一種改進的拮抗細菌生物測定方法
2023-05-04 02:33:06 3
專利名稱：：一種改進的拮抗細菌生物測定方法
技術領域：
：本發明
技術領域：
屬於農學門類，植物保護一級學科下設的植物病理學二級學科，更具體涉及一種生物農藥研製和開發中所必須的拮抗細菌生物活性測定方法。
背景技術：
：1、生物防治在可持續農業的發展中發揮著越來越重要的作用。生物防治的一個重要內容就是利用微生物防治病害，有益微生物中用於研究防治植物真菌病害較多的是細菌，如芽孢桿菌屬(Bacillussp)和假單孢桿菌屬(Pseudomonassp)的一些種，人們通常稱之為拮抗細菌或生防細菌，眾多研究證明一些細菌對植物病原真菌生長具有較強的抑制作用，與病菌對峙培養，能表現出明顯的抑菌帶，其代謝物質能引起病菌菌絲消解和細胞內溶，能抑制病菌菌絲生長和孢子萌發，在病害防治中顯示出較好的生防效果。2、在拮抗細菌的篩選過程中，拮抗細菌對病原菌的生物測定方法具有至關重要的作用，它是生物農藥研製和開發必不可少的一個重要環節。目前採用的生物測定方法通常有拮抗菌與病菌之間平板對峙培養法；菌體直接作用測定法、三明治法；拮抗細菌無菌發酵液(細菌過濾器過濾、高溫滅菌)抗菌能力測定法，其中又包括發酵液混於培養基中抑制病菌菌落生長測定法、發酵液抑制孢子萌發測定法、發酵液管碟法、發酵液濾紙片法等。我們經過多年的實驗研究發現，這些方法在使用過程中存在著明顯的局限性。(1)平板對峙法，拮抗細菌與病菌之間平板對峙培養法，通常在兩者之間會形成一明顯的抑菌帶(約3mm18mm)，此法操作比較簡便，適合於拮抗細菌的初篩，但拮抗細菌形成的抑菌帶大小不僅與拮抗細菌自身分泌的代謝產物抑菌活性有關，還與菌株代謝產物在培養基上擴散能力有關，人們採用平板對峙法通常以抑菌帶寬度值作為評價拮抗菌株抗菌能力的指標,而保留抑菌帶寬度值大的菌株，淘汰抑菌帶寬度值小的菌株。我們由此會失去一個因分泌的代謝產物在培養基擴散能力差，而代謝產物抑菌活性強的好菌株。現實中生物農藥的研製常常是利用菌株代謝產物的抗菌特性。因此採用此法，並不能真正反應出拮抗細菌潛在的抗菌能力。再者用此法試驗穩定性、重複性差，同一拮抗細菌點接後，菌落大小並不完全一樣，抑菌帶寬度值因而也會出現差異。(2)菌體直接作用測定法，通常是在平板上塗抹拮抗細菌菌液(菌苔稀釋液或含菌體的發酵液)，或利用拮抗細菌菌液與培養基混合制平板，然後在含拮抗菌的平板上接入病菌塊，測定病菌菌落生長直徑，採用此法，細菌可快速佔領平板培養空間，對病菌生長影響極大，生測效果不明顯，無法真實反應出細菌代謝產物的抗菌活性。(3)三明治法，在兩層培養基中間為一層培養基與拮抗菌菌液(含活菌體)的混合體。然後在上層培養基中接入病菌塊，但此法在製作上層培養基的過程中容易使中間層培養基的菌體攜入，從而影響拮抗細菌對病菌菌落的生物活性測定。而且在培養過程中拮抗細菌是在中層培養基缺乏氧氣的條件下生長，勢必影響細菌代謝產物的正常分泌。(4)拮抗細菌無菌發酵液抗菌能力測定法，包括發酵液混於培養基中抑制病菌菌落生長、發酵液抑制病菌孢子萌發，發酵液濾紙片法、發酵液管碟法等，通常用此法評價拮抗細菌發酵液的抗菌活性，但是在製備拮抗細菌無菌發酵液過程中常採用細菌過濾器過濾獲得無菌濾液，在操作上不方便，易造成汙染，且費用較高，而採用高溫滅菌法製備的無菌濾液可能導致發酵液中部份不耐高溫的代謝物失活，影響拮抗菌發酵液真實抗菌能力的發揮。此外，採用拮抗細菌無菌發酵液抗菌能力測定法還受於拮抗細菌發酵培養液培養過程中、細菌培養液培養無菌過濾和檢測等諸多因素的制約，達不到快速大量測定的目的。發酵液濾紙片法，作用效果不明顯，濾紙片風乾時易汙染。含發酵液培養基法，由於添加不同濃度的發酵液於培養基中，一定程度上會影響培養基的營養成份和凝固性，從而影響菌的正常生長。發酵液管碟法，加樣量少，受管底和管壁的作用，一定程度上會影響細菌發酵液的擴散方向和擴散量，生測時形成的抑菌斑不規則，從而影響試驗結果的準確性，操作上複雜、耗時耗財。
