能促進i型膠原蛋白和/或彈力蛋白產生的組合物的製作方法
2023-05-03 12:32:36 1
專利名稱：能促進i型膠原蛋白和/或彈力蛋白產生的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種對人體皮膚真皮成纖維細胞(以下皆稱「皮膚成纖維細胞」)所產生的I型膠原蛋白和/或彈力蛋白有促進效果的組合物。尤其本發明涉及可使真皮的張力及彈力提高，且具有預防、防止、改善因年齡增長及紫外線照射所引起的皺紋或鬆弛等皮膚老化作用的組合物。
背景技術：
對於皺紋或鬆弛等隨皮膚老化而起的變化，一般皆認為和年歲增長及日光曝曬等環境壓力、精神壓力有關。因皮膚老化，構成皮膚組織的表皮細胞、纖維芽細胞漸次減少的同時，供給這些細胞活動所必須的物質的血管亦隨之減少。還可看到具有保持皮膚構造機能的細胞外基質(Extracellular Matrix)的變化。顯著變化有真皮的I型膠原蛋白、III型膠原蛋白以及彈力蛋白，或聯繫表皮層與真皮層間的基底膜IV型膠原蛋白或層粘連蛋白(laminin)等的減少或發生變化，而表皮、真皮以及基底膜愈形偏平化(非專利文獻1)。尤其，為真皮主成份的I型膠原蛋白或彈力蛋白與皮膚的張力及彈性極為有關，這些蛋白質的變性或減少，即為皺紋或鬆弛發生的主因。
由該防止皮膚老化的目的，開發出許多著眼於膠原蛋白與彈力蛋白產生的製劑。例如，開發出的膠原蛋白促進劑有含有類視黃酸(retinoids)與殼鬥科(fagacese)山毛櫸屬(fagus)植物的樹芽萃取物的組合物(專利文獻1)、含有Saussurea屬植物萃取物的組合物(專利文獻2)、含有葛根萃取物的組合物(專利文獻3)、含有白花丹(plumbago zeylanica)、香附子(cyperus rotundus)萃取物的組合物(專利文獻4)、含有蓮花胚芽萃取物的組合物(專利文獻5)、含有淫羊藿屬(epimedium)植物萃取物的組合物(專利文獻6)、含有月桃萃取物的組合物(專利文獻7)等。
再者，開發出的增加真皮彈力蛋白的組合物有配合彈力蛋白的化妝品(專利文獻8及9)、彈力蛋白產生促進劑(專利文獻10)以及作為彈力蛋白分解酵素的彈性蛋白脢(elastase)阻礙劑(專利文獻10及11)。由此可見，改善皮膚真皮組織細胞中的I型膠原蛋白及/或彈力蛋白的產生，將抑制皮膚的老化，亦可抑制或改善皺紋或鬆弛。
此外，能促進I型膠原蛋白與彈力蛋白產生的成份有視黃酸或為其誘導體的視黃醇(retinol)(非專利文獻2及3)，但因其具有對皮膚的刺激性，於安全性上有問題(非專利文獻4)，並且因其穩定性較差，一般而言並不將其付諸實用。
因此，雖開發出能增加真皮膠原蛋白及彈力蛋白數量的組合物，因須兼顧對皮膚的安全性，故仍無法達到充分的效用。
本發明針對與皮膚老化有關的皮膚纖維芽細胞，以水飛薊素的嶄新生理效果為基礎，成功了本發明。有關該水飛薊素先前的技術，以下非專利文獻5以及專利文獻12～17為其代表，而本發明與這些現有技術相異。
《非專利文獻1》化妝品的有用性，評價技術的進步與未來展望，日本化妝品技術者會編，分論，第1章，第7節對應皺紋的化妝品，162-177頁，2001年3月31日第1次印刷發行。
《非專利文獻2》Varani，J，et al.All-trans retinoic acid stimulates growth andextracellular matrix production in growth -inhibited cultured human skinfibroblasts.J.Invest.Dermatol.，Vol.94，No.5，p717-723，1990.
《非專利文獻3》Tajima，S.，et al.，Elastin expression is up-regulated byretinoic acid but not by retinol in chick embryonic skin fibroblasts，J.Dermatol.Sci.，Vol.15，p166-172，1997.
《非專利文獻4》Zouboulis，C.C.，RetinoidsIs there a New Approach？，IFSCC Magazine，Vol.3，No.3，2000《非專利文獻5》天然藥草事典，奧田拓男編，廣川書店，昭和61年3月3日發行。
《非專利文獻6》Wagner，H.，et al.，Arznein.Forsch，18，696，1968.
《非專利文獻7》Wagner，H.，et al.，Arznein.Forsch，24，466，1974.
《非專利文獻8》Tittel，G.，et al.，J.Chromatogr.，135，499，1977.
《非專利文獻9》Tittel，G.，et al.，J.Chromatogr.，153，227，1978.
《非專利文獻10》Quercia，V.，et al.，Chromatography in Biochemistry，Medicine and Enviromental Research，Frigerio A.(ED).，Elsevier ScientificPublishing Company，Amsterdam，1983，p1.
《非專利文獻11》Lowry，O.，et al.，J.Biol.Chem.，193，265，1951.
《非專利文獻12》M，J.Barttek，et.al.，J.Invest.Dermatol.，58，114，1972.
