酸化位點，所述MAPK蛋白例如在Thrl23上磷酸化的哺乳動物p38，或包含所述磷酸化的殘基的所述蛋白的片段。在具體實施方案中，本發明提供用於分析個體罹患由活性MAPK介導的病理狀態的風險或易患病體質的體外方法，其包含a)對來自所述個體的生物樣品中的本發明的MAPK蛋白的水平進行檢測和/或定量；以及b)將所述水平與對照樣品的水平比較，其中所述水平相對於對照樣品的下降表明個體罹患由活性MAPK介導的所述病理狀態的風險。事實上能夠使用來自所研究個體的任何生物樣品，例如血液、血清、血漿、組織等。能夠通過常規方法獲得所述樣品。對照樣品是來自不患有由活性MAPK介導的所述病理狀態的個體的樣品，並且包括參考或基線值。本發明的所述MAPK蛋白水平(濃度)的檢測和/或定量能夠通過本領域技術人員已知的常規方法來測定，例如通過免疫化學方法(見下文)。本發明的MAPK蛋白還能夠被用於評價或監控對患有由活性MAPK介導的所述病理狀態的個體進行的治療的效果，所述病理狀態例如癌或心臟的、傳染性的、3申經的、神經元的、肺的或炎性的疾病。在這種意義上，防止MAPK活化的治療，例如通過在本發明中所鑑別的磷酸化位點進行磷酸化或通過在所述磷酸化位點或在所述位點的周進行的治療的效果，並且如果該治療無效，則修改治療或設計定製的治療。在具體實施方案中，本發明的所述MAPK蛋白是在磷酸化位點磷酸化的哺乳動物p38蛋白，所述磷酸化位點不同於存在於所述哺乳動物p38的活化區段中的磷酸化位點，所述MAPK蛋白例如在Thrl23上磷酸化的哺乳動物p38，或包含所述磷酸化的殘基的所述蛋白的片段。本發明的MAPK蛋白還能夠被用於分析由活性MAPK介導的所述病理狀態的階段或嚴重性和/或發展，所述病理狀態例如癌症或心臟的、傳染性的、神經的、神經元的、肺的或炎性的疾病。在這種意義上，本發明的MAPK蛋白的檢出表明這類病理狀態的較好的發展。在具體實施方案中，本發明的所述MAPK蛋白是在磷酸化位點磷酸化的哺乳動物p38蛋白，所述磷酸化位點不同於存在於所述哺乳動物p38的活化區段中的磷酸化位點，所述MAPK蛋白例如在Thrl23上磷酸化的哺乳動物p38，或包含所述磷酸化的殘基的所述蛋白的片段。在具體實施方案中，本發明提供用於評價或監控對患有由活性MAPK介導的所述病理狀態的個體進行的治療的效果，或用於分析由活性MAPK介導的所述病理狀態的階段或嚴重性和/或發展的體外方法，其包含a)對來自所述個體的生物樣品中的本發明的MAPK蛋白的水平進行檢測和/或定量；以及b)將所述水平與來自相同個體的對照樣品的水平進行比較。兩個水平之間的比較表明治療的效果和/或病理狀態的發展。為此目的，在該情況下對照樣品是進行治療之前或進行治療之後的一段時間內來自個體的樣品，以分析治療的效果和病理狀態的發展。本發明的所述MAPK蛋白水平(濃度)的檢測和/或定量能夠通過本領域技術人員已知的常M^方法來測定，例如通過免疫化學方法(見下文)。本發明的MAPK蛋白還能夠被用於識別潛在的可用於治療由活性MAPK介導的所述病理狀態的化合物，所述病理狀態例如癌症或心臟的、傳染性的、神經的、神經元的、肺的或炎性的疾病。在這種意義上，防止所述MAPK活化的化合物能夠被用於治療所述心臟的、傳染性的、神經的、神經元的、肺的或炎性的疾病；使本發明的MAPK去磷酸化的化合物也能夠被用於治療癌症，因為對個體進行化學療法或放射療法之後所述MAPKs的活化產生誘導腫瘤細胞死亡的信號。在具體實施方案中，本發明的所述MAPK蛋白是在磷酸化位點磷酸化的哺乳動物p38蛋白，所述磷酸化位點不同於存在於所述哺乳動物p38的活化區段中的磷酸化位點，所述MAPK蛋白例如在Thrl23上磷酸化的哺乳動物p38，或包含所述磷酸化的殘基的所述蛋白的片段，或具有結合於Thrl23或結合於Thrl23區域的周圍區域的化合物，並在Thrl23或在Thrl23殘基的周圍區域模擬磷酸鹽負電荷或大殘基的存在的p38。在具體實施方案中，本發明提供用於識別潛在的可用於治療由MAPK蛋白介導的病理狀態的化合物的體外方法，其包含a)將候選化合物與MAPK蛋白接觸，以及b)檢測所述MAPK蛋白在磷酸化位點的磷酸化，所述磷酸化位點不同於存在於所述MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，以及c)當所用MAPK蛋白是所述蛋白時，分析(i)所述磷酸化位點是否為小鼠p38、a亞型的Thr123，或為另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且(ii)所述不同磷酸化位點上的磷酸化是否防止所述MAPK蛋白的活化；或者i)將候選化合物(即能夠磷酸化所述MAPK蛋白的化合物或模擬所述磷酸化的作用的化合物)與MAPK蛋白接觸；ii)檢測所述MAPK蛋白在所述MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點的磷酸化以測量候選化合物對MAPK活化的效果，或檢測在所述MAPK蛋白上模擬所述磷酸化的作用以測量候選化合物對MAPK活化的效果；iii)分析所述MAPK蛋白在候選化合物存在下對其底物的活性以檢測在竟爭化合物存在下MAPK蛋白對其底物的對接和/或對其底物的活性的可能抑制；以及iv)分析(i)在小鼠p38、a亞型的Thrl23處的所述磷酸化位點(當所用MAPK蛋白是所述蛋白時)是否受候選化合物的影響，並且(ii)所述磷酸化位點中的磷酸化是否防止所述MAPK蛋白的活化。在具體實施方案中，候選化合物可以是能夠磷酸化MAPK蛋白的化合物(如激酶等)或者在與MAPK蛋白接觸時模擬所述磷酸化的作用的化合物。在具體實施方案中，竟爭化合物可以是能夠磷酸化MAPK蛋白的化合物(如激酶等)。能夠通過本領域技術人員已知的任何常規方法測定蛋白的磷酸化以及模擬MAPK蛋白上的磷酸化的效果。已知多種測定蛋白或特定蛋白中被磷酸化的胺基酸殘基磷酸化狀態的測定方法，例如使用放射性標記的ATP的體外激酶活性測定；因此^皮磷酸化並被標記的蛋白的二維電泳(允許分析蛋白中有多少個胺基酸殘基被磷酸化)；預先純化的蛋白的質i普，該蛋白的磷酸化狀態待測；定向誘變，然後用純化蛋白進行體外激酶活性測定；涉及胰蛋白酶消化後磷酸化的蛋白的二維分離的磷酸-肽分析，或技術上最不複雜的Western印跡法，其考慮使用抗所述蛋白的抗體，所述抗體特異性識別蛋白的磷酸化的胺基酸殘基或表位。檢測蛋白中磷酸化的殘基的技術對本領域技術人員是公知的，並被包括在現有技術中。在具體實施方案中，所述MAPK蛋白是p38激酶，例如哺乳動物p38,並且磷酸化在存在於所述哺乳動物p38、a亞型的Thrl23殘基上進行。另一方面，本發明涉及能夠與本發明的MAPK蛋白結合和/或能夠^r測本發明的所述MAPK蛋白的化合物。在具體實施方案中，所述化合物是能夠與本發明的所述MAPK蛋白結合和/或能夠檢測本發明的所述MAPK蛋白的抗體。本說明書中所用的術語"抗體"旨在包括嵌合或重組抗體以及單克隆抗體和多克隆抗體或其蛋白水解片,殳，例如片l爻Fab或F(ab，)2等。此外，編碼抗體的可變區的dna能夠#:插入到另外的抗體中，以通過此方式產生嵌合抗體。簡單鏈抗體(scFv)能夠是由具有抗體的與抗原結合的特徵性能力且包含一對與免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區同源或類似的胺基酸序列(VH-VL或scFv鍵)的簡單鏈形成的多肽。抗體的輕鏈和重鏈可變區的多肽類似物，如果需要，能夠通過連接多肽結合。產生抗體的方法是本領域技術人員公知的，並且被包括在現有技術中。作為示例，本發明提出的抗體是能夠結合和/或檢測本發明的所述MAPK蛋白中存在的表位的抗體。在具體實施方案中，本發明的所述MAPK蛋白是在磷酸化位點中磷酸化的哺乳動物p38蛋白，所述磷酸化位點不同於存在於所述哺乳動物p38的活化區段中的磷酸化位點，例如所述MAPK蛋白是在Thrl23上磷酸化的哺乳動物p38，或包含所述磷酸化的殘基的所述蛋白的片段。在特定實施方案中，所述抗體能夠與包含在哺乳動物p38激酶片段中的表位結合，所述片段包含磷酸化的Thrl23殘基或其它MAPK蛋白中的位置等同的(匹配)殘基。在另一特定實施方案中，所述抗體是能夠與包含SEQIDNO:2中所示的胺基酸序列的表位相結合的抗體，所述表位是進化過程中高度保守的表位，因此所述SEQIDNO:2能夠被認為是不同物種的同源p38蛋白中所述表位的共有序列。在另一具體實施方案中，能夠與本發明的MAPK蛋白結合的所述化合物是在本發明所鑑別的新的磷酸化位點[即小鼠p38、a亞型的Thrl23或另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同是由胺基酸序列的多序列比對所定義的]或在所述位點的周圍區域與所述MAPK蛋白結合的化合物，所述化合物導致MAPK蛋白在活化區段的磷酸化下降，並因此防止其活化和/或其對其底物的活性，例如，在所述磷酸化位點或在所述位點的周圍區域引入負電荷或大殘基的化合物。所述化合物的示例性、非限制性實例包括(i)能夠與p38的對接區域結合併能夠模擬在所述區域中引入負電荷(如磷酸鹽基團)的化合物，如在小鼠p38、a亞型的Thrl23(或在周圍區域)或在另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基處引入負電荷或大殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23或在Thrl23的周圍區域的結合防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)能夠與p38的對接區域結合併能夠模擬在所述區域中引入負電荷(如磷酸鹽基團)的化合物，如在小鼠p38、a亞型的Thrl23或在另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基處引入負電荷或大殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23的結合削弱所述MAPK蛋白對其底物的活性。另一方面，本發明涉及能夠與本發明的MAPK蛋白結合和/或能夠檢測本發明的所述MAPK蛋白的所述化合物在分析個體罹患由活性MAPK介導的病理狀態的風險或易患病體質中的用途，或在評價或監控對患有所述病理狀態的個體進行治療的效果中的用途，或在分析所述病理狀態的階段或嚴重性和/或發展中的用途，以及在識別潛在的可用於治療所述病理狀態的化合物中的用途。另一方面，本發明涉及載體，以下稱為本發明的載體，其包含(i)編碼對磷酸化位點進行磷酸化的化合物的核酸序列，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)編碼防止對磷酸化位點進行磷酸化的化合物的核酸序列，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點；或(iii)對磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(iv)防止對磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點。在具體實施方案中，所述MAPK蛋白是哺乳動物p38激酶並且磷酸化發生在不同於存在於所述哺乳動物p38的活化區段中的一個或多個石岸酸化位點的-粦酸化J立點，例如哺乳動物p38的Thrl23。本發明的載體能夠是病毒載體或非病毒載體，其是本領域技術人員公知的並能夠被用在治療，例如基因療法中。在具體實施方案中，本發明的載體包含編碼對磷酸化位點進行磷酸化的化合物的核酸序列，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、ce亞型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化，或者本發明的載體包含對所述磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thrl23，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化。