發明內容本發明的目的提供一種改進的拮抗細菌生物測定方法，解決和克服拮抗細菌生物測定其它方法中的不足，如操作上複雜、耗時耗財，試驗真實性、穩定性、重複性、準確性差等問題，根據拮抗細菌及其代謝分泌產物等特點，而提供一種操作簡便、快速、材料便宜、來源方便、實驗周期短、試驗真實性、穩定性、重複性好的拮抗細菌生物測定新方^^——雙層培養基濾紙夾心法，可達到真實合理評價拮抗細菌生防效果的目的，本方法適用於多種拮抗細菌抗菌譜研究，可對多種病原菌(如枯萎病菌、稻瘟病菌、炭疽病菌、玉米紋枯病菌、花生青枯病菌、柑桔潰瘍病菌等)進行生物活性測定，對研究拮抗細菌代謝分泌產物生防穩定性(常溫存放、紫外線照射)也具有很好的效果。本發明的新方法對合理評價拮抗細畲的生防效果、篩選有應用價值生防菌株具有重要的作用。本發明的改進的拮抗細菌生物測定方法，採用雙層培養基濾紙夾心法，將一定濃度細菌培養液或菌苔稀釋液均勻塗抹於上層培養基中，拮抗細菌在上層培養基生長產生的代謝分泌物會通過濾紙層均勻擴散到下層培養基中，移去濾紙及其攜帶的上層培養基，下層培養基即為含拮抗細菌代謝分泌產物的平板，易於進行對多種病原真菌菌絲生長、孢子萌發及細菌生長的生物測定。本發明的顯著優點是本發明利用拮抗細菌代謝分泌產物在培養基的擴散性(拮抗細菌代謝分泌產物在含瓊脂培養基的擴散距離通常為3~18mm)、利用廉價濾紙良好的滲透性、利用細菌菌體在培養基生長不透性等原理，進行拮抗細菌對植物病原真菌生物測定方法改進和創新。該方法測定周期約為7天，測定過程中利用拮抗細菌代謝分泌產物在培養基的自然均勻擴散性，病菌菌落在含拮抗細菌代謝分泌產物的培養基上生長規則，避免了因菌株代謝產物在培養基上擴散能力差異、菌株發酵液培養和過濾等問題而帶來試驗結果的誤差。採用雙層培養基濾紙夾心法在檢測過程中耗費的試材量少，由此法獲得的拮抗菌株生物測定結果同利用細菌過濾器獲得的拮抗細菌無菌發酵濾液(以20%~50%劑量添加至病菌培養基中)進行生物測定獲得的評價結果較為吻合。實施雙層培養基濾紙夾心法能真實反應菌株代謝產物抗菌能力，具有試驗穩定性好、重複性好、材料便宜、來源方便、操作簡便等優點，適用於多種拮抗細菌抗菌譜研究，可對多種病原菌(如枯萎病菌、稻瘟病菌、炭疽病菌、玉米紋枯病菌、花生青枯病菌、柑桔潰瘍病菌等)進行生物活性測定，對研究拮抗細菌代謝分泌產物生防穩定性(常溫存放、紫外線照射)也具有很好的效果。本發明的新方法對合理評價拮抗細菌的生防效果、篩選有應用價值生防菌株具有重要的作用。並且本發明的方法可同時完成多個拮抗細菌的抗菌譜測定，具有新穎性、實用性和創造性，作為一種新的拮抗細菌生物測定方法，具有潛在的應用價值。圖1是本發明的應用技術路線流程圖。圖2是本發明的技術原理圖。