一種花葯特異表達啟動子PV4及其應用的製作方法
2023-05-03 19:30:07
本發明涉及生物技術和植物基因工程領域，特別涉及一種花葯特異表達啟動子pv4及其應用。
背景技術：
啟動子是rna聚合酶特異性識別和結合的dna序列，控制基因表達的起始時間、表達程度和表達位置。按其功能，主要分為組成型啟動子、誘導型啟動子和特異性啟動子三大類。組成型啟動子表達基因沒有時空特異性，在各組織器官均有表達，如玉米ubiqultin啟動子、水稻actinl啟動子和花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動子；誘導型啟動子控制的基因，其表達受各種誘導因子，如激素、化學物質、溫度和光等的誘導表達；而特異性啟動子控制的基因的表達具有器官或組織特異性和時空性，如水稻花器官特異表達啟動子osm45、水稻花葯特異性啟動子osg6b、菸草花葯絨氈層特異性啟動子ta29等。
植物基因工程操作和轉基因方法使外源基因導入植物更為有效，為功能基因組的開展和農作物基因工程育種奠定了基礎。常規轉基因操作，都需要利用抗生素作為篩選標記，提高轉基因植物篩選的效率。由於常規轉基因植物，大多保留了抗性篩選基因，這大大增加了人們對轉基因植物，特別是轉基因食品安全性的憂慮，擔心以抗生素為篩選標記的選擇標記基因及其產物在食用時會產生毒性或引起過敏反應。儘管並沒有確切的證據證實存在這種安全隱患，但這種憂慮嚴重地阻礙了轉基因植物產品的產業化和商業化進程。因此，建立一種簡單、高效的無篩選標記的植物重組表達載體系統，對提高轉基因植物的安全性，促進其產品的產業化和商業化進程有著十分重要的作用和意義。
無篩選標記轉基因植物獲得的方法主要有：共轉化方法(包括使用雙t-dna區載體)、轉座子方法、同源重組法和位點特異性重組方法。其中位點特異性重組方法是目前用得最廣的方法，其主要是利用重組酶與其特異識別的dna位點，主要包括來源於噬菌體p1的cre/loxp系統、酵母2μ質粒的flp/frt系統和酵母psrl的r/rs系統。其中cre/loxp系統是目前研究與使用最多的成熟系統。利用cre/loxp系統進行標記基因刪除(markerfree)操作的策略主要有兩類：(1)把cre酶基因表達盒用雜交或再轉化的間接方法，導入篩選標記基因含有loxp位點的轉基因植物，再通過自交進一步分離去掉重組酶基因及轉化重組酶基因所引入的另一個篩選標記，整個過程耗時費力，也不適於無性繁殖植物；(2)表達cre酶，直接切除位於兩個同向loxp位點內的篩選標記基因和cre酶基因表達盒本身，相比之下，第二種策略更加簡單有效。由於cre重組酶基因在植物中組成型表達會導致植物形態和產量性狀的改變。因此，使用器官特異誘導啟動子，在特定器官和特定時期調控cre重組酶基因表達，能夠實現轉基因植物的抗性篩選標記基因和cre酶基因表達盒的自身切除。目前，已有一些利用誘導啟動子和器官特異啟動子控制cre酶基因的表達，成功實現轉基因植物的markerfree操作的報導。如菸草花葯絨氈層特異性啟動子ta29控制cre的表達來獲得markerfree的轉基因植物，但是它在單子葉植物中去除標記基因效率不高。因此，尋找和利用新的、更加有效地植物器官特異表達啟動子，對於提高轉基因植物安全性具有重要的現實意義。
技術實現要素：
本發明的首要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種花葯特異表達啟動子pv4。
本發明的另一目的在於提供上述花葯特異表達啟動子pv4的應用。
本發明的再一目的在於提供一種無篩選標記轉化載體系統，其含有花葯特異表達啟動子pv4。