在所述不同的磷酸化位點的磷酸化對所述MAPK蛋白的活性產生抑制，因此本發明的所述載體能夠被用於治療由活性MAPKs介導的病理狀態。在另一具體實施方案中，本發明的載體包含編碼防止對磷酸化位點進行磷酸化的化合物的核酸序列，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，或者本發明的載體包含防止對所述磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，例如激酶抑制劑，如GRK2激酶抑制劑或使所述磷酸化位點去磷酸化的磷酸酶。由於所述磷酸化位點的磷酸化被防止，MAPK蛋白的活化能夠被促進，當對個體進行放射療法或化學療法之後活性MAPK蛋白的存在導致腫瘤細胞的死亡時，這對於治療癌症能夠引起特別關注。因此，在這種情況下，本發明的載體能夠被用於治療由活性MAPKs介導的病理狀態，尤其是癌症。在本發明載體的特定實施方案中，對不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點的磷酸化位點進行磷酸化的化合物是激酶，或能夠執行所述激酶的特徵性功能的其功能活性片段，例如GRK2激酶或其功能活性片段，其如本發明所示，磷酸化哺乳動物p38,如小鼠p38、a亞型中存在的Thrl23殘基。另一方面，本發明涉及藥物組合物，其包含治療有效量的(i)對磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區^a中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)模擬在磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(iii)防止在磷酸化位點中進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點；或(iv)本發明的栽體；或(v)能夠與本發明的MAPK蛋白結合的化合物，其與所述MAPK蛋白在本發明所鑑別的新磷酸化位點結合，或在所述位點的周圍區域結合，所述化合物導致MAPK蛋白在活化區段的磷酸化減少，並因此防止其活化和/或其對其底物的活性，例如在所述磷酸化位點中或在所述位點的周圍區域引入負電荷或大殘基的化合物；或(vi)能夠與p38的對接區域結合併能夠模擬在所述區域中引入負電荷(如磷酸鹽基團)的化合物，如在小鼠p38、a亞型的Thrl23(或在周圍區域)或在另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基處引入負電荷或大殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23或在Thrl23的周圍區域的結合防止所述MAPK蛋白的活化；或(vii)能夠與p38的對接區域結合併能夠模擬在所述區域中引入負電荷(如磷酸鹽基團)的化合物，如在小鼠p38、a亞型的Thrl23或在另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基處引入負電荷或大殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23的結合削弱所述MAPK蛋白對其底物的活性，以及，任選地，藥物可接受的載體。在具體實施方案中，所述MAPK蛋白是哺乳動物p38激酶並且磷酸化發生在不同於存在於所述哺乳動物p38活化區段中的一個或多個磷酸化位點的磷酸化位點，例如哺乳動物p38的Thrl23上。在具體實施方案中，本發明的藥物組合物包含對不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點的磷酸化位點進行磷酸化的化合物，例如激酶，或能夠執行所述激酶的特徵性功能的其功能活性片段，例如GRK2激酶或其功能活性片段。所述激酶磷酸化哺乳動物p38的Thrl23。在另一具體實施方案中，本發明的藥物組合物包含防止對磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點。在另一具體實施方案中，本發明的藥物組合物包含本發明的載體。為了在預防和/或治療由活性MAPK介導的病理狀態中給藥，活化化合物(包括栽體)被以治療有效量與一種或多種藥物可接受的載體、佐劑或賦形劑一起組方成適當的藥物組合物。用於以任何適當的給藥方法給藥的藥物組合物的實例包括任何固體(如片劑、膠嚢劑、顆粒劑等)或液體(如溶液2、混懸劑、乳劑等)組合物，所迷適當的給藥方法例如口服、皮下、腹膜內、靜脈等，由於待治療疾病通常為慢性的特徵，通常以口服給藥，。在具體實施方案中，所述藥物組合物能夠是口服給藥的固體或液體藥物劑型。口服給藥的藥物劑型的示例性實例包括片劑、膠嚢劑、顆粒劑、溶液、混懸劑等，並且能夠含有常規的賦形劑，例如粘合劑、稀釋劑、崩解劑、潤滑和潤溼劑等，並且能夠通過常規方法製備。還能夠調整藥物組合物以便其以例如無菌的、凍幹溶液、混懸液或任何適當劑型的產品的形式進行腸胃外給藥；在這種情況下，所述藥物組合物將會包括適當的賦形劑，例如緩衝劑、表面活性劑等。在任何情況下，將根據所選的藥物給藥形式選擇賦形劑。不同藥物給藥形式及其製備的綜述能夠在C.FauliiTrillo的"TratadoofFarmaciaGal6nica"，第10版，1993，Luzdn5,S.A.deEdiciones中找到。通常，給予的治療有效量(或載體)取決於被治療的個體、所述個體所患的病理狀態的嚴重性、所選的給藥形式以及其它因素。因此，本發明中所提及的劑量必須僅被視為對本領域技術人員的指導，並且必須根據上述變量調整劑量。然而，能夠以通常25mg/kg/天至75mg/kg/天的每日總量每天一次或多次給予本發明的藥物組合物，例如每天1、2、3或4次。本發明的藥物組合物能夠與其它用於預防和/或治療所述由活性MAPKs介導的病理狀態的另外的藥物一起使用以提供聯合治療。所述另外的藥物能夠形成同一藥物組合物的一部分，或者能夠將其以單獨組合物的形式提供，用於與本發明所提供的藥物組合物進行同時的或非同時的給藥。另一方面，本發明涉及(i)對磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、ce亞型的Thr123,或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)才莫擬在磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thrl23，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(iii)防止在磷酸化位點中進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點；或(iv)本發明的載體；或(v)能夠與本發明的MAPK蛋白結合的化合物，其與所述MAPK蛋白在本發明所鑑別的新磷酸化位點結合，或在所述位點的周圍區域結合，所述化合物導致MAPK蛋白在活化區段的磷酸化減少，並因此防止其活化和/或其對其底物的活性，例如向所述磷酸化位點或所述位點的周圍區域引入負電荷或大殘基的化合物；或(vi)能夠與p38的對接區域結合併能夠模擬在所述區域中引入負電荷(如磷酸鹽基團)的化合物，如在小鼠p38、a亞型的Thrl23(或在周圍區域)或在另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基處引入負電荷或大殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23或在Thrl23的周圍區域的結合防止所述MAPK蛋白的活化；或(vii)能夠與p38的對接區域結合併能夠模擬在所述區域中引入負電荷(如磷酸鹽基團)的化合物，如在小鼠p38、a亞型的Thrl23(或在周圍區域)或在另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基處引入負電荷或大殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23的結合削弱所述MAPK蛋白對其底物的活性，在製備用於治療由活性MAPKs介導的病理狀態的藥物組合物中的用途。在具體實施方案中，所述MAPK蛋白是哺乳動物p38激酶並且磷酸化發生在不同於存在於所述哺乳動物p38活化區段中的一個或多個磷酸化位點的磷酸化位點，例如哺乳動物p38的Thrl23。在具體實施方案中，對不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點的磷酸化位點進行磷酸化的所述化合物是激酶，或能夠執行所述激酶的特徵性功能的其功能活性片段，例如GRK2激酶或其功能活性片段，其磷酸化哺乳動物(小鼠)p38、a亞型的Thrl23。另一方面，本發明涉及包含本發明的MAPK蛋白或如前述的能夠與本發明的所述MAPK蛋白結合和/或檢測本發明的所述MAPK蛋白的化合物的試劑盒。在具體實施方案中，本發明所提供的試劑盒能夠被用於診斷由活性MAPK介導的病理狀態，或被用於測定個體患所述病理狀態的風險或易患病體質，或被用於評價或監控對患有所述病理狀態的個體進行治療的效果，或用於分析所述病理狀態的階段或嚴重性和/或發展，以及用於鑑別潛在的可用於治療所述病理狀態的化合物。在特定實施方案中，所述MAPK蛋白是在哺乳動物p38、a亞型的Thrl23上磷酸化的哺乳動物p38激酶。另一方面，本發明涉及治療由活性MAPK介導的病理狀態的方法，其包含對需要治療的個體給予本發明所提供的藥物組合物。下列實施例舉例說明本發明，並且不旨在限制其範圍。實施例GRK2酶對p38蛋白的Thrl23的磷酸化I.材料和方法產品所用的所有試劑和產品均為分析級。氯化鈉、氯化鉤、氯化銨、氯化錳和氯化鎂、磷酸鈉和磷酸鉀、碳酸鈉、氬氧化鈉、乙酸鈉、蔗糖、尿素、Tris、曱酪、多聚曱醛、甘氨酸、冰乙酸、鹽酸、乙醇、丁醇和甘油均由Merck提供。ATP(三磷酸腺香)、氟化鈉、脫氧膽酸、EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇二(2-氨基乙醚)-N，N，N，,N，-四乙酸)、P-巰基乙醇、DTT(二硫蘇糖醇)、肝素、原釩酸鈉、DMSO(二甲亞碸)、麗春紅(Ponceaured)、HEPES(N-(2-羥乙基)哌溱-N，-2-乙烷磺酸)、NonidetP-40、曲拉通x-100、吐溫-20、抑酶肽、胰蛋白酶抑制劑、疊氮化鈉、蛋白A-瓊脂糖由Sigma提供。PMSF(苯曱基磺醯氟)、苄脒、還原型穀胱甘肽、BSA(牛血清白蛋白)和氨千青黴素和卡那黴素抗生素以及IPTG(異丙基-i3-D-硫代半乳糖苷)得自Roche。TEMED(N,N,N，N-四曱基乙二胺)、SDS(十二烷基硫酸鈉)、過硫酸銨、溴苯酚藍、考馬斯藍、具有已知分子量的預先染色的蛋白標準、硝化纖維紙和布4i福德、i式劑(Bradfordreagent)由Bio誦Rad提供。福4木-喬卡才弟奧i式劑(Folin-Ciocalteaureagent)得自Panreac,TCA(三氯乙酸)得自Carlo-Erba。》文射性[丫-32]ATP同位素由AmershamBiosciences提供，並且曱硫氨酸-半胱氨酸代謝標記混合物["S]由NewEnglandNuclear提供。所用的構建體和質粒本說明書中使用下列質粒G腸-大鼠pCMV-GRK3構建體由瑞士Lausanne大學的S.Cotecchia博士捐贈。誦牛pCDNA3扁GRK2、牛pCDNA3-GRK2-K220R和pCDNA3-GRK5構建體由美國費城ThomasJefferson大學的J.L.Benovic博士的實驗室捐贈。