圖3是本發明的幾種拮抗細菌對香蕉枯萎病菌離體抑菌活性生物測定過程圖，其中A部分是注無菌濾紙模製作用直徑為12cm的濾紙(如高速101型)平鋪於直徑為切8.9cm玻璃培養皿中，超出寬度約1.5cm的濾紙邊緣使之皺褶，並置於平皿中高壓滅菌，無菌濾紙平板模成形備用；B部分是注在下層培養基上移入濾紙模在直徑為8.9cm玻璃培養皿中加入10ml的下層培養基，厚度為3~4mm,凝固後，在下層培養基上方移入無菌濾紙模，敏褶處貼於培養皿皿壁，平板處浸溼並緊貼於培養基；C部分是注在濾紙模上制上層培養基在無菌濾紙模上加入10ml的細菌培養基為上層培養基，凝固後待用，上層培養基通過濾紙模與下層培養基分隔；D部分是注培養待測拮抗細菌吸取細菌液(一定濃度含細菌菌體培養液)均勻塗抹於上層平板中，於適宜細菌生長的條件下培養(如28'C，黑暗)，培養48h後，在下層培養基上標記上層培養基上均勻長滿拮抗細菌的範圍；E部分是注下層培養基培養香蕉枯萎病菌拮抗細菌培養48h後，細菌分泌的代謝產物會通過濾紙層向下層培養基均勻擴散，移出含上層培養基的濾紙，下層培養基作為對目標病菌的生物測定試材，在含細菌分泌的代謝產物的下層培養基中央接入待測病菌，於病菌適宜生長的條件下培養。病菌生長適宜天數後，在試驗下層培養基中測量病原真菌菌落直徑。真實評價拮抗細菌對病菌的生測效果，正確篩選出抑菌效果好的拮抗菌株。圖4是示枯草芽孢桿菌、菌株l、2、3、4、5與香蕉枯萎病菌對峙培養(7d)圖。圖5是香蕉枯萎病菌在含33。/。菌株1、2、3、4、5培養濾液的PDA平板中生長情況(7d)圖。圖6是香蕉枯萎病菌在含菌株1、2、3、4、5代謝產物的PDA平板中生長情況(7d)圖。具體實施例方式(1)製作適合病原真菌生長的下層培養基和適合拮抗細菌生長的上層培養基。(2)製作無菌濾紙平板模用直徑為12cm的濾紙(如高速101型)平鋪於直徑為8.9cm玻璃培養皿中，超出寬度約1.5cm的濾紙邊緣使之皺褶，並置於平皿中高壓滅菌，無菌濾紙平板模成形備用。(3)製作下層培養基:在直徑為8.9cm玻璃培養皿中加入10ml的下層培養基，厚度為3~4mm，凝固後待用。(4)移入無菌濾紙模在下層培養基上方移入無菌濾紙模，皺褶處貼於培養皿皿壁，平板處浸溼並緊貼於培養基。(5)製作上層培養基在無菌濾紙模上加入10ml的細菌培養基為上層培養基，凝固後待用，上層培養基通過濾紙模與下層培養基分隔。(6)培養待測拮抗細菌吸取10(^1細菌液(一定濃度含細菌菌體培養液)均勻塗抹於上層平板中，於適宜細菌生長的條件下培養(如28'C,黑暗)，培養48h後，在下層培養基上標記上層培養基上均勻長滿拮抗細菌的範圍。(7)移出無菌濾紙模拮抗細菌培養48'h後，細菌分泌的代謝產物會通過濾紙層向下層培養基均勻擴散，移出含上層培養基的濾紙，下層培養基作為對目標病菌的生物測定試材。(8)培養目標病原真菌在含細菌分泌的代謝產物的下層培養基中央接入待測病菌，於病菌適宜生長的條件下培養。(9)試驗結果測量病菌生長適宜天數後，在試驗下層培養基中測量病原真菌菌落直徑。以不接種拮抗菌的處理為空白對照，計算病原菌生長抑制率。(10)篩選拮抗細菌通過實驗結果分析比較拮抗細菌的抗菌能力，完成拮抗細菌生物活性測定，真實評價拮抗細菌對病菌的生測效果，正確篩選出抑菌效果好的拮抗菌株。請參閱圖l、圖2、圖3所示，本發明實施例1之方法依序包括獲得和培養待測拮抗細菌、獲得和培養目標病原真菌、製作無菌濾紙平板模、製作下層PDA培養基、移入無菌濾紙模、製作上層NA培養基、培養拮抗細菌、移出無菌濾紙模、培養目標病原真菌、試驗結果測量、篩選拮抗細菌，其中獲得和培養待測拮抗細菌、獲得和培養目標病原真菌屬於常規的植物病理研究法，在此不再描述，其特徵在於(1)製作適合病原真菌生長培養基(以常規的PDA培養基為例)和適合拮抗細菌生長培養基(以常規的NA培養基為例)。'(2)製作無菌濾紙平板模用直徑為12cm的濾紙(如高速101型)平鋪於直徑為8.9cm玻璃培養皿中，超出寬度約1.5cm的濾紙邊緣使之皺褶，並置於平皿中高壓滅菌，無菌、濾紙平板模成形備用。