本發明的目的通過下述技術方案實現：一種花葯特異表達啟動子pv4，是具有如下特徵的dna分子：其核苷酸序列如seqidno:1所示；或是在嚴格條件下與seqidno:1限定的dna序列雜交的dna分子；或是與seqidno:1限定的dna序列具有90％以上的相似性，且能調控目的基因在花葯中特異表達的dna分子。
該花葯特異表達啟動子pv4，是水稻villin4基因(loc_os04g51440)的啟動子，能啟動villin4在水稻花葯中特異性表達，其中在成熟期花葯中表達最高，而在其它組織器官如根、莖、葉等器官中沒有表達。
所述的花葯優選為水稻花葯。
所述的花葯特異表達啟動子pv4在構建於花葯中特異性表達的基因表達盒或是於花葯中特異性表達的表達載體中的應用。
一種於花葯中特異性表達的基因表達盒，包含上述花葯特異表達啟動子pv4。
所述的於花葯中特異性表達的基因表達盒，還包括目的表達基因和終止子。
一種於花葯中特異性表達的表達載體，包含上述花葯特異表達啟動子pv4或是上述於花葯中特異性表達的基因表達盒。
所述的於花葯中特異性表達的表達載體優選為無篩選標記轉化載體系統；更優選為含有所述pv4啟動子的植物cre/loxp重組表達載體，可在植物中實現篩選標記基因刪除。
所述的植物cre/loxp重組表達載體的t-dna區內含有兩個同向loxp序列，兩個同向1oxp序列之間含有cre重組酶表達盒和標記基因表達盒；cre重組酶表達盒中啟動cre重組酶表達的啟動子是所述的pv4啟動子。
所述的植物cre/loxp重組表達載體還含有多克隆位點或外源目的基因的表達盒；多克隆位點或外源目的基因表達盒位於t-dna區內，在所述兩個同向loxp序列區間之外。
所述的植物cre/loxp重組表達載體被轉入植物後，能在花葯發育過程中將所述兩個同向loxp序列之間的cre重組酶表達盒和篩選標記基因表達盒刪除，從而去除標記基因和cre基因本身。
所述的植物cre/loxp重組表達載體具體可為如圖3所示的9個表達載體，即pyl-pv4mf1、pyl-pv4mf2、pyl-pv4mf3、pyl-pv4mf4、pyl-pv4mf5、pyl-pv4mf6、pyl-pv4mf7、pyl-pv4mf8和pyl-pv4mf9。
所述的植物cre/loxp重組表達載體，可用於轉化單子葉植物或雙子葉植物，培育無篩選標記的轉基因植物。
所述的單子葉植物包括水稻、玉米、小麥、高粱、大麥、燕麥、黑麥等，優選為水稻。
本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果：
本發明用含有pv4啟動子的植物cre/loxp重組表達載體的轉基因實驗證明，在轉基因植物中，pv4啟動子可以控制cre重組酶在花葯中的特異表達，而在愈傷組織和根、莖、葉等器官中沒有表達。這樣可以不影響轉基因愈傷細胞的抗性篩選，得到轉基因植株和在花葯產生刪除標記基因的雄配子，最終在轉基因植物後代中可篩選到無篩選標記(markerfree)的轉基因植物。
附圖說明
圖1為pv4啟動子驅動的水稻villin4基因的qrt-pcr表達模式結果圖；其中，用水稻osactin1基因作為表達內參。
圖2為pv4啟動子中預測的組織特異表達的相關功能元件示意圖，其中，小寫字母為內含子；下劃線加陰影為5』utr區；粗體為重要的花粉特異元件。
圖3為含pv4啟動子的植物cre/loxp重組表達載體系統圖譜圖；其中，圖(a)是具有多克隆位點的不同植物篩選抗性的cre/loxp重組表達載體示意圖，pyl-pv4mf1、2、3的抗性分別是潮黴素hpt、卡拉黴素nptii以及草甘膦bar；圖(b)是具有玉米ubi啟動子驅動目的基因(待克隆)表達盒的不同植物篩選抗性cre/loxp重組表達載體，pyl-pv4mf4、5、6的抗性基因分別是抗潮黴素基因hpt、抗卡拉黴素基因nptii以及抗草甘膦基因bar；圖(c)是具有花椰菜35s啟動子驅動目的基因(待克隆)表達盒的不同植物篩選抗性基因-cre/loxp重組表達載體，pyl-pv4mf7、8、9的抗性基因分別是hpt、nptii以及bar。