《非專利文獻13》化妝品手冊，日光凱米克魯斯股份有限公司，日本薩發克坦特工業股份有限公司，東色普古敏特股份有限公司，10.經皮膚吸收促進，3.經皮膚吸收的評價，607頁。
《專利文獻1》特開2001-278783號公報《專利文獻2》特開2001-316240號公報《專利文獻3》特開2001-348338號公報《專利文獻4》特開2002-29923號公報《專利文獻5》特開2002-29980號公報《專利文獻6》特開2002-53427號公報《專利文獻7》特開2001-316275號公報《專利文獻8》登錄3121957號《專利文獻9》特開2001-72571號公報《專利文獻10》特開2002-293747號公報《專利文獻11》特開2002-205950號公報
《專利文獻12》特開平5-286864號公報《專利文獻13》特許第2948818號《專利文獻14》特開2000-169328號公報《專利文獻15》特開2000-169332號公報《專利文獻16》特願2002-255448號《專利文獻17》特開平5-9406號公報《專利文獻12》特公昭63-41396號發明內容本發明提供能促進人體皮膚成纖維細胞的I型膠原蛋白和/或彈力蛋白產生的新穎組合物。再者，本發明提供一種防止皮膚老化用組合物，能提高皮膚張力以及彈性，充分預防、防止、改善皺紋或鬆弛，且對皮膚有極高安全性。
本案發明者進行了對I型膠原蛋白及彈力蛋白產生有促進作用的成份的研究。結果，發現水飛薊素和/或乳薊等含水飛薊素的植物萃取物，或這些植物體對於有關I型膠原蛋白和/或彈力蛋白的產生具有優異的促進作用，進而完成本發明。
亦即，本發明是指1、一種對I型膠原蛋白和/或彈力蛋白產生促進作用的組合物，其特徵是含有水飛薊素(silymarin)以促進I型膠原蛋白(collagen)和/或彈力蛋白(elastin)的產生。
2、如前述1所述的組合物，水飛薊素是指從含有水飛薊素的植物萃取物和/或植物中所取得的物質。
3、如前述1或2所述的組合物具有防止皮膚老化的作用。
4、如前述1～3任一項所述的組合物為皮膚外用。
5、如前述1～3任一項所述的組合物為食品。
6、前述4所述的組合物，含有水飛薊素有效成份0.7～2.0％重量。
7、前述1～3項的任一項所述的組合物為化妝品。
圖1表示本發明中水飛薊素對皮膚成纖維細胞中I型膠原蛋白的產生有促進作用的示意圖。
圖2表示本發明中水飛薊素對皮膚成纖維細胞中彈力蛋白的產生有促進作用的示意圖。
圖3表示本發明中水飛薊素對人體皮膚立體模型中I型膠原蛋白產生有促進作用的示意圖。
圖4表示本發明中水飛薊素對人體皮膚立體模型中彈力蛋白產生有促進作用的示意圖。
圖5表示本發明的水飛薊素對豬皮膚浸透性示意圖。
圖6表示本發明的皺紋深淺檢測結果示意圖。
圖7表示本發明的皺紋大小檢測結果示意圖。
圖8表示本發明的皮膚彈性試驗測定結果示意圖。
圖9表示本發明的官能評價結果示意圖。
表1表示本發明對I型膠原蛋白產生促進作用的測定結果藉由畫像解析而數值化的圖表。
表2表示本發明對彈力蛋白產生促進作用的測定結果藉由畫像解析而數值化的圖表。
表3表示本發明的各被驗物質對I型膠原蛋白產生促進作用的測定結果，以數值化的I型膠原蛋白所作的圖表。
表4表示本發明的各化合物對彈力蛋白產生促進作用的測定結果，以數值化的彈力蛋白所作的圖表。
表5為本發明的製劑例A與比較例B的對比示意表。
具體實施例方式
水飛薊素(Silymarin；CAS No.65666-07-1)是指由菊科乳薊(學名Silibum marinum Gaertn，別名大薊、大翅薊、奶薊；Cas No.84604-20-6)提取出的黃酮木酯素類的總稱，分子式表示為C25H22O10，為含有水飛薊賓(Silybin；CAS No.22888-70-6)，水飛薊寧(Silydianin；CAS No.29782-68-1)，水飛薊亭(Silychristin；CAS No.33889-69-9)，異水飛薊賓(Isosilybin；CASNo.72581-71-6)等的組合物(非專利文獻5)。於本發明中，與以往的技術相同，將含有、具有乳薊萃取物中的這些黃酮木脂素類的組合物，皆稱為水飛薊素。水飛薊素如同前述，為黃酮木脂素類的混合物，水飛薊素在植物萃取物或植物中的含有量，以分光光度計為基礎的測定方法(非專利文獻6)、薄層色譜分析法(非專利文獻7)、高效液相層析技術(非專利文獻8～10)可測定。這些測定法中，為分光光度計法之一的2，4-二硝聯氨分析，於德國藥局(有關水飛薊Silybum marianum果實的專題論文)提出報告，且廣泛使用。於本發明中，為達上述成分的混合組合物的定量分析，是以2，4-二硝聯氨分析法紀錄水飛薊素所換算的重量％。