(3)製作下層PDA培養基，在直徑為8.9cm玻璃培養皿中加入10ml的PDA培養基為下層培養基，厚度為3一mm，凝固後待用。(4)移入無菌濾紙模在下層培養基上方移入無菌濾紙模，鈹褶處貼於培養皿皿壁，平板浸溼並緊貼於培養基。(5)製作上層NA培養基在無菌濾紙模上加入10ml的NA培養基為上層培養基，凝固後待用，NA培養基通過濾紙模與PDA培養基分隔。(6)培養待測拮抗細菌吸取100nl細菌液(一定濃度含細菌菌體的培養液)均勻塗抹於上層平板中，於適宜細菌生長的條件下培養(如28'C，黑暗)，培養48h後，在下層培養基上標記上層培養基上均勻長滿拮抗細菌的範圍。(7)移出無菌濾紙模拮抗細菌培養48h後，細菌分泌的代謝產物會通過濾紙層向下層PDA培養基均勻擴散，移出的含上層培養基的濾紙模，保留含細菌分泌的代謝產物的下層培養基作為生物測定試材。(8)培養目標病原真菌含細菌分泌的代謝產物的下層PDA培養基中央接入菌齡一致的待測病菌菌餅(直徑為5mm)，於適宜病菌生長的條件下培養(如28'C，黑暗)。(9)實驗結果測量病菌生長47d後測量菌落直徑，以不接種拮抗菌的處理為空白對照，設多個重複，計算病菌菌絲生長抑制率。(10)篩選拮抗細菌通過實驗結果分析比較拮抗細菌的抗菌能力，完成拮抗細菌生物測定，真實評價拮抗細菌對病菌的生測效果，正確篩選出抑菌效果好的拮抗菌株。以下是本發明的具體實施例，進一步說明本發明，但是本發明不僅限於此。實施例拮抗細菌對香蕉枯蔞病菌抑菌活性比較一、材料與方法1、拮抗細菌平板對峙對病菌的拮抗作用採用PDA平板對峙生長法，點接待測的活化細菌(具有初步抑菌活性，來源於土壤)5株，並在相距2cm處接入直徑為0.5cm香蕉枯萎病菌(4號小種)菌絲塊，28'C黑暗對峙培養4d和7d後，測量各拮抗細菌的抑菌帶寬度，比較各菌株的抑菌活性及其穩定性，每處理4個重複。2、拮抗細菌發酵液對病菌菌絲生長的抑制作用用無菌水洗下待測拮抗菌菌落，混勻後吸取100pl細菌液轉接於盛有150mlNB培養液的250ml三角瓶中培養3d後(28'C,140rpm)，取細菌發酵液無菌過濾後按l:2比例與PDA培養基(45"C)混勻後倒入直徑為9cm的培養皿中製成平板。冷凝後於平板中央接入直徑0.5cm病菌塊，置28t黑暗培養。以加相同量的NB液體培養基為對照，每處理4個重複。分別於培養4d、7d後用十字交叉法測量病菌菌落直徑，計算平均直徑，比較各菌株的抑菌活性。3、拮抗細菌培養代謝產物對病菌菌絲生長的抑制作用採用雙層培養基濾紙夾心法，先於培養皿中倒入10mlPDA培養基為下層培養基，待培養基冷凝後。將預先準備好的直徑12cm無菌濾紙(高速101型)輕輕緊貼於PDA平板上，再向濾紙上倒入10mlPDA培養基為上層培養基。吸取100jil細菌液均勻塗抹於上層平板中，281C黑暗下培養48h後，撕去含拮抗細菌的上層培養基濾紙，並在下層培養基中央接入病菌塊，再於28'C黑暗條件下培養4d、7d後用十字交叉法測量病菌菌落直徑，計算平均直徑，比較各菌株的抑菌活性。以不接種拮抗菌發酵液的處理為對照，每處理4個重複。二、結果與分析採用平板對峙培養法，待測的5株細菌(菌株1~5)與病菌對峙培養4d後的抑菌帶寬度分別為0.83cm、0.86cm、0.81cm、0.98cm和0.75cm,以菌株4抑菌帶寬度值最大，抑菌帶寬度值由大至小依次是4>2>1>3>5，共有2個顯著性差異水平；兩者對峙培養7d後的抑菌帶寬度分別為0.25011、0.50cm、0.23cm、0.48cm和0.48cm，以菌株2抑菌帶寬度值最大，抑菌帶寬度值由大至小依次是2>4=5>1>3,有2個顯著性差異水平，這是由於隨著對峙培養時間的延長，病菌繼續朝拮抗菌方向生長，表現為抑菌帶寬度在不斷縮少。