植物抗性相關蛋白anac001及其編碼基因和應用的製作方法

2023-05-03 23:16:11

專利名稱：植物抗性相關蛋白anac001及其編碼基因和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物抗性相關蛋白ANAC001及其編碼基因和應用。
背景技術：
植物在栽培生產過程中常發生各種病害，一些病害對植物生長構成極大威脅，嚴重損害農作物其產量和質量。對於植物病害，目前主要採用藥物措施防治。最近人們開始應用非生物誘導劑誘導植物抗病性，並已廣泛應用於菸草、馬鈴薯、番茄、黃瓜、菜豆、水稻等多種重要農作物。這種措施的效果雖然理想，但成本較高，並汙染環境。因此，迫切需要開發新的生物學手段以提高植物自身的抗病性。系統獲得性抗性是植物的一種防禦反應，當植物遭受病原體和害蟲攻擊時，這種反應會被誘導，並且能夠迅速擴散到植株的其它部位以保護植物。病程相關蛋白ra是一類逆境蛋白，被認為在植物的抗病中起重要作用，其中編碼PRl蛋白的基因常被用作植物抗病反應和系統獲得抗性中的指示基因，PRl基因的表達在植物抗病反應中起重要作用。PRl基因在正常生長條件下，本底表達量很低，也就是說I3Rl基因啟動子在正常生長條件下基本不發揮啟動功能，受逆境誘導(遭受病害侵襲時啟動基因的表達。水楊酸是廣泛存在於植物體內的酚類物質，被認為是誘發系統獲得性抗性的信號，可以誘導對病毒、細菌、真菌等多種病原體的抗性。研究表明，外施水楊酸後，PRl基因的轉錄被顯著激活。研究還發現，當植物某部位遭受病原體攻擊之後，植物體內水楊酸含量會增加，而且水楊酸的增加出現在PRl基因表達之前。植物中水楊酸的合成在很大程度上是通過異分支酸合成酶(ICS，isochorismate synthase) ICSl作用於底物異分支酸(isochorismate)從而合成水楊酸。ICSl基因在正常生長條件下，本底表達量很低，也就是說ICSl基因啟動子在正常生長條件下基本不發揮啟動功能，受逆境誘導(病原菌侵染和紫外線照射)啟動基因的表達。到目前為止，僅僅發現ETHYLENEINSENSITIVE3(EIN3)和EIN3-LIKE1能夠與SA生物合成關鍵基因ICSl啟動子直接結合，並且負調節SA的合成水平，尚未發現能通過正向誘導ICSl啟動子啟動ICSl基因表達，從而增加水楊酸合成水平的蛋白。另外研究發現SAR Deficient 1 (SARDl)和CBP60g蛋白是誘導ICSl基因表達和SA合成的重要因子，但未能發現更多地通過正向誘導ICSl啟動子啟動ICSl基因表達，從而增加水楊酸合成水平的蛋白。

發明內容
本發明的目的是提供一種植物抗性相關蛋白ANAC001及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白，命名為ANAC001蛋白，來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的任意一種(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或
4添加且具有誘導ICSl基因啟動子啟動功能的由序列1衍生的蛋白質；(C)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有誘導PRl基因啟動子啟動功能的由序列1衍生的蛋白質；(d)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物中的水楊酸合成相關的由序列1衍生的蛋白質；(e)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗性相關的由序列1衍生的蛋白質。為了使(a)中的蛋白質便於純化，可在由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標籤。表1標籤的序列
標籤殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)、(c)、(d)或(e)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)、(c)、(d)或(e)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標籤的編碼序列得到。編碼所述蛋白的基因(ANAC001基因)也屬於本發明的保護範圍。所述基因可為如下1)至10)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列2自5』末端第130至1416位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有誘導ICSl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有誘導ICSl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；5)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有誘導PRl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；6)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有誘導PRl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；7)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物水楊酸合成相關蛋白的DNA分子；