水飛薊素早期於歐洲是用於肝臟疾病的預防及治療。且可作為氧化防止劑廣為人知。再者，其對皮膚而言為有效的組合物，可為乾癬、異位性皮膚炎的治療製劑(專利文獻12)，其為黃酮木脂素與磷脂質的複合物作為活性成分，其對於紅斑、燒傷、皮膚或黏膜的萎縮症狀態、皮膚炎等的治療、防止皮膚的老化以及放射線、風、太陽等外部環境而來的刺激保護而言，為相當有效的組合物(專利文獻13)，表皮透過屏障強化劑(專利文獻14)，皮脂分泌抑制劑(珠練文獻15)，預防、防止表皮扁平化、改善皮膚老化用的組合物(專利文獻16)，抗氧化機能的抗皮膚老化用化妝品(專利文獻17)等使用皆相當廣泛。但其對人體皮膚成纖維細胞的效果並不為人所知。於本發明中，為了取得充分的於立體皮膚模型中的I型膠原蛋白與彈力蛋白產生促進作用的水飛薊素有效量，以及充分地對豬只皮膚的真皮的浸透性的水飛薊素有效量，而進行調查的結果，發現0.7％重量以上的水飛薊素即有顯著的效果。因此，本發明的特徵為，水飛薊素於皮膚外用的有效成份量為0.7％或更高。
為將水飛薊素由乳薊果實中高純度分離出的方法，有70～80％純度分離的方法或90～96％純度分離的方法(專利文獻18)。水飛薊素通常由乳薊的種子或果實中，藉由乙醇、醋酸乙酯、丙酮等抽出，再藉由加熱乾燥法使其成為乾燥粉末，進而成為萃取物原料而販賣。於本發明中所使用的水飛薊素即以此方式調製，可直接使用市面上所售水飛薊素，亦可使用由乳薊而來的水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊亭、異水飛薊賓等水飛薊素的構成成分濃縮而成的萃取物，以及將上述者單離、精製的化合物。
本發明中，含有水飛薊素的植物體是指，葉、莖、芽、花、木皮部位(樹皮)等地上部位、根、塊莖等地下部位、種子、樹脂等全部的部位皆可使用。
於本發明中的水飛薊素及含有其的植物體，可以其乾燥後的乾燥物，及藉由各種溶媒將其溶解後的溶解物的形式使用之。例如，使用以水或乙醇、甲醇等醇類，丙二醇、1，3-丁二醇等多元醇，乙醚、丙酮、醋酸乙酯等有機溶媒將其溶解後所得的溶解物。
於本發明中的含有水飛薊素的植物體，可直接使用將其天然乾燥、熱風乾燥、凍結乾燥後，使其發酵所得者。且依照一般方式進行植物萃取，經抽出、濃縮、粉末化等處理後所得者亦可使用。
含有水飛薊素的本發明組合物，能促進構成真皮的細胞外基質(Extracellular Matrix)的主要蛋白質I型膠原蛋白及/或彈力蛋白的產生，提高皮膚的張力或彈性，預防、防止、改善因年齡增長和紫外線照射所引起的皺紋或鬆弛，而保持皮膚於年輕的狀態。
本發明中的含有水飛薊素、含水飛薊素的植物或植物萃取物的組合物，可作為化妝品等的皮膚外用劑、口服食品而製造。
對於化妝品而言，是指將水飛薊素、含水飛薊素的植物或植物萃取物直接添加於小麥胚芽油或橄欖油等，然後作為化妝品的成分，從而製造化妝品。
為食品者，是指將水飛薊素、含水飛薊素的植物或萃取物直接添加種種的營養成分，而成為可使食用的食品，亦可和所欲搭配的食品配合使用。例如，添加澱粉、乳糖、麥芽糖、植物油脂粉末、可可豆脂末、硬脂酸等適當的助劑後，使用一般的方式，使其成為可食用的型態，例如，使其成為顆粒狀、粉狀、錠劑、膠囊、軟膏等型態，而可為健康補助食品、保健機能食品等。亦可添加於種種的食品，例如，火腿、香腸等食肉加工食品、魚漿製品等水產加工食品、麵包、糕點、奶油、奶粉、發酵乳製品等，亦可添加於水、果汁、牛乳、清涼飲料等飲料後使用。
水飛薊素、含水飛薊素的植物或植物萃取物的組合物有效配合量，是由水飛薊素、含水飛薊素的植物或植物萃取物的調製法、製劑的型態，進而適當地選擇、決定，雖並無特別的限制，但為皮膚外用劑使用時，經換算為水飛薊素，含有0.7～2.0％重量較佳。為錠劑或飲劑等食品的情形，使其含有0.001～20重量％者較佳。通常，將植物或植物萃取物乾燥重量各自配製0.01～60重量％較佳。
本發明中含有水飛薊素、含水飛薊素的植物或植物萃取物的組合物的有效適用量，是由適用過程、適用日程、製劑型態等為依據而定。例如，將水飛薊素適宜地調節為一日0.01g～10g，一次或分數次使用之。而含水飛薊素的植物或植物萃取物的組合物的情形，是適當地調節為一日0.1g～25g乾燥物重量，一次或分數次使用之。
本發明的皮膚外用組合物根據其所適用的型態，可含有如植物油等油脂類、石臘等碳氫化合物類、高級脂肪酸、高級醇、矽酮、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑、非離子表面活性劑、防腐劑、糖類、金屬離子封鎖劑、水溶性高分子等高分子、增粘劑、粉體成分、紫外線吸收劑、紫外線隔絕劑、透明質酸(hyaluronic)等保溼劑、香料、pH調節劑等。亦可含有維他命類、皮膚賦活劑、血液循環促進劑、常生菌控制劑、活性氧消去劑、抗炎劑、美白劑、殺菌劑等其它藥效成分、生理活性成分。
所述油脂類，例如包括山茶油、月見草油、夏威夷果油、橄欖油、菜籽油、玉米油、芝麻油、荷荷葩油、胚芽油、小麥胚芽油、三聚甲醛丙三醇等液體油脂，可可豆脂、椰子油、硬化椰子油、棕櫚油、棕櫚核油、木蠟油、木蠟核油、硬化油、硬化蓖麻油等固體油脂，蜂蠟油、堪地裡蠟、棉蠟、米糠蠟、羊毛脂、醋酸羊毛脂、液狀羊毛脂、甘蔗蠟等蠟類。
所述碳氫化合物類，例如包括流動石蠟、深海角鯊烯(SQUALENE)、角鯊烷(Squalane)、微晶蠟(Micro crystalline wax)等。
所述高級脂肪酸，例如包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)等。