-GRK2的pCEFL-DNAc反義構建體得自C.Shayo博士。-組成型活化的突變體pCDNA3-MKK6j3(E)、pCDNA3-MKK6]S(Glu):MKK6S207E/T211E由CentroofBiologiaMolecularSeveroOchoaf^everaOc/wa為、子J^浙夢^心」(馬德裡)的J.M.Redondo博士提供，其還提供了小鼠pCDNA3-Flag-p38a構建體和pGEX2T-p38a原核表達載體。-用於產生GST融合蛋白的pGEX4T-Mxi2和pGEX4T-Mxi2A17載體由Cantabria大學的P.Crespo博士和V.Sanz博士捐贈。岸它-空pCDNA3載體來自Invitrogen。-質粒pCEFL-EGFP由C.Murga博士(CentroofBiologiaMolecularSeveroOchoa)提供。-pBC12BI-Z52-AR構建體由A.Ruiz-G6mez博士(CentroofBiologiaMolecularSeveroOchoa)捐贈。-Raf-1YY340/341DD突變體由英國格拉斯哥的Beatson癌症研究所的A.S.Dhillon博士提供。-pTrcHisB得自Invitrogen。細胞培養物建i的勿/S,秀使用了數個建立的細胞系HEK293細胞(人胚胎腎)得自Invitrogen,COS-7細胞(綠猴腎細胞)和Sf9(草地貪夜蛾(5^^o/^ra/n/^;/7m^))細胞得自ATCC(美國典型培養物保藏中心)。HEK293和COS-7細胞在單獨的P-IOO、P-60(Falcon)板上或多孑LM6、M12或M24(Falcon,Costar)板上，在補充有2mM穀氨醯胺、10%胎牛血清以及抗生素混合物(50ng/ml慶大黴素、0.01%鏈黴素和0.063%青黴素G)的Dulbecco，s改良的Eagle培養基(DMEM)中單層生長。同樣，使用穩定表達GRK2的、由EBNA(衍生自HEK並用編碼EBNA抗原的質粒轉染)細胞和由抗新黴素的pCDNA3-GRK2載體產生的兩種大規模培養物，因此將其在200/xg/mlgeneticin(新黴素G418，Calbiochem)的存在下培養。得自ATCC的前脂肪細胞細胞系3T3-L1,以及由其產生的穩定系4皮維持在補充有穀氨醯胺和抗生素和10。/o新生牛血清(NCS)的DMEM培養基中。向用pCDNA3-GRK2和用pCDNA3-K220R穩定轉染的群中加入750/xg/mlgeneticin。下文詳細描述了分化成脂肪細胞的條件。所有這些細胞類型均在37°C下在含有5%至7%的C02的潮溼氣氛中孵育。Sf9細胞在3x1S細胞/ml的密度下並在150rpm攪拌下在混懸液中生長，或在P-100或P-150板上在27。C和沒有C02氣氛的條件下在補充有胎牛血清和慶大黴素(50貼/ml)的Grace's培養基(Gibco)中單層生長。使用標準方案得到和保持鼠科巨噬細胞(pacrophage)的原代培養物。基本上，將由MarcCaron博士(杜克大學，北卡羅來納)好意捐贈的3月齡的C57BL/6GRK2+/+和+/-小鼠腹膜內注射巰基乙酸鈉(lml)。4天後，通過用15mlPBS腹膜內洗滌分離腹膜巨噬細胞。在M12板上每孔接種一百萬個細胞，允許其粘附在補充有0.5%FCS的RPMI培養基中，並將其充分洗滌。將得到的巨噬細胞於37。C在潮溼艙內在RPMI0.5%FCS中用詳盡(detailed)濃度的來自E.Coli的LPS(Sigma)刺激16小時。脊染HEK293和C0S-7細胞的瞬時轉染通過Lipofectamine/PLUS方法(Invitrogen)以70%至80%的融合在P-100P-60板中進行。儘管對於諸如Fugene(Roche)、JetPei(PolyTransfection)或Escort-II(Sigma)的試劑使用另外的轉染方案，但最常用的方法是脂轉染胺試劑(lipofectamine)方法。概括地說，轉染前一天通過P-60平板接種1.5乂106個細胞(HEK293)或與所用的板表面成相關比例的數目的細胞。此後，所述方案指P-60板。下一天，製備高純質粒DNA(在Quiagen提供的親和柱中分離並再次懸浮在無菌的超純水中)(在P-60的情況下為3jug至5jiig)、PLUS試劑(對於P-60為8jtd)和OPTIMEM(Gibco，BRL)(對於P-60為250./zl)的混合物(1)，將其在室溫下孵育15分鐘。在每一實驗中，加入需要量的空載體(通常為pCDNA3)以保持每板的DNA總量恆定。以平4亍的方式，在另一試管中，將lipofectamine(對於P-60為12.pl)與OPTIMEM(對於P-60為25Q/il)混合(2),並且也進行孵育。15分鐘後，將(1)和(2)以等份混合，將所製備的混合物繼續孵育15分鐘，並且最後將其傾倒在預先被OPTIMEM(每一P-60為2ml)覆蓋的板上(最終反應混合物對於P-60為0.5ml)。將細胞於37。C在轉染培養基中孵育3小時，然後除去轉染培養基並用補充有10%血清的DMEM培養基代替。下一天，用新鮮培養基取代原培養基並且在為了實驗而處理培養物之前使細胞恢復至少24小時。通常，細胞的處理、收集和溶解發生在轉染之後48小時。GRK2和P38MAPK在GRK2和Flag-p38a結合實驗中，使用1:1:1比率的GRK2(或GRK2-K220R)、Flag-p38a和]32-腎上腺素能受體(通常對於每一p60為在增加GRK2量的過表達測定中，通常接種在6孔或12孔(M6或M12)多孑l板中的HEK293細胞被pCDNA3-Flag國p38a、pCDNA3-MKK6CAM以及被增加量的pCDNA3-GRK2載體轉染(如附圖所示)。通常對於M6使用100ng的Flag-p38仏100ng的MKK6CAM和0至1jug的GRK2。在所有的點，用pCEFL-EGFP來補足DNA總量，且在對照點的情況下，用空pCDNA3代替pCDNA3-MKK6CAM。在M6多孔板中的GRK2反義DNA的轉染中，所用的DNA的量稍微不同150ng的pCDNA3陽Flag-p38a、50ng的pCDNA3-MKK6CAM以及0.5jiig至2/xg的pCEFL-GRK2反義(AS)載體或等量的pCEFL-EGFP。在所有的點中，用空pCEFL載體補足DNA總量。在類似的過表達測定中，用150ng的pCDNA3-Flag-p38aWT或pCDNA3-Flag-p38aT123D和50ng的pCDNA3-MKK6CAM(或空pCDNA3)瞬時轉染M6中的細胞，總是重複兩次。通過電泳後免疫檢測(Western印跡法)用每一情況下指定的特異性抗體分析細胞溶解物(約細胞溶解物總體積的10%)證實了不同蛋白的瞬時表達。在所有情況下，在轉染後48小時對瞬時轉染的細胞進行刺激處理。用不同的試劑刺激後，用冷的磷酸鹽緩衝液鹽水(PBS)洗滌細胞並用刮板收集。收集細胞所用的溶解緩衝液取決於要進行的具體免疫沉澱(參見免疫沉澱部分)。用10j^M異丙腎上腺素(Sigma)於37。C在不含血清的培養基中對HEK293細胞進行刺激。在這些實驗中，在刺激之前將細胞在沒有血清(血清飢餓)的條件下保持2小時，以便將來自血清中存在的化合物的刺激最小化。在細胞培養箱中用0.5MNaCl(Merck)進行刺激15分鐘。脂肪細胞分化用NCS血清的10。/。DMEM培養基進行細胞培養。然而，下文所述的整個分化過程必須在耗盡的(depleted)AXC血清(離子交換樹脂)中進行，耗盡的AXC血清通過使胎牛血清連續在陰離子交換樹脂上和在活性碳上吸附而得到。AXC血清由InstitutoofInvestigacionesBiom6dicas(^:參厓夢^f^T^f)的製備服務(kitchenservice)提供。使細胞生長直至融合，並將其平板接種在(在P-100中5x105)補充有4/aM的生物素(Sigma)的DMEM-10%AXC培養基中。下一天，用新鮮的培養基代替原培養基。使細胞繼續生長3天，直至再次達到融合，該天稱為第"0"天。在分化的第0天，將細胞在含有0.5gM地塞米松(Sigma)、0.5mM3-異丁基-l-曱基黃噤呤(IMBX,Sigma)和1/xM胰島素(Sigma)的培養基中培養，並在該培養基中再保持3天。在第3天，這種開始脂肪生成處理的培養基被補充有4生物素和1/AM胰島素的DMEM-10%AXC取代，在其中發生剩餘的分化，每3天更換培養基。從第6天至第15天，通過用油紅染色來分析脂肪生成，油紅為具有親脂性結構的紅色染料，其與被脂肪細胞積聚在其細胞質中的脂肪滴結合。為此，將細胞用福馬林(3.7%曱趁)固定5分鐘並用冷的PBS洗滌。將其與預先過濾的60:40(v/v)油紅(以0.2%w/v溶於異丙醇)和水溶液孵育。將其用PBS充分洗滌，並且在光學顯微鏡下觀察細胞。在每個實驗板中總共計數25個視野的細胞。突變體產生,威^f傳大多數突變體通過StratageneQuickChange定向i秀變方案產生。衝既括地說，使用熱穩定Pfu作為聚合酶製備反向平行誘變寡核芬酸，下文對於每一具體突變體均指明了反向平行誘變寡核普酸，在熱循環器(AppliedBiosystemsGeneAmp9700)中用其進行聚合酶鏈式反應(PCR)。整體擴增的載體用Dpnl消化以除去黴菌或腸胃外DNA並且將消化產物轉化至感受態細菌中，從中能夠由SIDI(ServicioInterdepartamentalofInvestigaci6n，部間研究月l務)通過用每一類型質粒的特異性引物寡核苷酸(Sp6、T7、T3或用於對克隆在pGEX載體中的蛋白進行測序的特異性引物寡核苷酸)進行測序而檢查突變摻入。p38T123A誦寡核苦酸FWD:5'GTGAAGTGCCAGAAGCTGGCCGACGACCACGTTCAG3'(SEQIDNO:3)畫寡核苦酸REV:5'CTGAACGTGGTCGTCGGCCAGCTTCTGGCACTTCAC3'(SEQIDNO:4)用界定pCDNA3中的p38的ORF(開放閱讀框)的引物核苷酸SP6和T7，或用對AmershampGEX質粒系列進4亍測序的特異性核苷酸測序誘變PCR產物。p38T123D-寡核香酸FWD:5'GTGAAGTGCCAGAAGCTGGACGACGACCACGTTCAG3'(SEQIDNO:5)-寡核芬酸REV:5'CTGAACGTGGTCGTCGTCCAGCTTCTGGCACTTCAC3'(SEQIDNO:6)使用InvitrogenGateway系統產生截短的蛋白GST-280-360p38，其對應於p38a的最後80個胺基酸。這種通過重組酶的多價克隆方法允許感興趣的蛋白或蛋白片段在用於真核和原核宿主且具有數個表位的許多質粒中表達。首先，需要設計允許attB序列併入的寡核苷酸，attB序列為重組酶的標耙並界定待翻i奪的p38a的ORF區域。它們被稱為GTW,得自Gateway。製備寡核苷酸GTW-FWD，使得要翻譯的p38的第一個胺基酸(Ala281，在核苦酸序列中帶下劃線的)與attBl序列符合讀框。寡核苷酸GTW-REV包括翻譯的終止密碼子(也帶下劃線的)。使用質粒pGEX2T-p38a作為PCR的模板。-寡核苷酸GTW誦FWD:5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCTGTCGACCTACTGGAGAAGATG3'(SEQIDNO:7)-寡核苦酸GTW-REV:5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGGACTCCATTTCTTCTTGGTC3'(SEQIDNO:8)將240bpPCR產物克隆到pDONORTM201載體中是通過BP-克隆酶反應(25。C至少1小時)進行的，該反應包括由attB序列介導的PCR產物與pDONOR載體的重組。通過在37。C下加入蛋白酶-KIO分鐘而終止反應。