精漿檸檬酸定量檢測試劑的製作方法
2023-05-03 12:27:36
專利名稱：精漿檸檬酸定量檢測試劑的製作方法
技術領域：
本發明屬於體外診斷試劑類，具體適用於檢測精漿檸檬酸含量。
背景技術：
精漿檸檬酸來自前列腺，其作用是絡合鈣離子，通過與鈣離子結合，而調節精漿鈣離子濃度。精漿檸檬酸既影響射精後精液液化功能，又參與維持精漿滲透壓，對精子活力及透明質酸酶的活性也起重要作用。研究表明，精漿檸檬酸含量還與睪酮水平相關，因此精漿檸檬酸含量是幫助判斷雄激素分泌狀態及評價前列腺功能的重要指標。
目前，精漿檸檬酸測定主要有吡啶顯色法和世界衛生組織(WHO)推薦的酶法。吡啶顯色法方法學存在缺陷，特異性不夠；WHO推薦的酶法方法學特異，準確性好，但其檢測線性範圍不夠寬，且試劑組成複雜穩定性差，精漿標本需去蛋白處理，不便於手工操作，同時WHO推薦的酶法需要用到三種工具酶，對反應的幹擾較大。
精漿檸檬酸是評價前列腺功能的常用指標，因此建立一種特異、靈敏、操作簡單的方法學顯得特點重要。
發明內容
本發明意在克服現有技術的不足，提供一種特異性好、方法學指標優、操作簡單、性能穩定、貯存期長、可以實現自動化/手工雙選擇操作的精漿檸檬酸定量檢測試劑。
為實現上述目的，本發明提出一種精漿檸檬酸定量檢測試劑，包括保護液、緩衝液、含有檸檬酸的水溶液標準品和含有苯駢咪唑的水溶液，所述保護液是含有檸檬酸裂解酶的酶保護液，所述水溶液中苯駢咪唑含量優選0.1～1.0％，所述酶保護液中檸檬酸裂解酶的含量優選2000～8000U/L。。
所述保護液由檸檬酸裂解酶和酶保護液組成。
所述緩衝液中還包括防腐劑，所述標準品中還包括防腐劑。
還包括溶解液，所述酶保護液為凍乾粉，溶解液用於溶解酶保護液凍乾粉。
由於上述技術方案，結合下面將要詳述的實施例，本發明突出的技術效果在於採用苯駢咪唑和檸檬酸裂解酶，大大加快了反應速度；只有酶保護液中的檸檬酸裂解酶能催化標準品中的檸檬酸生成能與苯駢咪唑反應的物質—丙酮，因此定量檢測的精漿檸檬酸含量只與酶保護液中的檸檬酸裂解酶有關，只需用到傳統酶保護液中的一種工具酶—檸檬酸裂解酶，排除了保護液中其他酶的幹擾因素小，相對WHO推薦的酶法(需用到三種酶)，方法更特異，方法學指標更優；樣本無需去蛋白處理，使得整個試驗過程操作更簡單，同時檢測既可以採用原有的自動化檢測方法，又可以採用手工檢測方法，實現了自動化/手工雙選擇，使得人們在檢測方法上有更大的選擇性；由於手工操作對操作環境及儀器的限定更小，實用性更強，更適於臨床常規檢測的開展；將酶保護液凍幹，並採用了防腐劑，試劑穩定，2～8℃保存貯存期可達一年。
具體實施例方式
下面通過具體的實施例並結合附圖
對本發明作進一步詳細的描述。
實施例，一種精漿檸檬酸定量檢測試劑，包括如下成分A液含苯駢咪唑的水溶液，每100mlA液中含苯駢咪唑0.25毫升；B液(凍乾粉)含檸檬酸裂解酶的酶保護液凍乾粉，每100ml酶保護液中含檸檬酸裂解酶470U；凍乾粉溶解液含葡萄糖、氯化鈉和酪蛋白的水溶液，每1000ml凍乾粉溶解液中含葡萄糖10克、氯化鈉30mmol、酪蛋白2克；緩衝液含疊氮鈉、硫酸鎂(MgSO4)和三羥甲基氨基甲烷(Bis-Tris)90mmol的水溶液，每1000ml緩衝液中含疊氮鈉0.2g、MgSO40.1mmol、Bis-Tris 90mmol；標準品含疊氮鈉和檸檬酸的水溶液，每1000ml標準品中含疊氮鈉0.2g、檸檬酸2mmol。