所述高級乙醇，例如包括十二烷基醇、硬脂醇、十六醇、十六醇和十八醇混合物等直鏈醇、硬脂酸甘油醚(monostearin glycerolether)、羊毛脂醇、膽固醇、植物甾醇(phytosterols)、辛基十二烷醇octyldodekanol等支鏈醇。
所述矽酮，例如包括二甲基聚矽氧烷、甲基苯基聚矽氧烷等鏈狀聚矽氧烷，十甲基環戊矽氧烷等環狀聚矽氧烷等。
所述陰離子表面活性劑，例如包括月桂酸鈉等脂肪酸鹽，月桂基硫酸鈉等高級烷基硫酸鹽，POE月桂基硫酸三乙醇胺等烷基醚硫酸鹽、N-醯基肌氨酸酯(N-Acylsarcosinate)、琥珀酸酯、N-醯基胺基酸(N-acylamino acid)等。
所述陽離子表面活性劑，例如包括硬脂酸三甲酯氯化銨等烷基三甲酯銨鹽、氯化苯二甲羥銨(benzalkonium chloride)、苯索氯銨(benzethonium chloride)等。
所述兩性表面活性劑，例如包括烷基甜菜鹼、醯胺甜菜鹼等甜菜鹼系表面活性劑等。
所述非離子表面活性劑，例如包括山梨聚糖單油酸酯{(sorbitanmonooleate)乳化劑Span 80}等山梨聚糖脂肪酸酯(Sorbitan Fatty AcidEsters)、硬化蓖麻油衍生物(Derivatives of Hardened Castor Oil)等。
所述防腐劑，例如包括對羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben)、對羥基苯甲酸乙脂(Ethyl paraben)等。
所述金屬離子封鎖劑(Metal-Ion Blockers)，例如包括乙烯二胺四醋酸二鈉(Disodium Ethylenediaminetereaacetate)、乙二胺四乙酸(Edetic Acid)、乙二胺四乙酸鈉鹽(Sodium Edetate)等。
所述高分子，例如包括阿拉伯膠、黃耆膠(Gum tragacanth)、半乳聚醣(galactan)、瓜耳豆膠(guar gum)、紅藻膠(Carrageenan)、果膠(pectin)、瓊脂(Agar-Agar)、Queen Seed、葡聚糖(dextran)、活性酵母(Pullulan)、羧甲基澱粉、膠原蛋白、酪蛋白膠、明膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉(CMC)、海藻酸鈉、羧基乙烯聚合物(CarboxyvinylPolymer)(CARBOPOL等)等乙烯系高分子。
所述增粘劑，例如包括紅藻膠、黃耆膠、Queen Seed、酪蛋白膠、葡聚糖、明膠、羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羧基乙烯聚合物、瓜耳豆膠、玉米糖膠、膨潤土等。
所述粉末成分，例如包括滑石、高嶺土、雲母、矽砂、硅藻土、聚乙烯粉末、聚苯乙烯粉末、纖維素粉末、無機白色顏料、無機紅色顏料、氧化鈦塗布雲母、氧化鈦塗布滑石、著色氧化鈦塗布雲母等珍珠色顏料、紅色201號、紅色202號等有機顏料。
所述紫外線吸收劑，例如包括對氨基苯甲酸、苯基水楊酸鹽(PhenylSalicylate)、桂皮酸異丙醇酯(Isopropyl Paramethoxy)、辛基甲氧基肉桂酸、2，4-二羥二苯基酮等。
所述紫外線隔絕劑，例如包括二氧化鈦、滑石、洋紅、膨潤土、高嶺土、二氧化鉛等。
所述保溼劑，例如包括聚乙烯醇、丙烯醇、雙丙甘醇(Dipropylene Glycol)、1，3丁二醇、1，2戊硫醇、丙三醇、二甘油、聚甘油、木糖醇、多醇、麥芽糖、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、軟骨素硫酸鈉、透明質酸鈉、乳酸鈉、吡咯烷酮羧酸(Pyrrolidone Carboxylic Acid)、環糊精等。
所述藥效成分，例如包括維他命A油、視黃醇等維他命A類、核黃素等維他命B2類、維生素B6鹽酸鹽、L-抗壞血酸、L-抗壞血酸磷酸脂(L-Ascorbic Acid Phosphate Easter)、L-甘油酯抗壞血酸單軟脂酸酯(L-Ascorbic Acid Monopalmitic Acid Ester)、L-棕櫚酸抗壞血酸酯(L-AscorbicAcid Dipalmitic Acid Ester)、L-抗壞血酸-2-糖精等維他命C類、泛酸鈣等泛酸類、維他命D2、膽鈣化醇等維他命D類；α-生育酚(α-Tocophero)、醋酸生育酚、尼古丁酸DL-α-生育酚(DL-α-Tocopherol Nicotinate)等維他命E類。胎盤素萃取物、穀胱甘肽、虎耳草萃取物等美白劑、蜂王漿、山毛櫸萃取物等皮膚蘇活劑、辣椒素、薑酮、斑蝥滴酊、魚石脂、咖啡因、丹寧酸、谷維素等血液循環促進劑、甘草甜味素酸誘導體、甘草酸誘導體、甘菊環(Azulene)等消炎劑、精氨酸、絲氨酸、白氨酸、色氨酸等氨酸類、常生菌控制劑的麥芽糖縮合物、氯化溶菌脢(Lysozyme Chloride)等。再者，可以是洋甘菊萃取物、洋芹萃取物、山毛櫸萃取物、酒酵母萃取物、葡萄柚萃取物、金銀花萃取物、米萃取物、葡萄萃取物、蛇麻草萃取物、米糠萃取物、枇杷萃取物、黃櫱萃取物、薏仁萃取物、胡黃連萃取物、黃香草木樨萃取物、棕櫚萃取物、甘草萃取物、芍藥萃取物、肥皂草萃取物、絲瓜萃取物、辣椒萃取物、檸檬萃取物、龍膽萃取物、紫蘇萃取物、蘆薈萃取物、迷迭香萃取物、鼠尾草萃取物、百裡香萃取物、茶萃取物、海藻萃取物、青瓜萃取物、丁香萃取物、胡蘿蔔萃取物、七葉樹萃取物、金縷梅萃取物、桑萃取物等各種萃取物。