重組產物，DNA，^皮用於轉化DH5a細菌，用卡那黴素選擇。隨後，選擇想要的質粒pDEST15確保克隆於其中的蛋白的原核表達，該蛋白與GST融合，從重組序列至GST符合讀框。(p38的0末端片段也被引入真核表達質粒pDEST27中，但省略了所述結果)。通過使用入門克隆(pDONOR-280-360p38)和載體線性化的pDEST15，並與酶促LR-克隆酶混合物在25。C孵育1小時而進行LR-克隆酶反應。通過將樣品與蛋白酶-K在37。C賻育20分鐘而終止反應，並且在通過用attB寡核苷酸測序而進行相關檢查後，得到的DNA被用於轉化BL21細菌，從中純化GST-280-360p38構建體。對於帶有C-末端組氨酸標籤的MAPKAPK2(MK2)的表達和純化，從PhilCohen博士(英國，蘇格蘭，Dundee大學)得到為了更穩定的表達而刪除了富含脯氨酸的N-末端區域的質粒pFtx5-MK2AN1並用作PCR反應的才莫板，該PCR反應使用引物5，GGGGCCATGGTCAAGTCCGGCC3，(SEQIDNO:9)和5'CCCCCTCGAGGTGGGCCAGAGCCGCAGC3，(SEQIDNO:10)。產物被NcoI-XhoI亞克隆(黑體)到pTrcHis2B載體(Invitrogen)中。純化的重組蛋白和多肽活化MEKK6/MEKK3由Upstate提供。A.Ruiz-G6mez博士由被杆狀病毒中的GRK2構建體感染的Sf9細胞進行了GRK2的純化。根據常規方法從牛視網膜中純化視紫質。這樣得到了製備物，其中視紫質超過蛋白的90%(通過考馬斯藍染色證實)。根據筒單描述的常規方法純化融合蛋白GST-p38、GST-ATF2、GST-MEF2A、GST-Mxi2、GST-MxiA17和GST-280-360p38、GST-p38T123A和p38T123D:所述構建體被轉化至大腸桿菌細菌，並且用IPTG誘導其表達。將細菌沉澱並溶解在pH8的10mMTris-HCl、1%曲拉通X-IOO、2mg/ml溶菌酶和蛋白酶抑制劑中，然後將細菌溶解產物超聲處理並使之澄清。將其上樣到穀胱甘肽-Sepharose4B⑧(AmershamBiosciences)柱中並過柱至少3小時，將柱用PBS洗滌，然後用pH8的50mMTris-HC1、5mM還原穀胱甘肽(Sigma)將蛋白洗脫。在變性聚丙烯醯胺-SDS凝膠中檢查所得蛋白的純度和濃度。在前面的部分中已指明了編碼這些蛋白的質粒的來源，或者如果它們是由本發明人製備的，則在適當的時候指明。特異性p38底物，例如MBP(髓磷脂鹼性蛋白)或PHAS-I(磷酸化的、熱和酸穩定的、被胰島素調節的)分別得自SIGMA和Stratagene。被描述為MAPKs特異性底物的APRTPGGRC肽被用在使用p38激酶的磷酸化反應中，APRTPGGRC肽由CBMSO的ServicioProte6mica(蛋白質組服務)合成。將其溶解在pH7.6的Tris20mM中至0.5mM的最終濃度。通過Bradford方法或通過Lowry等人的方法使用牛血清白蛋白作為構建標準曲線的標準而進行蛋白測定。電泳丙雄凝麼凝魔豕一維凝膠根據Laemmli所述的方法使用SDS-聚丙烯醯胺凝膠，根據實驗要求的解析度丙烯醯胺-二丙烯醯胺百分比的範圍為7%至12%。1吏用下列蛋白作為分子量標準肌球蛋白(200kDa)、p-半乳糖苷酶(l16.25kDa)、磷酸化酶B(97.4kDa)、牛血清白蛋白(66.2kDa)、卵白蛋白(45kDa)、碳酸酐酶(31kDa)、大豆胰蛋白酶抑制劑(21kDa)和溶菌酶(14kDa)(RainbowMarkers,Bio-Rad)。在若干情況下，用考馬斯藍對凝膠進行染色。將蛋白分離後，如果蛋白被[7-"P]ATP所標記則能夠對凝膠進行放射自顯影，或者如果蛋白被["S]-甲硫氨酸標記則能夠對凝膠進行螢光自顯影。在這兩種情況下，均要求在甲醇:乙酸(50:10)中進行20分鐘的固定步驟。在代謝標記中，常常通過與Amplify(Amersham)孵育20分鐘而將信號放大，然後將凝膠乾燥並暴露於100NIF的AgfaCurixRP2X-射線膠片下。二維凝膠為了分析p38中被GRK2磷酸化的底物殘基的數目，將兩種蛋白在下文指明的反應條件下孵育。將得到的磷蛋白在二維凝膠中分離。通過使用兩性電解質的分離混合物(Bio-Rad)，以3-10的最終pH範圍，在具有8M尿素的4%丙烯醯胺-二丙烯醯胺凝膠中進行等電聚焦或第一電泳維度。有時候，可選擇使用預先裝配的Biorad條(IPG條，pH範圍3-10)進行第一維度。在8。/。凝膠SDS-PAGE中進行第二維度，並且通過放射自顯影檢測磷蛋白。核凝的7M￡-銀腐潛凝魔<^泳在0.8-1%水平瓊脂糖凝膠中進行DNA片段的分離。所用的電泳緩沖液是TAE(40mMTris-乙酸，2mMEDTA),並且樣品的上樣(charging)緩衝液是50%甘油、0.4%溴苯酚藍和0.4%二曱苯藍。分子量標準是吞噬細胞和029的HindIII酶消化片段(由CentrodeBiologiaMolecular(分子生物學中心)的發酵服務提供)。蛋白質組測序所關注的翻譯後修飾的位置的確定由CardiovascularNetwork的ServiciodeProte6micadelNodoUAM(馬德裡自治大學)(UAMNode蛋白質組月良務)進4亍，CardiovascularNetwork淨皮包4舌在ServiciodeProte6micadelCentrodeBiologiaMolecular"SeveroOchoa"中(http:〃www.cbm.uam.es/mkfactory.esdomain/webs/CBMSO/plt_Servicio—Pagina.aspxIdServicio=29&IdObjeto=118)。對樣品進行電泳分離(SDS-PAGE8%)並將凝膠染色。將待分析的條帶從聚丙烯醯胺凝膠上切下，並進行胰蛋白酶消化(Promega的胰蛋白酶)。通過MALDI-TOF(基質輔助的雷射解吸/離子化-飛行時間，Broker的Autoflex型號)分析胰蛋白酶肽的混合物。概括地說，各種類的肽通過結晶吸附在基質上，然後通過雷射短脈衝的入射將其以質子化形式釋放。這種樣品離子化的方法與飛行時間分析器結合。單負載的肽有效地獲得與其質量成比例的動力學能量，並且"飛行"通過真空管直至撞擊檢測器。在MALDI-TOF型的質i普儀-裝備有反射器的Bruker的autoflex型號中直接分析少量(0.5jiil)的消化物的上清液，使用DHB(2，5-二羥基苯甲酸)作為基質和Anchor-Chip表面(Bruker)作為樣品架。得到的譜圖最終根據質荷比(m/z)與分離的肽對應。比較了GST-p38和GRK2磷酸化的GST-p38的片段譜圖，並發現了候選肽。為了證實該指示，對樣品進行另一類光鐠分析，其允許得到單個肽的片段鐠圖(MS/MS):電噴霧/質譜-離子阱ES/MS-IT，Thermo-Finnigan的Deca-XP型號(SanJos6,California,USA)。離子化之前，由於後者能夠在毛細管中進行，即用液體樣品，通過RP-HPLC(反相高壓液相色語)將候選肽(先前被MALDI-TOF"懷疑的")分離。使用內徑為180/xm的柱(0.18mmx150mmBioBasic18RP柱，Thermo-Keystone)、1.5gl/m的流速、使用"金屬針工具包(metalneedle-kit)"界面(Thermo-Finnigan)的微噴霧模式、5%至60%溶劑B的梯度將肽洗脫(90分鐘)。色譜與離子阱質i普儀連接。在該片段化方法中，對樣品施加強電場，結果是產生帶電的液滴，在蒸發溶劑後，帶電液滴成為與樣品混合物的肽對應的發射的離子。這些離子能夠是多質子化的，優選地在N-末端末梢處以及在組氨酸、精氨酸和賴氨酸殘基中。離子阱分析器產生三維電場，其允許通過離子噴霧電離而分離離子。因此，最終得到片段語圖或MS/MS語圖，當在"SIM"(單離子監測)模式下工作時，所述鐠圖限於候選肽的片段譜圖。在高靈敏度模式或"SIM"模式下分析樣品，監測下列m/z:937.51和977。51。在對"推測"磷酸化的肽的片段系列進行理論預測之後，b和y"系列的數個酶被確定至得到的譜圖。免疫方案表I顯示所用的第一抗體。^豕^的^瘦檢W""義瘦伊遂減『e^em伊遊法"J將待分析的樣品(純化的蛋白、溶解產物或亞細胞部分等)與商購的分子量標準(Bio-Rad)—起在SDS-聚丙烯醯胺凝膠中分離。通過在碳酸鹽糹爰沖液(3mMNa2C03、10mMNaHC03、20%甲醇，pH約為10)中進行液體轉移75分鐘(在50V，在12x14cm凝膠、使用Bio-RadTrans-BlotCell的情況下，或者在30V、120分鐘)將這樣分離的蛋白轉移至硝化纖維素濾膜(Bio-RadTransblot)。在用麗春紅對硝化纖維素膜進行染色後，將其於4。C在補充有5%的5。/。脫脂奶粉(Molico)或5%的BSA的TBS基質(10mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl)中孵育過夜，目的為封閉可能的非特異性結合位點。丟棄封閉基質之後，將膜與相應的、在1%TBS-BSA中稀釋的抗體(表I)接觸。在與1:50,000稀釋的第二抗體(當第一抗體為多克隆時為與過氧化物酶結合的家兔抗免疫球蛋白，並且對於單克隆抗體第二抗體為小鼠抗免疫球蛋白，二者均為得自NordicImmunology)孵育之前，將膜用至0.15%的conTBS-吐溫20洗滌三次(3x10分鐘)。最後，為了顯影而使用化學發光方法，其中過氧化物酶在H202(ECL，Amersham)存在下催化魯米諾底物的氧化。通過被曝光膠片的雷射密度測定進行定量(MolecularDynamics300A計算光密度計)。由PacificImmunology使用鼠科p38a的肽QKLpTDDHVQFLIYC作為免疫原在家兔中產生多克隆抗磷酸化Thrl23p38血清，然後通過兩次連續通過肽和抗磷酸化肽親和柱進行純化。抗-His抗體購自Sigma。都定p3S和五及《的活'/i通過免疫檢測方法對由不同活化刺激引起的轉染的p38和轉染的ERK的活性程度進行測定。特異性抗體僅與磷酸化的和活化的這些激酶形式反應(分別為抗磷酸化p38和抗磷酸化ERKs)(參見表I的描述)。HEK293細胞，通常經過飢餓(不含血清的培養基)不同時間在p38的情況下為2小時並且在ERK的情況下為整夜，然後被刺激，在處理溶解產物細胞之後，用兩種蛋白的活化區段的磷特異性抗體進行磷蛋白的免疫檢測。在顯影此第一免疫檢測之後，用緩衝液2%SDS、100mM/3-巰基乙醇、62.5mMTris-HCl、pH6.7釋放免疫複合物並用總抗p38和抗ERK抗體進行膜的再孵育。在雷射光密度計中進行條帶的定量。在所有情況下，相對細胞中表達的p38或ERK的總量對用抗磷酸化蛋白抗體檢測到的條帶所得到的值進行歸一化。這樣，表示了不同激酶的刺激相對於基線條件的增加。然而在某些情況下，假設第一顯影有幹擾第二顯影的風險，則通過分別顯影的兩張不同膜的光密度測定來評價活化，一張用磷特異性抗體顯影，另一張用抗總蛋白的抗體顯影。將要進行免疫沉澱的總樣品或細胞溶解產物稀釋在補充有蛋白酶抑制劑(STI大豆胰蛋白酶抑制劑)和苯曱脒100/xg/ml、PMSF200/xg/ml和抑酶肽10p/ml的不同緩沖液中。如下文詳細說明的，緩衝液根據每一情況下所用的抗體而變化。在所有情況下，允許溶解在攪拌和4。C下發生至少1小時後，將樣品離心(24000xg)並取部分(約10%)以證實特定蛋白的表達。向剩餘樣品中加入BSA(500Mg每一p60)和每一情況下相應量的抗體。所有免疫沉澱均在4°C下進行過夜。下一天，根據抗體是多克隆的還是單克隆的分別加入30pl的50%蛋白A-瓊脂糖(Sigma)或蛋白G-瓊脂糖(Zymed)，並將其在4。C再孵育卯分鐘。若抗體共價結合在樹脂上則省略該步驟，而是加入5-10]Ltl的"免疫樹脂"。通過離心分離收集免疫複合物並且在棄去上清液後，用10-15ml的洗滌緩衝液洗滌3-5次(800xg,5分鐘)。