8)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物水楊酸合成相關蛋白的DNA分子；9)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗性相關蛋白的DNA分子；10)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗性相關蛋白的DNA分子。「嚴格雜交條件」通常指鹽濃度低於約1. 5M，通常為約0. 01-1. 0Μ，ρΗ在約7. 0-8. 3之間，溫度在約30-60攝氏度之間。也可以通過添加去穩定劑，例如甲醯胺，來實現嚴格雜交條件。上述嚴格條件可為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交並洗膜。所述ICSl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述PRl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。含有所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬於本發明的保護範圍。可用現有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用於植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3』端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3』端。使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因寸。
所述重組表達載體具體可為在3^-FLAG表達載體的多克隆位點插入序列表的序列2所示DNA片段得到的重組質粒；所述3^-FLAG表達載體為在pUC19載體的多克隆位點(如I3StI和EcoRI酶切位點之間)插入序列表的序列6所示DNA得到的重組質粒。所述重組表達載體具體可為在所述3^-FLAG表達載體的^CbaI和BamH I酶切位點之間插入序列表的序列2所示的ANAC001基因得到的重組質粒。擴增所述基因的全長或其任一片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。本發明還保護所述蛋白或所述基因在誘導ICSl基因啟動子的啟動功能中的應用；所述ICSl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述應用具體可為在擬南芥中誘導重組質粒3^-ProAtresi: :GFP中的所述ICSl基因啟動子啟動GFP基因的表達；所述重組質粒3^-ProAtiesi: :GFP為將326-GFP表達載體I3StI和BamHI酶切位點間的小片段(35S組成型啟動子)取代為了序列表的序列3所示的ICSl基因啟動子(ftx)AtICSl)得到的重組質粒；所述326-GFP表達載體為在pUC19載體的I^stI和EcoRI酶切位點之間插入序列表的序列7所示DNA得到的重組質粒。所述GFP基因如序列表的序列7自5』末端第862-1578位核苷酸所示。本發明還保護所述蛋白或所述基因在誘導PRl基因啟動子的啟動功能中的應用；所述PRl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。所述應用具體可為在擬南芥中誘導重組質粒3^-ProAtPK1: :GFP中的所述PRl基因啟動子啟動GFP基因的表達；所述重組質粒3^-ProAtPK1: :GFP為將326-GFP表達載體I3StI和BioI酶切位點間的小片段(35S組成型啟動子)取代為了序列表的序列4所示的PRl基因啟動子(ProAtPK1)得到的重組質粒；所述326-GFP表達載體為在pUC19載體的I^stI和EcoRI酶切位點之間插入序列表的序列7所示DNA得到的重組質粒。所述GFP基因如序列表的序列7自5，末端第862-1578位核苷酸所示。本發明還保護所述蛋白或所述基因在培育抗性植物中的應用。所述抗性體現為水楊酸合成能力增加和/或抗病害能力增加。