本發明的皮膚外用組合物，例如是水溶液、油劑、乳液、懸濁液等液劑、凝膠、乳霜等半固體劑、粉末、顆粒、膠囊、微膠囊、固體等固體劑型態皆可適用。可以已知的方式調製這些型態，化妝水、乳劑、凝膠劑、乳霜、軟膏、硬膏、外敷膏、噴霧劑、栓劑、注射劑、粉末劑、顆粒劑、錠劑、丸劑、漿劑、片劑等各種劑型皆可。這些可適用於塗布、貼附、噴霧、飲用等方式。尤其於這些劑型中，化妝水、乳劑、乳霜劑、軟膏劑、硬膏劑、外敷膏劑、噴霧劑等類型尤其適用。
所述化妝品，包括化妝水、乳液、乳霜、外敷軟膏等皮膚化妝品、打底化妝水、打底乳霜、乳液狀或乳霜狀或軟膏型的粉底等打底化妝品、雪花膏、腳用乳霜、身體用乳霜等化妝品、入浴劑等。
以下則舉試驗例、實施例以進一步說明本發明，而本發明的效果並不限於這些試驗例、實施例。
試驗例試驗用化合物溶液的配製使用生物化學用試藥級別的二甲基亞碸(DMSO；和光純藥)、確認I型膠原蛋白產生促進效果陽性對照的視黃酸(全反式-視黃酸；和光純藥)以及陰性對照的大豆磷脂(和光純藥)。各化合物藉由DMSO使溶解的溶液成為儲備溶液，添加適當的量於培養液，對細胞進行處理。且同樣地，將水飛薊素(silymarin group；希格馬奧崔其)以上述DMSO溶解的溶液作為儲備溶液，添加適當的量於培養液，確認其添加效果。
正常人體皮膚成纖維細胞的培養正常人體皮膚成纖維細胞(以下稱NFB)；以CCD1059(由大日本製藥購入)為皮膚成纖維細胞培養基；以FGM(三光純藥)於37℃、5％ CO2的保溫箱中培養。FGM是於成纖維細胞基礎培養基中添加人體皮膚成纖維細胞增殖因子(1μg/ml)、胰島素(5mg/ml)、正泰黴素(50μg/ml)、兩性黴素Amphotericin-B(50μg/ml)配成。本試驗中，使用經3～7代傳代的細胞。
水飛薊素促進I型膠原蛋白產生的評價將NFB以FGM調整為5×104/ml之懸濁液狀態，於φ90mm培養皿中各播種10ml，培養至70％合流(Confluent)狀態。將各化合物於各濃度所添加之FGM，取10ml置於培養皿中培養24小時。回收培養上清液，以150G、5分鐘內離心除去浮遊細胞後，12000G、30分鐘間離心除去細胞片。為達80％飽和，添加硫酸銨後使溫度維持4℃狀態下攪拌一晚。15000G、30分內離心沉降蛋白質，除去上清後，溶解於20Mm Tris-HCl(pH7.5)。在20Mm Tris-HCl(pH7.5)中，使溫度維持4℃狀態下透析一晚後，加入20Mm Tris-HCl(pH7.5)使其濃縮20倍，進而成為western印跡(-plotting)用樣本使用。
將樣本中的蛋白質以SDS-PAGE分離後，轉漬至硝化纖維膜。將轉漬後的硝化纖維膜浸於阻斷溶液(脫脂乳以5％的濃度於含有0.1％的聚氧化乙烯(20)山梨醇酐單棕櫚酸酯的PBS中溶解的溶液)，維持4℃下進行阻斷(Blocking)一夜。以洗淨液{含有0.1％的聚氧化乙烯(20)山梨醇酐單棕櫚酸酯的PBS}洗淨後，浸於一次抗體(Primary Antibody){以洗淨液調製500ng/ml的對I型膠原蛋白的多株抗體(Rockland)}，於室溫下作用1小時。
洗淨後，將其浸於二次抗體(於洗淨液250ng/ml中調製的辣根過氧化物酶(HRP)標記化抗免疫球蛋白G(IgG))，於室溫下作用一小時。洗淨後，使用ECL pluswestern印跡試藥(阿瑪夏生化科技公司)檢出。檢出的條帶以影像分析系統(阿瑪夏生化科技公司)取得後，藉由imagemaster軟體解析並數值化。
由western印跡法所測定的各化合物對I型膠質蛋白產生促進作用的結果示於圖1。而有關完全長的I型膠原蛋白(圖1中表示為I型膠原蛋白的頻帶(band))畫像解析的數值化結果表示於表1。
表1
將水飛薊素以5μg/ml及10μg/ml處理時，與無處理樣品對照，則知其I型膠原蛋白的產生各自促進了1.8倍及3.4倍。作為陽性對照，將視黃酸於250nM以及500nM處理，與無處理樣品對照，則知I型膠原蛋白的產生促進為2.0倍以及1.4倍。另一方面，作為陰性對照，將大豆磷脂以10μg/ml處理，與無處理樣品對照則為相同程度。由此可知，水飛薊素對促進皮膚成纖維細胞的I型膠原蛋白產生有顯著的功效。
水飛薊素促進彈力蛋白產生的評價將NFB以FGB懸濁調整為5×104/ml，於φ90mm培養皿中各播種10ml，培養至70％合流狀態。將各化合物於各濃度以添加的FGM於10ml/皿中處理，培養24小時。回收培養上清液，以150G、5分鐘內離心除去浮遊細胞後，12000G、30分鐘間離心除去細胞片。為達80％飽和，添加硫酸銨於4℃攪拌一晚。15000G、30分內離心沉降蛋白質，除去上清後，溶解於20Mm Tris-HCl(pH7.5)。在20Mm Tris-HCl(pH7.5)中，以4℃透析一晚後，加入20MmTris-HCl(pH7.5)使其為20倍濃縮，進而成為西方墨點用樣本而使用之。