若免疫沉澱的目的是磷酸化反應，則將其用不含ATP的相同的孵育緩衝液再洗滌兩次(2x10-15ml)。將免疫沉澱的蛋白重新懸浮在電泳裂解緩沖液中，並且通常將其煮沸5分鐘，用於後來將全部樣品上樣到適當百分比的SDS-聚丙烯醯胺凝膠中。RIPA(放射免疫沉澱測定)緩沖液該增溶緩衝液被廣泛使用，尤其是在GRKs的免疫沉澱中300mMNaCl、20mMTris-HClpH7.5、2%諾乃洗滌劑P-40、1%脫氧膽酸和0.2%SDS。"M2抗flag"免疫沉澱緩衝液對於用M2抗flag抗體進行的免疫沉澱，將細胞收集於pH7.4的10mM磷酸鈉緩沖液(由0.1MNaHP04和NaH2P04的母溶液製備)、150mMNaCl和1。/。正十二烷基-(3-D-麥芽糖苷。溶解後，用由20mMTris-HCl;150mMNaCl和蛋白酶抑制劑形成的鹽水緩衝液將其補足至300/il(每一p60板)。最後，將免疫沉澱物在由下列形成的緩衝液中洗滌50mMTris-HClpH7.5、20mMMgCl2、1%曲拉通X-IOO、1mMEDTA、1mMMgCl2、15mMNaF、20mM焦石粦酸鹽。潛合遂i^^^發按照標準程序對蛋白GST、GST-p38wt、GST-p38T123A和GST-p38T123D進行細菌表達並使用穀胱甘肽-瓊脂糖4B(GE畫Amersham)進4亍分離(Murga，C."a/.Highaffinitybindingofbeta-adrenergicreceptorkinasetomicrosomalmembranes.ModulationoftheactivityofboundkinasebyheterotrimericGproteinactivation腎上腺素能受體激酶與微粒體膜的高親和性結合。通過異三聚體G蛋白活化調節結合激酶的活性).JBiolChem271,985-994(1996))。使用Probond樹脂(Invitrogen)，按照生產商的說明純化His-MAPKAPK2。MKK6cAM購自UpstateBiotech。持續振蕩下，於30。C將每一圖的圖例中詳細說明的量的蛋白在結合緩衝液(25mMTrispH7.5、0.25MNaCl、10mMMgCl2、5mMNaF和0.5%BSA)中孵育30分鐘。加入ATP(50^M)以進行MAPKAPK2潛合遂應一實驗。將沉澱用含有0.5%曲拉通X100的相同緩衝液洗滌三次(10ml)。將沉澱的複合物用SDS-PAGE分離並通過Western印跡法顯影。磷酸化測定蛋冷的沐斧礴^^p38被GRK2磷酸化將重組GST-p38和GRK2(二者均為25-150nM的等摩爾量，除了在計算動力學參數的實驗中，其中指定了濃度)在p38磷酸化緩沖液(25mMHepespH7,5、10mM乙酸鎂、50ATP、2000-3000cpm/pmo1[7-32P]ATP)中以40jLil的最終體積孵育。通常，磷酸化反應在30°C進行30分鐘。在二維電泳或樣品用於蛋白質組測序的情況下，反應延長至1小時或2小時。化合物肝素和SB203580(Calbiochem)，分別為GRK2和p38抑制劑，將其以IC50十倍的濃度使用以確保對各自激酶的完全抑制，即，對於肝素為1.5/xM並且對於SB為0.5pM。所用的底物對於p38是MBP(14/ig每點)或PHAS-I,其最終濃度為25ng/^il,對於GRK2是酪蛋白(7.5/ig每點)。磷酸化終止後的樣品處理與前述情況相同，除了在8%凝膠(SDS-PAGE)中進行蛋白分離。在30°C將與GST融合的蛋白p38a、Mxi2、Mxi2A17和280-360p38(每一蛋白均為0.5/ig)與重組GRK2(200nM)在磷酸化緩沖液(25mMHepespH7.5、10mM乙酸4美、50/aMATP、2000-3000cpm/pmo1[y32P]ATP)中孵育30分鐘。其中包括肝素(150nM)作為特異性GRK2抑制劑。通過加入含有SDS的裂解緩衝液來終止反應。用8%SDS-PAGE分離樣品。為了確保包含相同量的蛋白，首先將其通過考馬斯藍染色在凝膠中觀察。然後，將凝膠千燥並檢測摻入蛋白的放射性("P)。如前述產生並純化在假設的被GRK2磷酸化的位點(T123)的精確p38突變體，並且在p38磷酸化緩衝液(25mMHepespH7.5、10mM乙酸鎂、50/xMATP、2000-3000cpm/pmol|>32P]ATP)中以40]td的最終體積用GRK2進行磷酸化。GRK2和p38亞型的相對濃度(10-80nM)如附圖所示變化。p38被MKK6^^^磷酸化用融合蛋白GST-p38WT、GST-p38T123A和GST-p38T123D(150nM)作為重組MKK6CAM(40ng)(UpstateBiotechnology)的磷酸化底物進行體外磷酸化測定(25mMHepespH7.5、10mM乙酸鎂、15mmNaF、50/iMATP和1000-2000cpm/pmol[7-32P]ATP)。如前述情況中使反應在30°C進行30分鐘並將蛋白在8%SDS-PAGE凝膠中分離。為了確保包含相同量的蛋白，將其通過考馬斯藍染色在凝膠中觀察。然後，測定每一p38亞型中摻入的放射性。APRTPGGRR肽被p38磷酸化用M2抗Flag瓊脂糖對HEK293、Flag-p38a細月包進行免疫沉澱。將免疫沉澱物用10-15ml的M2緩衝液洗滌三次並用相同體積的磷酸化平衡緩衝液(15mMNaF、25mMHepespH7.5和10mM乙酸鎂)洗滌兩次。最後一次洗滌中，將免疫瓊脂糖複合物重新懸浮在lml的緩衝液中並分離每一點的10%(100/xl)以對照Flag-p38的免疫沉澱。用剩餘的免疫沉澱的Flag-p38進行激酶測定，使用APRTPGGRR肽作為底物。在由25mMHepespH7.5;10mM乙酸鎂、15mMNaF、50/MATP和500-1000cpm/pmol|>32P]ATP和1-2mM的底物肽所形成的磷酸化緩衝液中以25]til的最終體積進行反應。當指出時，將SB203580以0.5AtM的最終濃度體外加入。允許磷酸化在30°C進行30分鐘，然後通過加入15pi的30%TCA而終止。通過離心(25,000xg，15分鐘，4。C)使蛋白沉澱並從每一反應中收集含有磷酸化的肽的上清液。將正方形(1cmx1cm)WhatmanP81紙切片用肽溶液浸漬。將其晾乾，用75mM磷酸充分洗滌並通過Cerenkov對摻入被吸附肽的放射性進行定量。在每一情況下，p38對該肽的活性是指在僅對應該肽的點所檢測的基線(或背景)活性。ATF2和MEF2A底物被p38鱗酸化與GST結合的ATF2和MEF2A形式被用於檢測GST-p38的催化活性。在大多數情況下，使用2jug我們自己生產的GST-ATF2或GST-MEF2A。磷酸化條件與前述情況下相同。然而，在另外的場合，如附圖中貼切指出的，使用0.2/ig的底物，並且僅允許磷酸化反應進行15分鐘。序列比較;Mi,秀/^源參和亞型的^對家腫瘤學研究中心)的Perdiguero博士用ClustalX程序(httt):〃www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/)進行多序列比對並通過引入空位進4亍手工調整。數據的數學和統計分析實驗進行至少兩次，並且通常數據點重複兩次或3次。數據表示為平均值與平均值的標準偏差(土SEM)。假定激酶的Michaelis-Menten行為以計算酶促反應的動力學常數。用"Kaleidagraph"程序作圖，其算法能夠導出動力學參數Michaelis-Menten常數(Km)和最大速率(Smax-So(每分鐘每mg酶摻入的P043-nmol數))。通過"雙邊學生t檢驗"(雙尾的)和n-l自由度進行統計分析，其中零假設是在我們希望確定其統計顯著性的情況或條件與基線或對照條件之間沒有顯著差異。在每一情況下得到的對應符合零假設的概率(p)的值的範圍是pO.OOl至p0.0001，如圖所示。II.結果GRK2和p38MAPIC之間的功能相關性p3S被G及尺24#凝必本發明人研究了控制GRK2的活性調節及由MAPK調節其表達的機理，這是由於考慮到GRK2及其底物受體在心臟生理學和諸如高血壓、充血性心力衰竭或心絞痛的心血管疾病的病因中的顯著影響；並考慮到p38MAPK模塊在心肌的發展及其後續功能中的重要性。在充血性心力衰竭中，升高的GRK2水平和p38的失活之間存在負相關。此外，在炎症型疾病，例如類風溼性關節炎中GRK2的水平下降。隨後，本發明人決定研究GRK2和p38之間可能的相互作用。第一實驗步驟是兩種蛋白的磷酸化測定。圖1，圖A，顯示GRK2磷酸化p38。為了排除在某種程度上由於GRK2的存在而造成的p38自體磷酸化的可能性，在磷酸化測定中包括廣泛用作GRK2抑制劑的肝素(16ng//d)，預先確定肝素不影響p38的催化活性。同一圖顯示GRK2的催化活性伴隨p38的較小磷酸化，因此GRK2的Ser/Thr激酶活性是造成放射性標記摻入GST-p38的直接原因。用GRK2對GST的磷酸化作為陰性對照並通過檢查GST部分和p38的ORF之間的結合區域完成這些實-瞼。最近的出版物描述了p38被其與TAB1的相互作用刺激而自體磷酸化；在磷酸化測定中包括了吡咬基咪唑SB203580,它是p38的特異性ATP的竟爭性抑制劑。圖1的圖B顯示SB203580抑制劑在p38對p38的通用底物如MBP(髓磷脂鹼性蛋白)的催化活性中的影響。考慮到p38a的基線活性是微不足道的，未觀察到MBP的顯著磷酸化但即4更如此4全測到SB203580的抑制。接下來的兩條泳道顯示吡。定基。米唑不影響GRK2的激酶活性。最後，放射自顯影的最後兩條泳道顯示p38的自體磷酸化活性在GRK2的存在下增加。所述這些實驗的最終結論是p38在體外被GRK2磷酸化。為了4企查磷酸化沒有發生在能夠^皮諸如MKK3和MMK6的p38活化激酶(MAPKK)磷酸化的殘基中，在冷條件下(換句話說，不具有sin[，"P]-ATP)進行磷酸化反應，並且使用磷特異性抗體抗P-p38進行免疫檢測(圖1，C部分)。該抗體識別p38的蘇氨酸180或酪氨酸182中的序列中的磷酸化表位。在下圖中能夠觀察到，僅重組蛋白MKK6的存在引起了磷p38被所述抗體的識別。在上圖中，用識別GST的抗GRK2抗體斥企測總蛋白(以觀察GST-p38)。這些實-驗顯示GRK在不同於T180的殘基上磷酸化p38。G7^2",者弄力禪凝必-反應動力學參數的研究顯示，這些表明反應在體內發生。圖l顯示磷酸化的動力學特徵。起初，進行時間進程反應實驗(圖D)，其中顯示迅速檢測到磷酸化(5分鐘後)，估計達到最大磷酸化的50%的平均時間為15分鐘。GRK2是能夠磷酸化諸如微管蛋白、突觸核蛋白和光子轉導蛋白(phosducin)的數種非顆粒化底物的選擇激酶。GRK2對其底物顯示的親和力是不同的。因此，對於突觸核蛋白和P-微管蛋白，取決於二者的亞型，Km為約U/xM。對於p38，Km-80nM(參見圖1，圖E的表)，更接近於對GRK2的其它生理學底物的值，所述底物例如光子轉導蛋白和類似於光子轉導蛋白的蛋白(PhD和PhLP，Km為40nM至100nM)或m2-毒蕈鹼受體。通過Cerenkov的至少三次定量發現的化學計量值為0.4-0.8molPi/molp38,這顯示存在^皮GRK2磷酸化的位點。Gi^O和;^S初i羋刀，承^於浚動W。GRK2與數種涉及信號傳導和細胞轉運的蛋白相互作用。因此，GRK2與Goq、G/^、PI3Ka和7、網格蛋白、GIT(GRK相互作用蛋白)和小凹蛋白(caveolin)以及其它分子相互作用，其相互作用引起對其活性的調節(如磷脂、Ca^-4丐調蛋白、激酶等)。GRK2是模塊化激酶並且其催化活性受其不同結構域之間的分子內反應限制。因此，為了觀察其與p38結合的能力，通過用j32AR受體刺激引起其活性構象的獲得，由此產生的p38活化4艮少見。使用淨皮編碼iS2AR受體、Flag-p38和GRK2的質粒瞬時轉染的HEK293細胞。