用平板對峙法篩選拮抗細菌，優點是操作簡便，時間短，4d可以看出初步結果，適合拮抗細菌的初步篩選。但是採用此法在不同時間測量抑菌帶寬度，獲得的結果差異較大，試驗結果不穩定，菌株間表現的差異不明顯。表1平板對峙法測定拮抗細菌對香蕉枯萎病菌生長影響tableseeoriginaldocumentpage10採用培養基帶毒法,香蕉枯萎病菌在含待測的5株細菌(菌株15)培養發酵液中的PDA平板中培養4d，病菌菌落直徑分別為2.10cm、1.69cm、1.70cm、1.96cm和1.21cm,各菌株的抑菌活性由大至小分別為5>2>3>4>1，有3個顯著性差異水平；香蕉枯萎病菌在含待測的5株細菌(菌株1~5)培養發酵液中的PDA平板中培養7d，病菌菌落直徑分別為3.27cm、2.60cm、3.08cm、3.12cm和2.08cm，各菌株的抑菌活性由大至小分別為5>2>3>4>1，有4個顯著性差異水平。採用培養基帶毒法，檢測細菌培養發酵濾液的抑菌活性，是一種較為理想的方法，能真實反應菌株之間的抗菌活性大小，但是試驗過程中較為繁瑣，試驗周期較長，有的菌株間差異不明顯。10表2培養基帶毒法測定拮抗細菌對香蕉枯萎病菌生長抑制效果(含拮抗細菌無菌發酵液PDA培養基)tableseeoriginaldocumentpage11抑菌活性排序結果5>2>3>4>1,3個顯著性差異水平5>2>3>4>1，4個顯著性差異水平採用雙層培養基濾紙夾心法，香蕉枯萎病菌在含待測的5株細菌(菌株1~5)代謝產物的PDA平板中培養4d，病菌菌落直徑分別為1.10cm、0.81cm、0.88cm、l.OOcm和0.70cm，各菌株的抑菌活性由大至小分別為5>2>3>4>1，有5個顯著性差異水平；香蕉枯萎病菌在含待測的5株細菌代謝產物的PDA平板中培養7d，病菌菌落直徑分別為1.51cm、0.98cm、1.29cm、1.50cm和0.88cm,各菌株間差異明顯，各菌株的抑菌活性由大至小分別為5>2>3>4>1，有4個顯著性差異水平。由於拮抗細菌代謝分泌產物在培養基中通過自然力作用，均勻擴散性，病菌菌落在含拮抗細菌代謝分泌產物的培養基上生長規則，兩次測量結果一致。試驗結果誤差小，穩定，在操作上方便，各菌株間差異明顯，試驗4~7(1可以看出與表2結果較為吻合。表3雙層培養基濾紙夾心法測定拮抗細菌對香蕉枯萎病菌生長影響tableseeoriginaldocumentpage12抑菌活性排序結果三、拮抗細菌幾種測定方法效果評價1、平板對峙法拮抗菌和病菌共培養需5~7d，操作簡便，但抑菌活性不穩定，試驗誤差大，拮抗菌株間表現的差異最不明顯。2、培養基帶毒法拮抗菌發酵液培養2~3d，離心液無菌過濾後，無菌檢測需23d，制帶毒培養基，觀察有無細菌感染需23d，培養病菌^7d，拮抗菌株間表現的差異較為明顯。但過濾膜價格高，操作最為耗時耗財，有時過濾操作不當和無菌檢測不全面易導試驗失敗。3、雙層培養基濾紙夾心法拮抗菌培養l~2d,培養病菌4~7d，拮抗菌株間表現的差異最為明顯。易操作，且試驗材料中濾紙便宜。待試驗的下層培養基常溫下存1個月，平板中拮抗細菌代謝產物的抗菌活性仍然穩定，可檢測多種拮抗細菌對多種病原真菌抑菌活性，適合多種拮抗細菌抑菌譜的研究。權利要求1.