將樣本中的蛋白質以SDS-PAGE分離後，轉漬至硝化纖維膜。將轉漬後的硝化纖維膜浸於阻斷溶液(使脫脂乳於5％的濃度於，含有0.1％的聚氧化乙烯(20)山梨醇酐單棕櫚酸酯的PBS中溶解的溶液)，4℃阻斷一夜。以洗淨液{含有0.1％的聚氧化乙烯(20)山梨醇酐單棕櫚酸酯的PBS}洗淨後，浸於一次抗體{以洗淨液調製500ng/ml的對I型膠原蛋白的多株抗體(Rockland)}，於室溫下作用1小時。洗淨後，將其浸於二次抗體(於洗淨液250ng/ml中調製的辣根過氧化物酶(HRP)標記化抗免疫球蛋白G(IgG))，於室溫下作用一小時。洗淨後，使用ECL plus西方墨點試藥(阿瑪夏生化科技公司)檢出。且，檢出的頻帶(band)以影像分析系統(阿瑪夏生化科技公司)取得後，藉由imagemaster該軟體解析並數值化。
由western印跡法所測定的各化合物的彈力蛋白產生促進作用的結果示於圖2。而有關完全長的彈力蛋白(圖2中表示為彈力蛋白的頻帶(band))畫像解析的數值化結果表示於表2。
表2將水飛薊素以10μg/ml處理時，與無處理樣品對照，則知其彈力蛋白的產生促進了4.7倍。做為陽性對照，將視黃酸於250nM以及500nM處理，與無處理樣品對照，則知I型膠原蛋白的產生促進為2.8倍以及1.4倍。另一方面，作為陰性對照，將大豆磷脂以10μg/ml處理，與無處理樣品對照，則為相同程度。由此可知，水飛薊素對促進產生皮膚成纖維細胞的彈力蛋白有顯著的功效。
於人體皮膚立體模型中I型膠原蛋白產生促進作用的評價人體皮膚立體模型為人體皮膚的擬真模型，因其安全與有效性而被廣為使用。人體皮膚立體模型使用TESTKIN(LSE-high)(東洋紡積)，按照附件所記載之協議(Protocol)進行培養。於一縮二丙二醇(Dipropylene Glycol)中添加含有70％水飛薊素的乳薊萃取物(印地那公司)、大豆磷脂(和光純藥)、視黃酸(all-trans-視黃酸；和光純藥)於各濃度溶解。含有70％水飛薊素的乳薊，換算為有效成分的水飛薊素溶解於一縮二丙二醇。將含有70％水飛薊素的乳薊以及大豆磷脂加熱處理，溶解於一縮二丙二醇，視黃酸於室溫攪拌溶解。無處理對照者則只用一縮二丙二醇。
將各被驗物質於分析環的組織上添加60μl，培養24小時。之後，交換培養液的同時，將分析環於培養基洗淨後，添加新樣本，再培養24小時。回收組織，添加組織用溶液{50Mm Tris-HCl(pH7.5)、0.5％(Octylphenoxy)聚乙氧基乙醇(Sigma-Aldrich)}，於聚四氟乙烯纖維均質器中均化。10000G、30分鐘間離心除去組織片，在蒸餾水中，於4℃溫度下透析一晚，藉由凍結乾燥去除其水分。加入20Mm Tris-HCl(pH7.5)使其濃縮20倍，進而成為western印跡用樣本。樣本中的蛋白質的質量使用DC蛋白質分析套組(DC ProteinAssay KitBio-Rad實驗室製造)，使用Lowry法(非專利文獻11)以將蛋白質定量，添加20Mm Tris-HCl(pH7.5)調整為2μg/μl。於樣本中等量添加含有5％ 2-巰基乙醇的2倍濃縮Laemmli樣本，於加熱塊(Heat Block)中以100℃、處理5分鐘，還原樣本中的蛋白質。
使用這些樣本，以western印跡法評價I型膠原蛋白的產生促進作用。使用等同1lane的10μg的蛋白質，以SDS-PAGE使其分離後，轉漬於硝化纖維膜。將轉漬後的硝化纖維膜浸於阻斷溶液(脫脂乳以5％的濃度於含有0.1％的聚氧化乙烯(20)山梨醇酐單棕櫚酸酯的PBS中溶解的溶液)，4℃阻斷一晝夜。以洗淨液{含有0.1％的聚氧化乙烯(20)山梨醇酐單棕櫚酸酯的PBS}洗淨後，浸於一次抗體{以洗淨液調製500ng/ml的對I型膠原蛋白的多株抗體(Rockland)}，於室溫下作用一小時。洗淨後，將其浸於二次抗體(於洗淨液250ng/ml中調製的辣根過氧化物酶(HRP)標記化抗免疫球蛋白G(IgG))，於室溫下作用一小時。洗淨後，使用ECL plus western印跡試藥(阿瑪夏生化科技公司)檢出。檢出的頻帶(band)以影像分析系統(阿瑪夏生化科技公司)取得後，再藉由影像分析系統(阿瑪夏生化科技公司)該軟體解析並數值化。
由western印跡法測定各被驗物質的I型膠原蛋白產生促進作用結果示於圖3。完全長度(Full-Length)的I型膠原蛋白(圖3中，標記為膠原蛋白的頻帶(band))的數值化結果示於表3。
表3水飛薊素以0.5％處理時，與無處理樣品對照雖相同，但以0.7％處理時為2.7倍、1.0％處理時則為3.3倍、1.5％處理時則為2.4倍、2.0％處理時則促進2.2倍。作為陽性對照，以視黃酸於0.05％處理，與無處理樣品對照則知，其促進2.0倍。另一方面，作為陰性對照者，以大豆磷脂以1.0％處理，與無處理樣品對照則為相同程度。由此可知，將水飛薊素以0.7％以上處理時，對促進產生皮膚立體模型的I型膠原蛋白有2.0倍以上顯著的功效。
人體皮膚立體模型中彈力蛋白產生促進作用的評價以下，使用上述人體皮膚立體模型中I型膠原蛋白產生促進作用的評價方式，來對人體皮膚立體模型中彈力蛋白產生促進作用進行評價。
由western印跡法測定各化合物對彈力蛋白產生促進作用結果示於圖4。完全長的彈力蛋白(圖4中，標記為彈力蛋白的頻帶(band))的數值化結果示於表4。