將細胞飢餓過夜後，用濃度為10/xM的異丙腎上腺素激動劑刺激。在這些條件下，免疫沉澱在免疫沉澱物中檢測到GRK2激酶，並且|32AR受體的刺激增強該效果(圖2，圖A)。如形成圖2的不同部分所示，在暴露於異丙腎上腺素中5分鐘後得到最大結合。另一方面，觀察到兩種激酶之間的結合不是必須由仏AR的刺激產生，因為它們在基礎條件下(O分鐘)也發生共免疫沉澱。在圖A中，包括了抗Flag免疫沉澱的非特異性拖動(drag)對照(Cneg)以及證實了p38的另一顯著刺激(NaCl)不觸發該結合。最後，顯示了在這些條件下p38活化的水平。這些首先顯示了異丙腎上腺素對p38的活化不是很強，其次顯示了p38與GRK2的結合越多則活化越小。進行了"相反的"免疫沉澱測定，即在相同的細胞體系中，但使用抗GRK2抗體以4企測免疫沉澱中的p38。在B部分中，觀察到p38和GRK2依賴於激動劑而相互作用(5分鐘的異丙腎上腺素)。C部分證實了通過降低GRK2的濃度，仍回收了與Flag-p38結合的GRK2。同樣，被激動劑刺激後5分鐘發現結合增加。在D部分中，研究了p38與無催化活性的GRK2突變體，K220R共免疫沉澱的能力。能夠，見察到，在GRK2-K220R和GRK2-WT的相似的表達水平(參見第三幅圖)，突變體不僅能夠本身更大程度地與p38結合而且其相互作用似乎不依賴刺激。G及《2的i^表這學瓶p3S被M尺尺6邀凝活/麼的然力。檢測了p38和其最常用的活化劑之一，MKK6之間的界面。為了限制和切斷可能的交叉活化，使用了該MAPKK的組成型活化突變體，MKK6CAM。圖3，A部分包括了HEK293細胞瞬時轉染實驗的代表性圖，其中增加劑量的pCDNA3-GRK2質粒與Flag-p38和MKK6CAM均是過表達的(始終用pCDNA3-GFP補足DNA總量)。觀察到當越多的GRK2在細胞中表達時，依賴於MKK6CAM的p38活化下降越多。過表達使得對相同細胞的結果的評價是可靠的。當然，由於只進行了Flag-p38的免疫4企測，所以選擇了轉染細胞(並因此受GRK2和MKK6CAM的影響)並忽略了其它的影響。另一方面，在每一情況下這些細胞中的內源p38均很難檢測。使用了表達固定量GRK2的細胞，兩種穩定表達不同量GRK2的HEK293群，其中瞬時引入編碼Flag-38和MKK6CAM(或其對照)的DNA。結果列於B部分，並且該結果顯示，在該體系中，再次觀察到p38被MKK6CAM活化的能力下降。GRK2的過表達降低p38對肽底物的激酶活性。隨後，檢測了受p38活化劑MKK6CAM刺激以及受增加劑量的GRK2刺激的p38對外源底物的催化活性。因此，將HEK293細胞在含血清的培養基中放置發生最佳表達所需的天數；作為其結果，GRK2能夠被血清中存在的因子例如LPA等刺激，其信號來自GPCRs。收集細胞，並且使被結合在瓊脂糖樹脂上的單克隆抗flag抗體識別的Flag-p38激酶從中免疫沉澱。在每一點(始終重複兩次)，保留等份的免疫沉澱用於通過免疫檢測檢查其量(參見圖4的B部分中的插圖)。然後在肽底物APR上的磷酸化反應中檢測經重複洗滌的免疫沉澱。該肽被如此命名是因為其序列的開頭三個胺基酸，其對應於MBP的殘基94至102,並因該肽具有這些酶的磷酸化共有序列而在先前被用於檢測MAPK活性。A部分包括溶解產物對照，其表明了在那些條件下GRK2的表達水平和p38達到的活化狀態。B部分的分析允許得出不同的結論。第一是免疫沉澱的p38的催化活性在每一點與其各自的活化狀態相關，用A中的抗磷酸化p38抗體檢測，並且其特徵在於被GRK2的過表達減弱。第二是Flag-p38被存在於培養基中的血清刺激後也具有與肽底物APR相比不顯著的催化活性。因此，這些水平被當作是圖解定量的參考。最後應該強調，APR肽的磷酸化嚴格依賴於p38，這是由於其明顯被SB203580抑制。G/K2水乎的T犖眾存;3S被M^:^6c蕭^強她活化。為了確認上述的結果，進行了相反的實驗。換句話說，GRK2是否消45J也影響p38活性。獨立於其對GPCRs的激酶活性，GRK2水平的下降應允許相同背景中MKK6cAM導致更強的抗磷酸化p38信號。使用HEK293細胞進行針對GRK2的增加量的DNA反義(AS)瞬時轉染(圖5A，左邊部分)，其平行對照是相同量的編碼GFP的質粒(C)。圖中顯示代表性實驗的圖。對於GRK2水平，根據所用的DNA劑量得到平均20%至50%的下降。這些數據確認了從先前的GRK2過表達實驗中推斷的結果，即細胞中GRK2的量越少，p38被MKK6cam的活化越強。附上該影響的圖解估計代表(圖5A，右邊部分)。p38的活化水平(抗磷酸化p38/抗p38)指在每一條件下的基線活化或者為GRK2的更大降低(AS)，或者為GFP的更大降低(C，對照)。在這些相同實驗中，在基線條件下評價Flag-p38的活化。p38a的靜止活性，即不存在MKK6CAM時的活性通常是微不足道的。它能夠通過免疫檢測被檢測到，通過在化學發光顯影中進行長時間曝光(參見圖5，B部分中的"過度曝光，，)。因此，如能夠觀察到的，p38的活化譜，在非共轉染MKK6cam的條件下，模擬受到該組成型活化突變體活化的p38的語。按照所述變量之一的消除，與p38的不穩定活化有關的MKK6cAM的過表達、受總GRK2的較高或較低水平的存在影響的p38基線活性的數據是更定量的。因此，在下方圖中表示了不存在MKK6cAM的情況下從對Flag-p38a的活化進行定量得到的數據。在DNA反義的每一點中將p38的活化與GFP的平行對照相關聯，得到p38在更少的GRK2存在下作為其細胞活化劑的最佳底物的顯著趨勢(圖5，B部分的圖)。因此，通過星號指示的顯著性是指與其代表性GFP對照相比，在DNA反義的每一點的統計學t學生^r^r中得到p<0.05的值的事實。遞i^減返的溝建沐對;M^被G/K24f凝化的在^迷/f的定在^/^S-G及《2哞涉及三i^潛V々^;t子。Mxi2是可供選擇的p38的加工變體，其C末端不同於p38a的C末端。Mxi2是最初由雙雜交實驗中分離用於與蛋白Max相互作用的蛋白。從胺基酸1至280,其與p38a相同，但它具有含17個完全不同殘基的C末端(參見圖6中的圖解)。除Mxi2之外，使用了截短的突變體MxiA17(與p38aA80精確對應)以確定p38的C末端的任何絲氨酸或蘇氨酸是GRK2的磷酸化的標靶。通過標準蛋白純化方法得到融合蛋白並檢測其與p38a相比作為GRK2底物的能力(圖6，A部分)。對於可比量的p38a、Mxi2和MxiA17，後兩者不能被GRK2磷酸化。此外，在Mxi2和MxiA17中能夠淨皮辨別的石壽酸化痕跡比相應於p38a在肝素存在下的磷酸化的痕跡淡。圖中還包括了這些激酶中每一種的自體磷酸化對照。考慮到這些結果，產生和純化p38a序列的最後80個胺基酸，也與GST融合。通過QuickChange誘變方案製備該構建體，並隨後在Gateway的el多價體系中包括編碼GST-280-360p38a的DNA片段。令人驚奇地，將融合蛋白純化並檢測其抗GRK2之後，沒有得到任何磷酸化的痕跡。這些結果顯示於圖6的B部分。這些顯示了使用比GST-MxiA17和GST-p38a更大量的GST-280-360p38a(WB抗GST，下圖)，對於GST-280-360p38a和GST-MxiA17均沒有得到磷酸化，而對於GST-p38a則得到磷酸化。從該數據推斷，對於被GRK2識別以及後來的磷酸化，需要在蛋白p38aWT中存在，而在其截短的N-和C-末端部分不存在的結構決定子。G及尺2^卓個/4'差丄4fp3S。在證實了前述確定被GRK2磷酸化的殘基的方法的不足之後，通過蛋白質組技術尋找殘基。為了確定計算出的化學計量數僅對應磷酸化位點，通過二維電泳分離GRK2和p38的磷酸化測定，其結果示於圖7的A部分。在第一電泳中，利用了摻入磷醯基後蛋白等電點的變化，而在第二電泳中，按照常規SDS-PAGE根據其質量將蛋白分離。僅在對應於GRK2存在下的磷酸化的圖中能夠觀察到對應於GST-p38的強放射性條帶。類似地，在該圖中，能夠辨別出擴散的痕量"P，表明GRK2的多重自體磷酸化。在包4舌在ServiciodeProte6micaoftheCentrodeBiologiaMolecularSeveroOchoa中的CardiovascularNetwork的ServiciodeProte6micadelNodoUAM中(http:〃www.cbm.uam.is/mkfactorv,esdomain/webs/CBMSO/pltServicioPagina.aspxIdServicio=29&IdObieto=118)，鑑別了翻譯後小務飾。通過比較GST-p38以及被GRK2磷酸化的GST-p38的片段圖語，在胰蛋白酶消化和MALDI-TOF質鐠分析後，在磷酸化的樣品中觀察到肽的存在，其質量可相當於在各自樣品中檢測到的另一肽的質量加80Da。有效地，觀察到了較弱但是獨有地存在被GRK2磷酸化的樣品，具有磷酸基的翻譯後修飾的該肽(1954.330=1874.326+80)。該圖(圖7的B部分)包括該譜圖區域的放大，其中檢測到該推定的磷酸化載體的痕跡，在材料和方法部分提供了全圖。質i普的詳細分析使得筌別了用胰蛋白酶消化得到的4美選肽LTDDHVQFLIYQILR。為了證實該指示，將候選肽通過HPLC分離，並進行更精細的i瞽圖分析電噴霧/質譜-離子阱(IS/MS-IT)，獨立地監控對應於先前所發現的肽的離子。結果首先顯示了來自高壓液相色語的、關於兩種樣品中監控的肽的洗脫時間信息。觀察到被GRK2磷酸化的肽更早離開，這是由於色譜的原理，其通過疏水性分離肽，極性較小的肽更保留。第二，顯示了兩種肽的片段圖語和為所得到的肽分配系列。該分析允許識別候選肽LTDDHVQFLIYQILR的蘇氨酸作為磷酸化的載體。在圖8中，對應於各自樣品中不同種類的肽的總質量的峰被突出顯示為黃色並且對應於磷酸化樣品和非磷酸化樣品的語圖之間的差別種類的938.3Da峰被突出顯示為橙色。譜圖分析和蛋白質組方法的最後結論是GRK2在p38上的磷酸化是在p38a序列的蘇氨酸123上產生的。的H^^爽f銀乂G7^:2碌磁化為了證實被GRK2磷酸化的靶殘基，產生了兩種在T123上的p38a突變體。突變體p38aT123A代表不能被GRK2磷酸化的p38形式，而突變體p38aT123D，由於天冬氨酸的負電荷以及側鏈的長度，模擬蘇氨酸123的組成型磷酸化的形式。純化融合蛋白GST-p38c《T123A和GST-p38aT123D並被GRK2磷酸化，始終以蛋白p38aWT作為對照(圖9，A部分)。在底物相對於激酶的低濃度且等摩爾濃度下，證實了兩種突變體均不是GRK2底物，這證實了蘇氨酸123作為所述磷酸化底物的身份。圖的A部分還包括了通過用抗p38抗體的免疫檢測定量的p38總量的對照。B中包括了帶標尺的p38a的代表性圖解(Swiss-Prot資料庫的登記號為Q16539,www.expasy.org)，其中應該強調大的激酶結構域，包括幾乎全部蛋白。稱為CD的小區域位於蛋白的末端，並形成兩種底物以及p38活化劑的CommonDocking結構域，並且觀察到它介導MAPK家族中的蛋白-蛋白識別。p38結晶與來自MKK3和MEF2A的肽的分析允許改正對該對接槽的描述並使其完美。"3^^亞^之河和浙神之河葛,/^伊的嫂差。圖IO顯示本發明人製備的不同p38蛋白的序列的兩個比對。在上圖中，比較了不同物種的p38的a亞型(Swiss-Prot資料庫中的MK14):鯉魚(C》，;n'聰scar;zo)(鯉魚，MK14A一CYPCA:Q90336)、黑腹果蠅CDmso;/n7ame/awogaWer)(果蠅，MK14A_DROME:062618)、非洲爪蟾(Jfewop^/aevh)(非洲爪蟾，MK14—XENLA:P47812)、黑猩猩(屍a"frag/o辦&力(黑猩猩，MK14—PANTR:Q95NE7)、犬(Cams/am"/fl〃"(犬，MK14—CANFA:002812)、智人(Womoj印ze朋)(人，MK14—HUMAN:Q16539)、小家鼠(M"sw附cw/w)(小鼠，MK14—MOUSE:P47811)和褐家鼠(ia""s"c^veg!'a^)(大鼠，MK14—RAT:P70618)。