所述植物為雙子葉植物或單子葉植物，如擬南芥。所述病害的致病菌可為丁香假單胞桿菌番茄致病變種(細菌)和/或芸苔霜黴菌(真菌)，該兩種微生物均危害葉片。所述病害的致病菌還可為根際萎凋病菌。所述擬南芥具體可為哥倫比亞生態型擬南芥。在本發明的一個實施例中，將ANACOO1基因融合到含有FLAG報告基因的轉化表達載體中，通過與連接有ICSl基因啟動子的GFP報告基因的轉化表達載體共同瞬時轉化植物原生質體，根據螢光顯微鏡觀察植物原生質體是否產生綠色螢光，並提取原生質體總蛋白，分別用GFP和FLAG的抗體進行Wfestern Blotting試驗。結果表明，ANACOO1基因可以誘導ICSl基因啟動子的啟動功能，從而促使GFP報告基因表達。在本發明的另一個實施例中，將ANACOO1基因融合到含有FLAG報告基因的轉化表達載體中，通過與連接有PRl基因啟動子的GFP報告基因的轉化表達載體共同瞬時轉化植物原生質體，根據螢光顯微鏡觀察植物原生質體是否產生綠色螢光，並提取原生質體總蛋白，分別用GFP和FLAG的抗體進行Wfestern Blotting試驗。結果表明，ANAC001基因可以誘導PRl基因啟動子的啟動功能，從而促使GFP報告基因表達。本發明提供的ANAC001蛋白可以通過調控植物中水楊酸的合成，增強植物的抗病性。本發明對於培育抗病植物均有重大價值。


圖1為PCR擴增獲得ANAC001基因的電泳圖。圖2為重組質粒326-ANAC001-FLAG的結構示意圖。圖3為PCR擴增獲得ICSl基因啟動子的電泳圖。圖4為重組質粒326-ftx)AtIcsl: :GFP的結構示意圖。圖5為PCR擴增獲得PRl基因啟動子的電泳圖。圖6為重組質粒3^_ProAtPK1: :GFP的結構示意圖。圖7為重組質粒326-ANAC001-FLAG和重組質粒3^_ProAtresi :GFP共同轉化原生質體後，GFP螢光蛋白的顯微鏡觀測結果。圖8為重組質粒326-ANAC001-FLAG和重組質粒3^_ProAtresi :GFP共同轉化原生質體後，GFP螢光蛋白的Wfestern Blotting結果(內參蛋白為Rubisco大亞基)。
圖9為重組質粒326-ANAC001-FLAG和重組質粒3^_ProAtresi :GFP共同轉化原生質體後，FLAG蛋白的Wfestern Blotting結果(內參蛋白為Rubisco大亞基)。圖10為重組質粒326-ANAC001-FLAG和重組質粒3^_ProAtPK1: :GFP共同轉化原生質體後，GFP螢光蛋白的顯微鏡觀測結果。圖11為重組質粒326-ANAC001-FLAG和重組質粒3^_ProAtPK1: :GFP共同轉化原生質體後，GFP螢光蛋白的Wfestern Blotting結果(內參蛋白為Rubisco大亞基)。圖12為重組質粒326-ANAC001-FLAG和重組質粒3^_ProAtPK1: :GFP共同轉化原生質體後，FLAG蛋白的Wfestern Blotting結果(內參蛋白為Rubisco大亞基)。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，具體步驟可參見《Molecular Cloning =A LaboratoryManual)) (Sambrook J.，Russell, David W.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd edition, 2001,NY, Cold Spring Harbor)。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中所用引物的合成及DNA序列的測定，均由北京英駿生物有限公司進行。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。哥倫比亞生態型擬南芥(Arabidopsis thaliana)，又稱擬南芥或擬南芥Col-0 參考文獻Jin JB, Kim YA, Kim SJ, Lee SH, Kim DH, Cheong Gff, Hwang I. 2001. Anewdynamin-1ike protein, ADL6, is involved in traffickingfrom the trans-GoIginetwork to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell 13:1511-1526.；公眾可以從美國擬南芥生物資源中心(ABRC)購買得到。pUC19載體購自NEB公司，商品目錄號為N3041S。326-FLAG表達載體在pUC19載體的I3StI和EcoRI酶切位點之間插入序列表的序列6所示DNA得到的重組質粒；序列表的序列6所示DNA中，自5，末端第1至835位核苷酸為35S組成型啟動子，第862-933位核苷酸為3XFLAG基因，第934-1192位核苷酸為Nos終止子。326-GFP表達載體在pUC19載體的I^stI和EcoRI酶切位點之間插入序列表的序列7所示DNA得到的重組質粒；序列表的序列7所示DNA中，自5，末端第1至835位核苷酸為35S組成型啟動子，第862-1578位核苷酸為GFP基因，第1579-1837位核苷酸為Nos