表4水飛薊素以0.5％濃度處理時，與無處理樣品對照雖相同，但以0.7％處理為2.5倍、1.0％處理則為4.3倍、1.5％處理則為3.3倍、2.0％處理則促進2.0倍。做為陽性對照，以視黃酸於0.05％處理，與無處理樣品對照則知，其促進3.3倍。另一方面，作為陰性對照，用大豆磷脂以1.0％處理時，與無處理樣品對照則為相同程度。由此可知，將水飛薊素以0.7％以上處理時，對促進產生皮膚立體模型的彈力蛋白有2.0倍以上顯著的功效。
豬只皮膚的水飛薊素經皮吸收性的評價使用被指為與人體皮膚吸收相近的豬只皮膚，對水飛薊素的經皮吸收性作評價(非專利文獻12)。評價是以Franz所創的擴散池法為之(非專利文獻13)。將取下後以-80℃保存的尤卡坦(yucatan)迷你豬的皮膚(五個月的雌豬；日本查爾斯河品種)於室溫下放置20分鐘，使其為半解凍的狀態。以手術用的兩鈍直剪刀除去其脂肪。於Franz擴散池下層的受體細胞加入含有0.05％卡那黴素硫酸鹽(和光純藥)的磷酸緩衝生理食鹽水(pH7.4)，安裝豬皮膚，設置上層給體細胞(Donor Cell)。將擴散池設置於37℃的保溫箱內，以攪拌器攪拌受體細胞液。於一縮二丙二醇將含有70％水飛薊素的乳薊萃取物於各不同水飛薊素濃度溶解的樣本添加100μl於捐贈細胞內，再以石蠟薄膜密封。
由各水飛薊素的濃度，使用兩個豬只皮膚以評價之。24小時後，除去豬只皮膚上殘留的樣本，用剪刀將適於作樣本的皮膚取出。以80℃的水浴器預先溫熱的刮勺夾住皮膚加熱20秒鐘，用鑷子將表皮與真皮剝離。以剪刀細劃真皮後，放入15ml的離心管(Centrifugation Tube)。添加2ml的99.8％甲醇(和光純藥)，以物理均質機使其破碎。10000×G、30分鐘內離心除去組織片後，以0.45μm的薄膜過濾器濾過，即為成分分析用的樣本。
於一縮二丙二醇將含有70％水飛薊素的乳薊萃取物各不同水飛薊素濃度溶解的樣本為標準物質，將浸透於豬只皮膚的水飛薊素以高效液相層析技術測定之。高效液相層析技術的條件為以下所示。以下列條件分析，可見水飛薊亭、水飛薊賓、水飛薊賓A(silybin A)、水飛薊賓B(silybin B)、異水飛薊賓(isosilybin A)、異水飛薊賓B(isosilybin B)的特徵峰。
(高效液相層析技術的條件)管柱；C18 UG120 4.6mm-250mm(資生堂)移動相；水∶甲醇∶醋酸＝65∶35∶5管柱溫度；40℃測定波長；288nm流速；1.0ml/min算出各成分峰面積的合計值，則為水飛薊素的濃度值，將雙丙烯二醇中含有70％水飛薊素的乳薊萃取物，在各水飛薊素濃度下所溶解的樣本中，設水飛薊素量為100％，則浸透豬只真皮的水飛薊素量則以％表示之。結果，浸透兩個豬只皮膚的真皮的水飛薊素濃度平均值以圖表示於圖5。水飛薊素濃度介於0.5％～0.7％者與介於0.7％～2.0％者相較，後者反應較為緩和，由圖中可見於0.7％對真皮的浸透性急速升高。
對於皮膚立體模型中水飛薊素對I型膠原蛋白以及彈力蛋白產生促進作用的評價，由水飛薊素對豬只皮膚的真皮的浸透性觀之，欲使水飛薊素對人體皮膚產生I型膠原蛋白以及彈力蛋白促進作用，必須有0.7％以上濃度的水飛薊素。因此，以下所示的人體試驗中，以使用配合0.7的水飛薊素的化妝品進而對其評價。
1％乳薊萃取物溶液的安全性評價乳薊於歐洲自古以來即被使用為食品或藥物，其安全性亦廣為人知。而現在，將對有關乳薊對皮膚的刺激性做試驗。
有關含有1％水飛薊素的乳薊萃取物溶液對皮膚的刺激性，將使用貼膚試驗以評價之。被驗者的上腕內側部位於24小時內閉塞貼上1％水飛薊素溶液的貼布。貼布除去3以及24小時後，觀察所貼部位，由日本接觸皮膚炎學會的本國基準判定之。由被驗者20人評價的結果為全員陰性可知，其對皮膚的安全性相當高。
人體試驗皺紋的目視評價(人體試驗1)以有皺紋現象的男性一名、女性十名為受驗者進行以下的試驗。將實施例A(請參照表5)的美容液塗於任半邊臉上，於12個星期內一天兩次(早、晚)各自約塗布0.2g。另一邊臉上亦同樣塗布比較例B。由專門人員以目視判定皺紋改善的效果。表5所示者為實施例A與比較例B。
(注1)SEPPIC公司製造(注2)印地那公司製造表5目視的結果，11人中有7人實施例化妝品塗布的半邊臉可認定有皺紋改善效果。
皺紋深度的測定(人體試驗2)以上述的方法進行試驗，於試驗開始前以及試驗完成後，在外眼角使用山田妝業製造二劑混合型複製劑skin cast採取複製，由複製畫像解析判定表面縐紋的深淺。複製劑的畫像解析是於非接觸式光學3D測定裝置(PRIMOSGFM)取得其畫像，進而計算測量複製表面的縐紋深淺。
於畫像解析中，使用實施例A化妝品的半邊，與使用前相較，使用後皺紋變的較淺(有效標準未達5％)。圖6所示者為皺紋深淺的測定結果，圖7所示者為皺紋大小的測定結果。
皮膚彈性試驗(人體試驗3)外眼角的吸引彈性(Suction Resilienceelasticity)是以Cutemeter(C+Kelectronic公司製造)測定之。皮膚彈性試驗測定結果示於圖8。
吸引彈性是肌肉彈性指針的一種測定標準，皮膚彈性會隨年齡增長。但使用實施例A化妝品者，則可明顯看出有吸引彈性增加的傾向。