一種改進的拮抗細菌生物測定方法，其特徵在於採用雙層培養基濾紙夾心法，將一定濃度細菌培養液或菌苔稀釋液均勻塗抹於上層培養基中，拮抗細菌在上層培養基生長產生的代謝分泌物會通過濾紙層均勻擴散到下層培養基中，移去濾紙及其攜帶的上層培養基，下層培養基即為含拮抗細菌代謝分泌產物的平板，易於進行對多種病原真菌菌絲生長、孢子萌發及細菌生長的生物測定。2.根據權利要求1所述的改進的拮抗細菌生物測定方法，其特徵在於在拮抗菌和病原菌己培養基礎上，按照如下步驟進行1)根據病原真菌和拮抗細菌的種類製作適合病原真菌生長的常規培養基和適合拮抗細菌生長的常規培養基；2)製作無菌濾紙平板模用直徑為12cm的濾紙平鋪於直徑為8.9cm玻璃培養皿中，超出寬度1.5cm的濾紙邊緣使之皺褶，並置於平皿中高壓滅菌，無菌濾紙平板模成形備用；3)製作適合病原真菌生長的下層培養基，在直徑為8.9cm玻璃培養皿中加入10ml的適合病原真菌生長的常規培養基為下層培養基，厚度為34mm，凝固後待用；4)移入無菌濾紙模在下層培養基上方移入無菌濾紙模，鈹褶處貼於培養皿皿壁，平板處浸溼並緊貼於培養基；5)製作適合拮抗細菌生長的上層培養基在無菌濾紙模上加入10ml的適合拮抗細菌生長的常規培養基為上層培養基，凝固後待用，上層培養基通過濾紙模與下層培養基分隔；6)培養待測拮抗細菌吸取細菌液均勻塗抹於上層平板中，於適宜細菌生長的條件下培養，培養48h後，上層適合拮抗細菌生長的常規培養基上均勻長滿拮抗細菌；7)移出無菌濾紙模拮抗細菌培養48h後，細菌分泌的代謝產物會通過濾紙層向下層適合病原真菌生長的常規培養基均勻擴散，此時移出的含上層培養基的濾紙模，含細菌分泌的代謝產物的下層培養基可作為生物測定試材；8)培養目標病原真菌在含細菌代謝分泌產物的下層適合病原真菌生長的常規培養基中央接入菌齡一致的待測病菌菌餅，於適宜病菌生長的條件下培養；9)實驗結果測量待測病菌生長47d後測量病菌菌落直徑；以不接種拮抗細菌的處理為空白對照，設多個重複；10)篩選拮抗細菌:通過實驗結果分析比較拮抗細菌的抑菌能力，完成拮抗細菌生物測定，真實評價拮抗細菌對病菌的生測效果，正確篩選出抑菌效果好的拮抗菌株。3.根據權利要求2所述的改進的拮抗細菌生物測定方法，其特徵在於所述適合病原真菌生長的常規培養基為常規的PDA培養基。4.根據權利要求2所述的改進的拮抗細菌生物測定方法，其特徵在於所述適合拮抗細菌生長的常規培養基為常規的NA培養基。5.根據權利要求2所述的改進的拮抗細菌生物測定方法，其特徵在於所述的直徑為12cm的濾紙採用高速101型。6.根據權利要求2所述的改進的拮抗細菌生物測定方法，其特徵在於所述步驟8)中的待測病菌菌餅的直徑為0.5cm。全文摘要本發明提供一種改進的拮抗細菌生物測定方法——雙層培養基濾紙夾心法，所屬的
技術領域：
涉及生物農藥研製必須採用的參試菌株生物測定方法。通過無菌濾紙平板模製作、上下層培養基製作、無菌濾紙模移入和移出、待測拮抗細菌和目標病原真菌培養、實驗結果測量等簡易程序進行拮抗細菌對植物病原真菌的抗菌活性測定，可合理地篩選出有應用價值的拮抗細菌。本發明屬實施拮抗細菌生物測定的一種簡便快捷新方法，具有技術上的創新性，該方法能真實反應菌株代謝產物的抗菌能力，具有試驗穩定性好、重複性好、材料便宜、操作簡便，實驗周期短等優點，本發明可以實現多種拮抗細菌對多種病原真菌的大量測定，對研究拮抗細菌生防穩定性也具有很好的作用。文檔編號C12Q1/04GK101381762SQ20081007198公開日2009年3月11日申請日期2008年10月24日優先權日2008年10月24日發明者杜宜新,楊秀娟,阮宏椿,陳福如,馬紅娟申請人:福建省農業科學院植物保護研究所