終止子。實施例中所用的Anti-GFP抗體為Clontech公司的GFP Living ColorsΑ. V. Monoclonal Antibody (貨號 632381)。實施例中所以那個的 Anti-FLAG 抗體為 Sigma公司的 Anti-FLAG M2Monoclonal Antibody (貨號 F3165)。實施例1、ANAC001蛋白及其編碼基因的獲得1、根據現有的NCBI資料庫及文獻，設置一對引物如下Fl (正向引物)5』 -GCTCTAGAAAATTATTAGATATACCAAACCAG-3』 (下劃線標註 XbaI酶切識別序列)；Rl (反向引物)5 -CGGGATCCGACCAACAAGAATGATCCAACT-3 (下劃線標註 BamHI 酶
8切識別序列)。2、提取哥倫比亞生態型擬南芥葉片的基因組DNA。3、以基因組DNA為模板，採用步驟1設計的引物對，用TaKaRa公司I^rimeSTAR HS高保真酶進行PCR擴增。4、將PCR擴增產物進行測序，如序列表的序列2所示。將序列表的序列1所示的蛋白命名為ANAC001蛋白。將ANAC001蛋白的編碼基因命名為ANAC001基因，其基因組DNA如序列表的序列2所示(自5，末端第130至132位核苷酸為起始密碼子)。實施例2、各個基因的克隆及其重組表達載體的構建一、ANAC001基因的獲得和重組質粒3 -ANACO01-FLAG的構建1、提取哥倫比亞生態型擬南芥葉片的基因組DNA。2、以步驟1的基因組DNA為模板，用Fl和Rl組成的引物對，在TaKaRa公司PrimeSTAR HS高保真酶的作用下進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1 (M代表核苷酸的marker，為TaKaRa公司的DL2000)。3、用限制性內切酶^CbaI和BamHI雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物。4、用限制性內切酶^CbaI和BamHI雙酶切3^-FLAG表達載體，回收約3827bp的載體骨架。5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒326-ANAC001-FLAG (結構示意圖見圖2)。根據測序結果，對重組質粒326-ANAC001-FLAG進行結果描述如下在3^-FLAG表達載體的^CbaI和BamH I酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的ANACOO1基因。二、ICSl基因啟動子(ProAtICSl)的獲得和重組質粒3^_ProAtIcsl :GFP的構建1、檢索NCBI資料庫及文獻，獲得異分支酸合成酶基因的序列(登錄號AT1G74710)，根據序列設計一對靶向啟動子的引物如下F2(正向引物):5，-AACTGCAGTTATCCACGCTTTGTCACACA-3『(下劃線標註 PstI 酶切識別序列)；R2 (反向引物)5』-CGGGATCCCCATTGCAGAAATTCGTAAAGT-3』 (下劃線標註 BamHI 酶切識別序列)。2、提取哥倫比亞生態型擬南芥葉片的基因組DNA。3、以步驟2的基因組DNA為模板，用F2和R2組成的引物對，在TaKaRa公司PrimeSTAR HS高保真酶的作用下進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖3 (M代表核苷酸的marker，為TaKaRa公司的DL2000)。4、用限制性內切酶I3StI和BamHI雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。5、用限制性內切酶I3StI和BamHI雙酶切3^_GFP表達載體，回收約3635bp的載體骨架(去除了 3^-GFP表達載體中的35S組成型啟動子)。6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒326-ProAtIcsl: GFP (結構示意圖見圖4)。根據測序結果，對重組質粒3^_ProAtiesi :GFP進行結構描述如下將326-GFP表達載體I^stI和BamHI酶切位點間的小片段(35S組成型啟動子)取代為了序列表的序列3所示的ICSl基因啟動子(ftx)AtICSl)。