使用簡單的顏色代碼以區分出p38之間相同的胺基酸(黃色)、與共有序列相同的非常保守的胺基酸的直系同源物(藍色)、與共有序列等價的非常保守的胺基酸的直系同源物(綠色)。剩餘的非保守的殘基保持為白色。允許更大可變性的區域精確地是p38的激酶結構域之外的區域，其中強調CD結構域位於其中的C末端區域；由於建立與底物的鹼性胺基酸、活化劑、去活化劑的靜電相互作用，該結構域的酸性胺基酸允許其識別。所有比對的p38a的序列中T123的位置用紅色橢圓突出顯示。不僅在幾乎所有亞型中存在蘇氨酸123，而且當其不出現時，在其位置發現能夠被同樣磷酸化的絲氨酸。此外，通過酸性胺基酸排列的區域在所有的直系同源物中均是保守的，所述區域被認定為形成被GRK2磷酸化的共有序列。隨後，研究了本發明人描述的調節是否對p38的所有四種顯著的亞型a、j8、7和S都是普遍的。為此，預先比對了包含酵母菌的p38亞型的殘基120至140的區域白色念珠菌(Cam/zWaa/^ca""的H0G1(Q92207)、釀酒酵母(Sacc/k^o附j;cMcereWw'ae)的HOG1(P32485)、粟酒裂殖酵母(5W^cwacc/wramj;c^/7owZ^)的Styl(Q09892);人、小鼠、大鼠和非洲爪蟾的p38的7亞型(比對中的亞型MK12,P53778、008911、Q63538、P47812);人、黑猩猩、小鼠和大鼠的p38的S亞型(亞型MK13:分別為比對中的015264、Q9N272、Q9Z1B7和Q9WTY9);果蠅的p38的兩個亞型(MK14_DROME，062618和061443),人和小鼠的j3亞型(|32不同於起初分離的0，前者不具備後者中存在的通過八個胺基酸的選擇性加工的插入。0亞型是少數並因此4艮難分離，i3形式通常被認為是|82變體)(MK11:Q15759、Q9WUI1);以及最後爪蟾(Xe"o;M力、鯉魚(C^Wm^)(先前包括在比較中的亞型MK14A以及亞型MK14B，Q9I958)、黑猩猩、狗、人、小鼠和大鼠的a亞型(MK14)。在所有這些中，甚至那些來自酵母菌的亞型之間的高度保守是很驚人的。關於所討論的蘇氨酸(人p38a的T123)，能夠說，發現它，以及它周圍的胺基酸，在脊推動物中甚至在後生動物中是保守的，在所述周圍的胺基酸中發現酸性殘基D和E。因此，即使比對在該殘基的精確位置受到打斷，p38的S亞型仍然是保守的。包括在該比對中的在同源背景中缺少絲氨酸或蘇氨酸的唯一亞型是人p38。物(小鼠)p38、a亞型的Thrl23上的磷酸化防止Thrl80和Tyrl82殘基上的磷酸化)，以及在Thrl23或在Thrl23的周圍區域進行磷酸化或引入負電荷或大殘基能夠防止p38對其底物的對接及其對其底物的活性的事實具有重要的生物學意義，其可用於診斷由活性MAPK介導的病理狀態，或用於確定個體患所述病理狀態的風險或易患病體質，或用於評價或監控對患有所述病理狀態的個體進行治療的效果，或用於分析所述病理狀態的階段或嚴重性和/或發展，以及用於識別潛在的可用於治療所述病理狀態的化合物，以及其它應用。在這種意義上，本發明的MAPK蛋白可起重要的作用。術語"個體"包括任何動物物種，包括人；以示例的方式，所述個體能夠是哺乳動物，例如人、家畜、齧齒動物等，優選任何年齡和種族的男人或女人。本文所用的表達"由活性MAPK介導的病理狀態"包括任何病理狀態，其中涉及活性MAPK或者活性MAPK起某種作用，所述活性MAPK即在存在於活化區段中的磷酸化殘基上磷酸化的MAPK。由活性MAPK介導的所述病理狀態的示例性、非限制性實例包括癌症和心臟的、傳染性的、神經元的、肺的和炎性的疾病。所述疾病的示例性、非限制性實例包括心肌梗塞、肥大、高血壓、心肌炎、血管成形術談發的病變、心肌功能障礙、病毒或細菌感染、神經元死亡或其它細胞類型的死亡、阿爾茨海默病、銀屑病、類風溼性關節炎、自體免疫神經炎、克隆病、癌(腫瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤等)、血凝塊形成、對化學治療劑和放射治療劑的反應、對缺血/再灌的反應等。因此，本發明的MAPK蛋白是可用作診斷標記或用作個體對由活性MAPK介導的病理狀態具有易患病體質的標記的蛋白，所述病理狀態例如癌症或心臟的、傳染性的、神經的、神經元的、肺的或炎性的疾病。由於活性MAPK的存在與上述由活性MAPKs介導的病理狀態相關，本發明的MAPK蛋白的檢出表明對於患所述病理狀態的較低風險或易患病體質，因為在本發明鑑定的磷酸化位點中的磷酸化，或在所述磷酸化位點或在所述位點的周圍區域中引入負電荷或大殘基會防止所述MAPK的活化。在具體實施方案中，本發明的所述MAPK蛋化，但它對所檢測的兩種底物的激酶活性下降。本發明人決定稍多地仔細研究這種p38Tcd23A和p38aWT之間的差別效應，因此本發明人集中關注了它們各自的基線活性，即不存在活化激酶MKK6時對MEF2A的活性(圖12，B部分)。在有足夠底物和長時間暴露的條件下可以評價p38的基線活性並且可以檢查T123中的各自的突變體是否具有比野生型激酶更小的基線活性。p38Tcd23A的行為介於p38aWT和p38Tcd23D之間。因此，與最初實驗所顯示的相比，突變體p38Tal23A在更嚴格的酶促條件下(底物少10倍以及15分鐘的磷酸化；圖12的圖C)與p38aWT有更大的催化差別。/^S772^D傳具才凝瓶的被A^《6c詹^位;'f化的錄力。該結果平行地提供與HEK293細胞中的最初數據一致的解釋，並在此相同的系統中被確證。首先，通過PCR在真核細胞中產生表達pCDNA3-Flag-p38T123D突變體。然後，按照類似於在HEK293中過表達GRK2或降低GRK2表達的實驗方法，將Flag-p38WT和Flag-p38T123D與活化劑MKK6cam—同梓染。圖13中的圖通過將較顯示其顯著的下降。在細胞中p38T123D的活化比野生型激酶的活化更不容易發生。該圖中還包括了由這些實驗提供的免疫檢測的示例性圖。在圖14中，通過體外結合測定使用純化的蛋白分析了底物(MK2)和活化劑(MKK6)與p38或其T123中突變體的結合。如圖所示，T123D突變體與MK2或MKK6結合的能力相對於T123A突變體或野生型蛋白被顯著削弱。G7W^岸炎源，應4,謬"f的;C^嚴細/《373-ZJ,秀的為V麼。使用前脂肪細胞系3T3-L1作為研究p38被GRK2調節的細胞模型。這些結締組織細胞具有有趣的特性，當受到特定的刺激時，其中突出的是胰島素，它們在約兩周的處理結束時獲得脂肪細胞表型。通過脂肪液滴的積累能夠很容易辨別該分化，所述脂肪液滴被紅色親脂性染料染色並且其佔據了3T3-L1的幾乎全部細胞質。除了最傳統的細胞應激響應之外，p38的生理學功能之一是其在分化過程中的作用。在3T3L1結締組織細胞的特定情況下，基於向脂肪細胞的分化被SB203580阻斷並且MKK6CAM的存在是足夠的，證明了p38的作用。轉錄因子C/EBP(CCAAT/增強子結合蛋白)和PPAR(過氧化物酶體增殖物活化受體7)，其表達在分化過程中變化，似乎被p38調節。更明確地，猜想C/EBPj8被p38磷酸化，而p38又僅在分化的最初步驟中才是活化的，它可能促進PPAR和受其控制的脂肪細胞標誌物的後來的表達。為了研究GRK2對3T3L1的脂肪細胞分化的可能影響，產生了被質粒pCDNA3-GRK2和pCDNA3-GRK2K220R穩定轉染的細胞系，提供對新黴素的抗性。相應地確認了與細胞系3T3L1相比GRK2水平在兩種情況下均有效過表達(圖15的插圖中的窗口)，然後按照標準方案引發了分化。當不存在脂肪生成刺激時，3T3L1細胞具有結締組織細胞(對應於3T3L1中的對照的照片)清楚地轉變為脂肪細胞表型的健康外觀，如紅色油脂液滴以及這些細胞獲得的圓形形態所顯示(3T3L1中+胰島素的照片)。對於穩定的GRK2，每一視野的脂肪細胞數目明顯少於具有內源水平的該激酶的結締組織細胞的情況。並且對於3T3L1-K220R細胞，其成脂效應顯著高於對照細胞。因此GRK2抑制胰島素介導的脂肪細胞形態的獲得，而K220R刺激脂肪細胞形態的獲得。此外，由於加入藥理學抑制劑SB203580逆轉整個脂肪生成，因此該效應依賴於p38。此外，當不進行分化處理的板被保留作為實驗的內部對照時，穩定的K220R會發生比其它細胞更強的向脂肪細胞的自發轉變。三個細胞系中每一個的每一視野中脂肪細胞數目的計數被標明在圖的右側。所述視野被理解為每一p100或p60中用光學顯微鏡觀察的區域。通常在每一板中對多至總共25個隨機視野進行計數。對於成對的數據(每一穩定的細胞系與3T3L1比較)通過學生t檢驗計算數據的顯著性(pO.OOl)。從圖16和17的數據得出下列結論針對在T123中磷酸化的p38的肽而產生的多克隆抗血清能夠識別在體外被GRK2磷酸化的p38蛋白，而不識別被MKK6在其它殘基上磷酸化的p38蛋白，並且這種識別對於T123殘基是特異性的，因為T123A突變體不能被該抗體免疫才企測。此外，GRK2的過表達能夠促進該表位;故該抗體免疫檢測的增加，而當GRK2失活突變體(K220R)被過表達時信號降低。表Itableseeoriginaldocumentpage68tableseeoriginaldocumentpage69權利要求1.MAPK蛋白，選自a)在磷酸化位點中包含磷酸化的殘基的MAPK蛋白，或是包含所述磷酸化的殘基的所述蛋白的片段，所述磷酸化位點不同於存在於所述MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中-所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、α亞型的123位的蘇氨酸殘基(Thr123)，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對來定義，並且-在所述不同的磷酸化位點的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化及其對其底物的活性；以及b)在磷酸化位點或所述磷酸化位點的周圍區域包含負電荷或大殘基的MAPK蛋白，或包含所述磷酸化的殘基的所述蛋白的片段，所述磷酸化位點不同於存在於所述MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中-所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、α亞型的123位的蘇氨酸殘基(Thr123)，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對來定義，並且-向所述磷酸化位點或所述磷酸化位點的周圍區域引入負電荷或大殘基防止所述MAPK蛋白的活化及其對其底物的活性。2.如權利要求1所述的蛋白，其中所述MAPK蛋白選自任何物種的ERK、JNK和p38蛋白激酶以及它們各自的亞型。3.如權利要求1或2所述的蛋白，其中所述MAPK蛋白是哺乳動物p38。4.如權利要求3所述的蛋白，其中所述MAPK蛋白是小鼠p38、a亞型，並具有SEQIDNO:1所示的胺基酸序列。5.如權利要求1所述的蛋白，其中所述MAPK蛋白包含活化區段，所述活化區段選自-包含通式(I)胺基酸三聯體的活化區段Thr-Xaa-Tyr(I)其中Thr是蘇氨酸，Tyr是酪氨酸，並且Xaa是胺基酸的殘基，優選是選自天冬氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸和脯氨酸的胺基酸的殘基；以及-包含式(II)的胺基酸三聯體的活化區段Ser-Glu-Gly(II)其中Ser是絲氨酸，Glu是穀氨酸，並且Gly是甘氨酸。6.如權利要求1所述的蛋白，包含如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列。