上述精漿檸檬酸定量檢測試劑各成分採用如下步驟製得A、A液的製作工藝方法1)取苯駢咪唑0.25毫升，加蒸餾水至100毫升，充分溶解後，置4℃保存；B、B液(凍乾粉)的製作工藝方法2)稱取檸檬酸裂解酶470U，加酶保護液100ml，充分溶解，分裝凍幹。置4℃保存；C、緩衝液的製作工藝方法3)稱取Bis-Tris90mmol、MgSO40.1mmol，疊氮鈉0.2g，置燒杯內，加蒸餾水800毫升，攪拌充分溶解，4)調pH至9.2，定容至1000ml，置4℃保存；D、標準品(2μmol/ml)的製作工藝方法5)稱取2mmol檸檬酸、0.2g疊氮鈉溶於1000ml蒸餾水中，置4℃保存；E、凍乾粉溶解液的製作工藝方法6)稱取葡萄糖10克，氯化鈉30mmol，酪蛋白2克，溶於800毫升蒸餾水中，7)用蒸餾水定容至1000毫升。置4℃保存。
上述實施例中，A液是苯駢咪唑含量為0.1～1.0％的水溶液，苯駢咪唑用於與檸檬酸被檸檬酸裂解酶作用後的產物-酮酸結合，形成在330nm波長下有最大吸收峰的化合物，當苯駢咪唑的含量低於0.1％時，由於反應不與檸檬酸含量成正比，而無法進行反應，當苯駢咪唑的含量高於1.0％時，反應速度不再快速增加，只是增加成本；B液凍乾粉是檸檬酸裂解酶含量為2000～8000U/L的酶保護液凍乾粉，一般而言，精漿檸檬酸定量檢測試劑的酶保護液中，檸檬酸裂解酶的含量的下限為2000U/L，為控制成本，檸檬酸裂解酶的含量的上限為8000U/L，在2000～8000U/L的範圍內，檸檬酸裂解酶的含量越高，催化反應到終點的速度越快；凍乾粉溶解液是葡萄糖含量為0.2～2.0％、氯化鈉含量為10～100mM、酪蛋白含量為0.1～1.0％的水溶液，其中葡萄糖還可以用其他的單糖來替換，氯化鈉還可以用其餘可溶性含氯的無機鹽替換，凍乾粉溶解液也可以採用其他常見的酶保護液凍乾粉溶解液；緩衝液是疊氮鈉含量為0.01～0.1％、MgSO4含量為0.02～0.2mmol/L的Tris緩衝液，其中疊氮鈉還可以用其他的防腐劑替換，MgSO4用於提供測定中所需的陽性離子-鎂，加快酶促反應的速度，還可以用別的可溶性鎂鹽替換，緩衝液也可以採用別的酶促反應中的緩衝液替換；標準品是疊氮鈉含量為0.01～0.1％、檸檬酸含量為1～5mmol/L的水溶液，標準品中的檸檬酸被酶保護液中的檸檬酸裂解酶催化後，與苯駢咪唑反應，生成可供檢測的物質，標準品採用的是現有精漿檸檬酸測定中使用的標準品。
試驗例，用精漿檸檬酸定量檢測試劑檢測精漿檸檬酸含量，具體步驟為一、試劑準備B液凍乾粉以500μl凍乾粉溶解液充分溶解。
二、樣本準備1、記錄受檢者一次射精的精液總量(ml)。精液液化後以3000g離心10分鐘，保留精漿。
2、測定前用稀釋液將待測精漿標本1∶10稀釋三、操作方法準備1cm的石英比色皿若干，按如下測定步驟，在石英比色皿中完成反應空白管標準管測定管標本稀釋液(μl) 20----- -----標準品(μl) ----- 20-----稀釋標本(μl) ----- ----- 20A液(μl)202020緩衝液(μl) 2000 2000 2000顛倒混勻，室溫放置15min。以空白管調零，330nm測定第一次吸光度A1B液(μl)202020顛倒混勻，室溫放置10～40min。以空白管調零，330nm測定第二次吸光度A2四、結果計算因為標本的吸光度(A)與標本的濃度的比值等於標準液的A值與標準液的濃度的比值，即 又因為第一次吸光度A1測的是反應液的幹擾物的吸光度；第二次吸光度A2測的是反應液的總吸光度；同時已經用稀釋液將精漿標本稀釋了10倍，因此在計算標本濃度時也相應地將標準品的濃度2μmol/ml乘以10用20μmol/ml進行計算。