三、PRl基因啟動子(ProAtPK1)的獲得和重組質粒3^-ProAtPK1: :GFP的構建1、檢索NCBI資料庫及文獻，獲得AtPRl的序列(登錄號AT2G14610)，根據序列設計一對靶向啟動子的引物如下F3 (正向引物)5，-AACTGCAGTGGCAAATAAACAACGGACA-3『(下劃線標註 PstI 酶切識別序列)；R3(反向引物)5』 -CCGCTCGAGTAAAATTCATTTTTCTAAGTTGA-3』 (下劃線標註 XhoI酶切識別序列)。2、提取哥倫比亞生態型擬南芥葉片的基因組DNA。3、以步驟2的基因組DNA為模板，用F3和R3組成的引物對，在TaKaRa公司PrimeSTAR HS高保真酶的作用下進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖5 (M代表核苷酸的marker，為TaKaRa公司的DL2000)。4、用限制性內切酶I^stI和BioI雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。5、用限制性內切酶I3StI和BioI雙酶切326-GFP表達載體，回收約3641bp的載體骨架。6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒326-ProAtPE1 ::GFP(結構示意圖見圖6)。根據測序結果，對重組質粒3^-ProAtPK1 :GFP進行結構描述如下將326-GFP表達載體I^stI和B10I酶切位點間的小片段(35S組成型啟動子)取代為了序列表的序列4所示的PRl基因啟動子(ProAtPK1)。四、重組質粒326-T7-FLC的構建合成序列表的序列的序列5所示的T7-FLC基因(自5』末端第1至33位核苷酸為T7標籤、第34至660位核苷酸為FLC基因)，插入3^-FLAG表達載體的Spe I和BamHI酶切位點之間，得到重組質粒326-T7-FLC。FLC基因是一個已知不與ProAtresi和ftx)AtPK1作用的基因。實施例3、ANACOO1基因在誘導ICSl基因啟動子(ProAtICSl)啟動基因表達中的應用一、重組質粒在擬南芥葉片原生質體中的瞬時表達將實施例2構建的重組質粒326-ANAC001-FLAG和重組質粒3^_ProAtiesi GFP共同轉化擬南芥原生質體(將重組質粒326-T7-FLC作為重組質粒326-ANAC001-FLAG的一個負對照；將3^-FLAG表達載體作為重組質粒326-ANAC001-FLAG的另一個負對照)，具體步驟如下1、在MS培養基上萌發哥倫比亞生態型擬南芥種子，待根長至1-3釐米時移栽到土裡，23°C溫室培養(每天光照12h，光照強度為150 μ E)。2、在90mm培養皿中加入20ml雙蒸水，再加入1. 82g D-甘露醇並使其溶解。3、取步驟1中培養4周未抽薹的葉片(約90片)，切成Imm寬的長條，置於步驟2的甘露醇溶液中0. 5小時。4、在 IOOml 三角瓶配置 15ml 酶解體系Cellulase R-IO (購自 YAKULTHONSHA) 150mg、Marcerozyme R-IO (購自 YAKULT H0NSHA) 37. 5mg、MES (購自 USB)30mg、BSA(購自 AMRESC0)15mg、Mannitol (購自 Sigma，貨號 M1902，為 IM Mannitol 母液)7. 5ml、CaCl2(購自 Sigma，貨號 C-2536，為 200mM母液)0. 075ml，其餘為水，用 IM KOH調pH為 5. 6。
5、將步驟3的將細條撈出，置於步驟4的酶解體系中，在黑暗條件下酶解3小時(23°C>40-50rpm)。6、將進行完步驟5的酶解液過100-200目的篩子，將過濾後的綠色混合物置於15ml離心管(直徑約Icm)中，均分為兩管。7、將步驟6的離心管離心、60g) 15分鐘收集沉澱，每管加入冰冷的W5溶液輕柔洗滌，然後離心、100g) 1分鐘收集沉澱，每管加入冰冷的W5溶液輕柔洗滌；冰上放置30分鐘，然後離心(23°C、100g) 1分鐘收集沉澱，每管沉澱用0. 5ml MaMg溶液重懸，即為原生質體溶液。W5 溶液NaCl (購自 Junsei)9g、CaCl2(購自 Sigma，貨號 C-2661) 13. 88g、MES(購自 USB) 0. 292mg,KCl (購自 AMRESC0) 0. 372mg,Glucose (購自 AMRESC0) 0. 902g，用水定容至1L，用 IM KOH 調 pH 為 5. 6。MaMg 溶液Mannitol (購自 Sigma，貨號 M1902) 7. 288g、MgCl2 (購自 AMRESC0，貨號0288-500G)0. 305g、MES(購自 USB) 100mg，用水定容至 100ml，用 IM KOH 調 pH 為 5. 6。8、將重組質粒326-ANAC001-FLAG (或重組質粒326_T7_FLC或3^-FLAG表達載體)和重組質粒3^-ProAtiesi: GFP各取15ug於IOml管中，加300ul原生質體溶液，用200ul槍頭(剪去前端)輕柔混勻；然後加入310ul PEG4000/Ca (NO3)2溶液，輕柔混勻；放置30分鐘(20-30分鐘均可)，然後加入Iml W5溶液來回顛倒混勻，然後離心(23°C、100g) 1分鐘收集沉澱；加入IOOul W5溶液混勻，然後再加900ul W5溶液混勻。