膠原蛋白量的測定(人體試驗4)膠原蛋白量的測定是以SKINSKAN(光纖維螢光分光測定裝置)(JobinYvon spec.公司製造)測定之。其指針為，胃蛋白脢分解膠原蛋白與膠原脢分解膠原蛋白的峰面積。
觀其結果，胃蛋白酶分解膠原蛋白與膠原脢分解膠原蛋白原本各自因自然老化、光老化而增加，但該試驗得到抑制該兩者的結果。
官能試驗(人體試驗5)對被驗者12個星期塗布後的肌狀態，肌肉的張力、彈性的改善度由自我評價來實施官能試驗。圖9所示者為該官能試驗的結果。
觀其結果，認為實施例化妝品塗布側有改善者在被驗者11人中有5人。由以上的評價，配合水飛薊素的化妝品，對於皺紋的改善、肌肉彈力的回覆、胃蛋白脢以及膠原蛋白分解膠原脢的抑制效果、由自我評價等亦可知其對肌狀態的改善相當有效。
實施例以下所示者為本發明的實施例，但本發明並不僅限於此。
實施例1乳霜按下列處方(單位重量％)製造乳霜。
(1)硬脂醇(Stearyl Alcohol)6.0(2)硬脂酸(Stearic Acid) 2.0(3)氫化羊毛脂(Hydrogenated Lanolin) 4.0(4)三十碳六烯(Squalane) 9.0(5)辛基十二烷醇 (Octyl Dodecanol)10.0(6)POE(25)十六烷醇醚 (POE(25)Cetyl Alcohol Ether) 3.0(7)甘油硬脂酸酯 (Glycerin Monostearate) 2.0(8)水飛薊素 (Silymarin) 0.1(9)防腐劑(Preservative) 適量(10)香料 (Armoatics) 適量(11)1、3丁二醇 (1，3-Butylene Glycol) 6.0(12)PEGl500 4.0(13)精製水 (DI Water) 餘量製造方法將上述成分(1)～(10)加熱溶解至80℃使其成為油相。成分(11)～(13)加熱溶解至70℃使其成為水相。於油相慢慢地將水相加入使其乳化，一邊攪拌至40℃冷卻，再攪拌冷卻至30℃便得乳霜。
實施例2錠劑按下列處方(單位重量％)製造錠劑。
(1)水飛薊素20.0(2)乳糖65.0(3)豆粉14.0(4)瓜爾豆膠1.0實施例3乳液按下列處方(單位重量％)製造乳液。
(1)雙丙烯甘醇Dipropylene Glycol9.000(2)含有70％水飛薊素的乳薊 1.000(3)(羥乙基丙烯酸/丙烯二甲基牛磺酸 Na)共聚物 Hydroxyethyl Acrylate 0.188Acryldimethyl Taurin Na(4)角鯊烷Squalane 0.127(5)聚山梨醇脂肪酸酯60Polysorbat 60 0.028(6)月桂基谷胺酸酯(植物固醇/OCTYLDODECYL) Phytosteryl/octyldodecyl 1.000lauroyl glutamate(7)甘油5.000(8)二甲基矽氧烷 Dimethicone 3.000(9)精製水 74.742(10)卡波姆 Carbomer 0.200(11)田菜鹼 2.000(12)乙醇 3.000(13)氫氧化鉀 Potassium Hydroxide 0.065(14)精製水 DI water 0.650(製造方法)將上述成分(1)加入(2)並於80℃加熱溶解。加入成分(3)～(8)，於80℃加熱溶解為油相。將成分(9)～(11)於70℃加熱溶解為水相。於油相中慢慢地加入水相使其乳化，一邊攪拌至30℃冷卻；後再加上以成分(12)、(13)加入(14)攪拌溶解所得者，攪拌冷卻後即得乳液。
產業上利用的可能性本發明涉及含有水飛薊、含水飛薊植物或植物抽取物的組合物，能促進人體真皮的I型膠原蛋白/或彈力蛋白的產生。其結果能提高皮膚的張力或彈性，可維持無皺紋、無鬆弛的年輕細緻肌膚狀態。
權利要求
1.一種能促進I型膠原蛋白/或彈力蛋白產生的組合物，其特徵在於，含有水飛薊素。
2.如權利要求1所述的組合物，其特徵在於，水飛薊素是指從含有水飛薊素的植物萃取物和/或植物中所取得的物質。
3.如權利要求1或2所述的組合物，具有防止皮膚老化的作用。
4.如權利要求1～3任一項所述的組合物，為皮膚外用。
5.如權利要求1～3任一項所述的組合物，為食品。
6.如權利要求4所述的組合物，含有水飛薊素有效成份0.7～2.0％重量。
7.如權利要求1～3任一項所述的組合物，為化妝品。
全文摘要
本發明涉及一種促進人體皮膚成纖維細胞中的I型膠原蛋白以及/或彈力蛋白的產生、以防止皮膚老化用的組合物。該組合物可提高皮膚的張力或彈性，對於預防、防止、改善皺紋或鬆弛十分有效，且對於皮膚的安全性亦很高。本發明涉及含有水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊亭、異水飛薊賓等黃酮木酯素類總稱的水飛薊素，和具有促進I型膠原蛋白以和/或彈力蛋白產生的組合物，其中所含的水飛薊素是從含有水飛薊素的植物和/或植物萃取液而來。
文檔編號A61P17/00GK1761662SQ20048000702
公開日2006年4月19日 申請日期2004年3月23日 優先權日2003年3月25日
發明者宮田智, 繁田葉子, 櫻井哲人 申請人:株式會社芳柯