綜上所述，計算精漿中檸檬酸含量(C標本)的公式如下 其中，ΔA標本＝A標本2-A標本1，ΔA標準＝A標準2-A標準1實際檢測，採用酶標儀比色完成。
五、結果報告標本最終檢測結果以「精漿檸檬酸總濃度」方式報告總濃度＝標本濃度(μmol/ml)×一次射精的精液體積(ml)＝μmol/一次射精六、正常參考值≥100μmol/l次射精七、臨床適用性檢測精漿檸檬酸對前列腺炎具有診斷價值。
權利要求
1.一種精漿檸檬酸定量檢測試劑，包括保護液、緩衝液和含有檸檬酸的水溶液標準品，其特徵在於還包括含有苯駢咪唑的水溶液，所述保護液是含有檸檬酸裂解酶的酶保護液。
2.如權利要求1所述的精漿檸檬酸定量檢測試劑，其特徵在於所述保護液由檸檬酸裂解酶和酶保護液組成。
3.如權利要求1或2所述的精漿檸檬酸定量檢測試劑，其特徵在於所述水溶液中苯駢咪唑含量為0.1～1.0％，所述酶保護液中檸檬酸裂解酶的含量為2000～8000U/L。
4.如權利要求3所述的精漿檸檬酸定量檢測試劑，其特徵在於所述緩衝液是含有硫酸鎂的三羥甲基氨基甲烷緩衝液。
5.如權利要求4所述的精漿檸檬酸定量檢測試劑，其特徵在於所述緩衝液中還包括防腐劑，所述標準品中還包括防腐劑。
6.如權利要求5所述的精漿檸檬酸定量檢測試劑，其特徵在於還包括溶解液，所述酶保護液為凍乾粉，溶解液用於溶解酶保護液凍乾粉。
7.如權利要求6所述的精漿檸檬酸定量檢測試劑，其特徵在於所述溶解液是含有單糖、無機鹽、酪蛋白的水溶液。
8.如權利要求7所述的精漿檸檬酸定量檢測試劑，其特徵在於所述溶解液中單糖的含量為0.2～2.0％、無機鹽的含量為10～100mM、酪蛋白的含量為0.1～1.0％。
9.如權利要求8所述的精漿檸檬酸定量檢測試劑，其特徵在於所述標準品為含檸檬酸含量為1～5mmol/L的水溶液。
全文摘要
本發明公開一種精漿檸檬酸定量檢測試劑，包括保護液、緩衝液、含有檸檬酸的水溶液標準品和含有苯駢咪唑的水溶液，所述保護液是含有檸檬酸裂解酶的酶保護液。所述保護液由檸檬酸裂解酶和酶保護液組成。所述緩衝液中還包括防腐劑，所述標準品中還包括防腐劑。還包括溶解液，所述酶保護液為凍乾粉，溶解液用於溶解酶保護液凍乾粉。由於上述技術方案，結合下面將要詳述的實施例，本發明突出的技術效果在於酶保護液中只有一種工具酶檸檬酸裂解酶，使得反應中來自其他酶的幹擾因素小，方法更特異，方法學指標更優；樣本無需去蛋白處理，操作簡單；將酶保護液凍幹，並採用了防腐劑，試劑穩定，2～8℃貯存期可達一年。
文檔編號G01N33/52GK1595154SQ20041004024
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月14日 優先權日2004年7月14日
發明者傅劍華, 劉瑜, 胡家純, 何林, 何小紅 申請人:深圳華康生物醫學工程有限公司