設置只轉染326-GFP表達載體的正對照。PEG4000/Ca (NO3) 2 溶液PEG40004g、Mannitol (購自 Sigma，貨號 M1902，為IMMannitol 母液)4ml、Ca (NO3)2Img、dH20 1.8ml，用水定容至 10ml。9、將步驟8得到的混合液置於六孔板內，23°C孵育12小時。二、螢光顯微鏡觀察吸取30ul步驟一的9中孵育完成的混合液，置於載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片後，放於^ISS AXI0SK0P螢光顯微鏡下進行觀察和拍照。結果見圖7。在螢光觀測下共同轉化重組質粒3^_ProAtiesi: :GFP和重組質粒326-ANAC001-FLAG的原生質體中，出現了與轉化326-GFP載體的正對照相同的綠色螢光；共同轉化重組質粒3^-ProAtiesi: :GFP和重組質粒326_T7_FLC (或3^-FLAG表達載體)的原生質體並不能觀察到明顯的綠色螢光。結果表明，ANAC001蛋白可以與ICSl啟動子區作用，促使其後續GFP基因表達，ANAC001基因在正調控水楊酸合成關鍵酶ICSl的啟動子上，起到了促進的作用。三、Western Blotting 檢測吸取30ul步驟一的9中孵育完成的混合液，進行SDS-PAGE電泳(分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%、長度為1cm;電流採用20mA)，然後採用Anti-GFP抗體(或Anti-FLAG抗體)和羊抗鼠的辣根過氧化物酶HRP抗體進行^festern Blotting。採用Anti-GFP抗體雜交的結果見圖8。在共同轉化了重組質粒326_ProAtiesi :GFP和重組質粒326-ANAC001-FLAG的原生質體中，出現了與轉化326-GFP載體的正對照相同的條帶，可以確定為GFP條帶。共同轉化重組質粒3^-ProAtresi GFP和重組質粒326-T7-FLC (或3^-FLAG表達載體)，GFP蛋白信號的低得多。
採用Anti-FLAG抗體雜交的結果見圖9。在共同轉化了重組質粒326-ProAtiesi: :GFP和重組質粒326-ANAC001-FLAG的原生質體中，ANACOO1基因確實得到了表達，這就進一步從蛋白水平說明了 ANAC001基因所表達的蛋白可以與ICSl的啟動子區作用，並且促使其後續GFP基因的表達。因此可以判斷，ANAC001基因在正調控水楊酸合成關鍵酶基因ICSl的啟動子上，起到了促進的作用。實施例4、ANAC001基因在誘導PRl基因啟動子(ProAtPK1)啟動基因表達中的應用一、重組質粒在擬南芥葉片原生質體中的瞬時表達用重組質粒3^-ProAtPK1: :GFP代替重組質粒3^_ProAtiesi :GFP，其它同實施例3的步驟一。二、螢光顯微鏡觀察同實施例3的步驟二。結果見圖10。在螢光觀測下，在共同轉化了重組質粒3^-ProAtPK1: :GFP和重組質粒326-ANAC001-FLAG的原生質體中，出現了與轉化326-GFP載體的正對照相同的綠色螢光；共同轉化重組質粒3^-ProAtPK1: :GFP和重組質粒326_T7_FLC (或3^-FLAG表達載體)的原生質體並不能觀察到明顯的綠色螢光。結果表明，ANAC001蛋白促進了抗病基因PRl啟動子起始轉錄，並且促使其後續GFP基因的表達。ANAC001基因可能是通過調控植物水楊酸的合成促進了抗病基因PRl啟動子的起始轉錄。三、Western Blotting 檢測同實施例3的步驟三。採用Anti-GFP抗體雜交的結果見圖11。在共同轉化了重組質粒326-ProAtPK1: :GFP和重組質粒3^-ANAC001-FLAG的原生質體中，出現了與轉化326-GFP的正對照相同條帶，可以確定為GFP條帶。共同轉化重組質粒3^-ProAtPK1: :GFP和重組質粒326_T7_FLC(或326-FLAG表達載體)的原生質體中，並沒有GFP蛋白信號。採用Anti-FLAG抗體雜交的結果見圖12。在共同轉化重組質粒3^-ProAtPK1: :GFP和重組質粒326-ANAC001-FLAG的原生質體中，ANACOO1基因確實得到了表達，這也進一步說明了 ANAC001蛋白誘導了抗病基因PRl啟動子起始轉錄，促使了後續GFP基因的表達。ANACOO1基因可能通過調控植物水楊酸的合成促進了抗病基因PRl啟動子的表達。
1權利要求