7.權利要求1的蛋白在診斷由活性MAPK介導的病理狀態，或在確定個體患所述病理狀態的風險或易患病體質，或在評價或監控對患有所述病理狀態的個體進行治療的效果，或在分析所述病理狀態的階段或嚴重性和/或發展，以及在鑑定潛在的可用於治療所述病理狀態的化合物中的用途。8.如權利要求7所述的用途，其中所述由活性MAPK介導的病理狀態包括癌症和心臟的、傳染性的、神經元的、肺的和炎性的疾病。9.用於在個體中4全測由活性MAPK介導的病理狀態，或用於分析個體患由活性MAPK介導的病理狀態的風險或易患病體質的體外方法，其包含a)對來自所述個體的生物樣品中的權利要求1至6中任一權利要求所述的MAPK蛋白的水平進行檢測和/或定量；以及b)比較所述水平與對照樣品的水平，其中所述水平相對於對照樣品的水平的下降表明個體患由活性MAPK介導的所述病理狀態的風險。10.用於評價或監控對患有由活性MAPK介導的所述病理狀態的個體進行的治療的效果、或用於分析由活性MAPK介導的所述病理狀態的階段或嚴重性和/或發展的體外方法，其包含a)對來自所述個體的生物樣品中的權利要求1至6中任一權利要求所述的MAPK蛋白的水平進行檢測和/或定量；以及b)將所述水平與來自相同個體的對照樣品的水平進行比較。11.用於鑑定潛在的可用於治療由活性MAPK介導的病理狀態的化合物的體外方法，其包含a)將候選化合物與MAPK蛋白接觸，以及b)檢測所述MAPK蛋白在磷酸化位點的磷酸化，所述磷酸化位點不同於存在於所述MAPK蛋白的活化區IS:中的一個或多個磷酸化4立點，以及c)(i)當所用MAPK蛋白是所述蛋白時，分析所述磷酸化位點是否為小鼠p38、a亞型的Thr123，或為另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且分析(ii)在所述不同的磷酸化位點中的磷酸化是否防止所述MAPK蛋白的活化；或者i)將選自能夠磷酸化所述MAPK蛋白的化合物或模擬所述磷酸化的作用的化合物的候選化合物與MAPK蛋白接觸；ii)檢測所述MAPK蛋白在所述MAPK蛋白的活化區段的一個或多個-岸酸化位點的磷酸化以測量候選化合物對MAPK活化的影響，或檢測模擬在所述MAPK蛋白上所述磷酸化的效果以測量候選化合物對MAPK活化的影響；iii)分析所述MAPK蛋白在候選化合物存在下對其底物的活性以檢測在竟爭化合物存在下MAPK蛋白對其底物的對接和/或對其底物的活性的可能的抑制；以及iv)分析(i)在小鼠p38、a亞型的Thrl23處的所述磷酸化位點(當所用MAPK蛋白是所述蛋白時)是否受候選化合物的影響，並且(ii)所述磷酸化位點中的磷酸化是否防止所述MAPK蛋白的活化。12.化合物，其能夠與權利要求1至6中任一權利要求所述的MAPK蛋白結合和/或能夠檢測權利要求1至6中任一權利要求所述的所述MAPK蛋白。13.如權利要求12所述的化命物，其特徵在於其是-抗體5或-能夠與權利要求1至6中任一權利要求所述的MAPK蛋白結合的化合物，所述化合物與所述MAPK蛋白在小鼠p38、a亞型的Thr123，另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基結合，所述位置等同是由胺基酸序列的多序列比對所定義的，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23的結合導致所述MAPK蛋白在所述活化區段的磷酸化下降並因此防止其活化和/或其對其底物的活性；或-能夠與p38的對接區域結合併能夠模擬在所述區域中引入負電荷的化合物，所述化合物在小鼠p38、a亞型的Thrl23或其周圍區域，或在另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基處引入負電荷或大殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23或在Thrl23的周圍區域的結合防止所述MAPK蛋白的活化；或-能夠與p38的對接區域結合併能夠模擬在所述區域中引入負電荷的化合物，所述化合物在小鼠p38、a亞型的Thrl23處，或在另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基處引入負電荷或大殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23的結合削弱所述MAPK蛋白對其底物的活性。14.如權利要求13所述的化合物，其中所述抗體是能夠與包含SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的表位結合的抗體。15.如權利要求12至14中任一權利要求所述的化合物在分析個體患由MAPK介導的病理狀態的風險或易患病體質，或在評價或監控對患有所述病理狀態的個體進行治療的效果，或在分析所述病理狀態的階段或嚴重性和/或發展，以及在鑑定潛在的可用於治療所述病理狀態的化合物中的用途。16.載體，其包含(i)編碼對磷酸化位點進行磷酸化的化合物的核酸序列，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點上的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)編碼防止對磷酸化位點進行磷酸化的化合物的核酸序列，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點；或(iii)對磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(iv)防止對磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點。17.藥物組合物，其包含治療有效量的(i)對磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thr123,或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點中的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)模擬在磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(iii)防止在磷酸化位點中進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點；或(iv)權利要求16所述的載體；或(v)能夠與權利要求1至6中任一權利要求所述的MAPK蛋白結合的化合物，所述化合物與所述MAPK蛋白在小鼠p38、a亞型的Thrl23，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基處結合，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23的結合導致所述MAPK蛋白在所述活化區段的磷酸化降低，並因此防止其活化和/或其對其底物的活性；或(vi)能夠與p38的對接區域結合併能夠模擬在所述區域中引入負電荷的化合物，所述化合物在小鼠p38、a亞型的Thr123，或在其周圍區域，或在另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基處引入負電荷或大殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23或在Thrl23的周圍區域的結合防止所述MAPK蛋白的活化；或(vii)能夠與p38的對接區域結合併能夠模擬在所述區域中引入負電荷的化合物，所述化合物在小鼠p38a亞型的Thrl23，或在另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基處引入負電荷或大殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23的結合削弱所述MAPK蛋白對其底物的活性，以及，任選地，藥物可接受的載體。18.如4又利要求17所述的組合物，其包含激酶。19.如權利要求18所述的組合物，其中所述激酶是GRK2激酶或其功能活性片段。20.下列化合物在製造用於治療由活性MAPKs介導的病理狀態的藥物組合物中的用途(i)對磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點中的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(ii)模擬在磷酸化位點進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區段中的一個或多個磷酸化位點，其中所述不同的磷酸化位點是小鼠p38、a亞型的Thr123，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且在所述不同的磷酸化位點中的磷酸化防止所述MAPK蛋白的活化；或(iii)防止在磷酸化位點中進行磷酸化的化合物，所述磷酸化位點不同於存在於MAPK蛋白的活化區,史中的一個或多個磷酸化位點；或(iv)權利要求16所述的載體；或(v)能夠與權利要求1至6中任一權利要求所述的MAPK蛋白結合的化合物，所述化合物與所述MAPK蛋白在小鼠p38、a亞型的Thrl23，或另一MAPK蛋白中易於磷酸化的位置等同的胺基酸的殘基處結合，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23的結合導致所述MAPK蛋白在所述活化區段的磷酸化降低，並因此防止其活化和/或其對其底物的活性；或(vi)能夠與p38的對接區域結合併能夠模擬在所述區域中引入負電荷的化合物，所述化合物在小鼠p38、a亞型的Thr123，或在其周圍區域，或在另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基處引入負電荷或大殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23或在Thrl23的周圍區域的結合防止所述MAPK蛋白的活化；或(vii)能夠與p38的對接區域結合併能夠模擬在所述區域中引入負電荷的化合物，所述化合物在小鼠p38、a亞型的Thr123,或在另一MAPK蛋白中位置等同的胺基酸的殘基處引入負電荷或大殘基，所述位置等同由胺基酸序列的多序列比對所定義，並且所述化合物在所述磷酸化位點Thrl23的結合削弱所述MAPK蛋白對其底物的活性。21.試劑盒，其包含權利要求1至6中任一權利要求所述的MAPK蛋白，或權利要求12至14中任一權利要求所述的能夠與所述MAPK蛋白結合和/或檢測所述MAPK蛋白的化合物。22.如權利要求21所述的試劑盒，其用於診斷由活性MAPK介導的病理狀態，或用於確定個體患所述病理狀態的風險或易患病體質，或用於評價或監控對患有所述病理狀態的個體進行治療的效果，或用於分析所述病理狀態的階段或嚴重性和/或發展，以及用於鑑定潛在的可用於治療所述病理狀態的化合物。23.如權利要求21或22所述的試劑盒，其中所述MAPK蛋白是在哺乳動物p38、a亞型的Thrl23上石壽酸化的哺乳動物p38激酶。全文摘要發現了絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的新的磷酸化位點。在所述磷酸化位點磷酸化的MAPKs能夠被用作由MAPKs介導的病理狀態的診斷標記。文檔編號C12N9/12GK101233228SQ200680027312公開日2008年7月30日申請日期2006年6月9日優先權日2005年6月10日發明者佩德羅·曼努埃爾·坎波穆埃拉斯,克裡斯蒂娜·穆爾加蒙特西諾斯,桑德拉·佩雷格林佩德裡克,瑪麗亞·胡拉多普埃約,費德裡科·馬約爾梅嫩德斯申請人:馬德裡自治大學