1.一種蛋白質，是如下(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的任意一種(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有誘導ICSl基因啟動子啟動功能的由序列1衍生的蛋白質；所述ICSl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列3所示；(c)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有誘導PRl基因啟動子啟動功能的由序列1衍生的蛋白質；所述PRl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列4所示；(d)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物中的水楊酸合成相關的由序列1衍生的蛋白質；(e)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗性相關的由序列1衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特徵在於所述基因是如下1)至10)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列2自5』末端第130至1416位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有誘導ICSl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有誘導ICSl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；5)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有誘導PRl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；6)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有誘導PRl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；7)在嚴格條件下與1)或幻限定的DNA序列雜交且編碼植物水楊酸合成相關蛋白的DNA分子；8)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物水楊酸合成相關蛋白的DNA分子；9)在嚴格條件下與1)或幻限定的DNA序列雜交且編碼植物抗性相關蛋白的DNA分子；10)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗性相關蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於所述重組表達載體為在3^-FLAG表達載體的多克隆位點插入序列表的序列2所示DNA片段得到的重組質粒；所述3^-FLAG表達載體為在PUC19載體的多克隆位點插入序列表的序列6所示DNA得到的重組質粒。
6.權利要求1所述蛋白在誘導ICSl基因啟動子的啟動功能中的應用；所述ICSl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
7.權利要求1所述蛋白在誘導PRl基因啟動子的啟動功能中的應用；所述PRl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
8.權利要求2或3所述基因在誘導ICSl基因啟動子的啟動功能中的應用；所述ICSl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
9.權利要求2或3所述基因在誘導PRl基因啟動子的啟動功能中的應用；所述PRl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
10.權利要求1所述蛋白，和/或，權利要求2或3所述基因，在培育抗性植物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種植物抗性相關蛋白ANAC001及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白，命名為ANAC001蛋白，來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下任意一種(a)序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有如下任一功能的由序列1衍生的蛋白質誘導ICS1基因啟動子啟動功能、誘導PR1基因啟動子啟動功能、與植物中的水楊酸合成相關、與植物抗性相關的由序列1衍生的蛋白質。本發明提供的ANAC001蛋白可以通過調控植物中水楊酸的合成，增強植物的抗病性。本發明對於培育抗病植物均有重大價值。
文檔編號C12N15/63GK102367272SQ20111031656
公開日2012年3月7日 申請日期2011年10月18日 優先權日2011年10月18日
發明者李媛, 蔡斌, 金京波 申請人:中國科學院植物研究所