圖4為pyl-pv4mf1轉化的t0代植株的hpt基因的pcr檢測結果圖。
圖5為pyl-pv4mf1轉化的t0植株#1的cre基因的rt-pcr表達分析結果圖。
圖6為pv4控制cre/loxp系統的篩選標記刪除的模式圖；pv4在花葯中驅動cre基因表達，在花葯中自刪除篩選標記基因和cre基因，最終在後代中獲得完全無篩選標記的植株。
圖7為pyl-pv4mf1的t1代植株以p1、p2和p3為引物的pcr擴增檢測篩選標記刪除情況結果圖。
圖8為pyl-pv4mf1的t1代植株發生篩選標記刪除的p1/p3pcr產物測序結果圖。
具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規分子生物學方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。
表1實施例中各個名稱引物對應的核苷酸序列
實施例1
水稻花葯特異表達啟動子pv4的克隆與分析：
s1.水稻villin4基因的表達模式：在本發明的前期研究中，為分離克隆花葯特異表達的啟動子，通過對ricexpro晶片(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)的分析，發現水稻微絲髮育相關的villin4基因(loc_os04g51440)主要在水稻花葯中特異高表達。
提取水稻(品種日本晴)愈傷組織、根、莖、葉及不同發育時期花葯和雌蕊的總rna反轉錄成cdna，通過qrt-pcr分析villin4基因的表達(引物為fq-v4/rq-v4)，用水稻osactin1作為內參基因(引物為factin1/ractin1，大小約250bp)，反應程序：95℃預變性30s；95℃變性5s，58℃退火20s，72℃延伸15s，72℃15s讀板，40個循環；55℃至90℃溶解曲線。結果表明，該基因在愈傷、根、莖等組織沒有表達，在葉和雌蕊中有微弱表達，主要是在花葯發育後期高表達(圖1)。因此，villin4基因是一個花葯特異表達的基因，其啟動子pv4是一個花葯特異表達的啟動子。
s2.villin4基因的啟動子pv4的克隆和順式元件分析：villin4基因的atg上遊區1kb處是另一基因的3』端，因此用引物f1/r1擴增水稻(日本晴)dna，連入t載體puc18後測序，獲得villin4基因的啟動子pv4(seqidno:1)，即獲得t-pv4載體；用啟動子順式元件預測網站place(http://www.dna.affrc.go.jp/place/signalup.html)分析seqidno:1，預測結果顯示pv4存在多個器官或組織特異性表達的相關元件，含有多個花粉特異表達元件，進一步表明pv4是一個花葯特異表達啟動子(圖2)。所用pcr擴增程序：94℃預變性4min；94℃變性30sec、58℃退火30sec、72℃延伸1min，共35個循環；最後72℃再延伸5min。
實施例2
含pv4啟動子的植物cre/loxp重組表達載體系統pyl-pv4mf1～9的構建：
s1.pyl-pv4mf1～3重組表達載體的構建：
s1.1.中間載體pyl-mcs的構建：用引物f1300/r1300(引物5』末端分別含psti和pmei位點)反向擴增質粒pcambia1300(cambia公司)，獲得含psti和pmei位點、且含t-dna區的載體骨架(去除hpt表達盒)；直接合成含多個唯一酶切位點的psti/fsei/hindiii/saci/asci/swai/sbfi/paci/mlui/pmei多克隆位點片段mcs-i；用psti和pmei雙酶切mcs-i，連入載體骨架的相同位點，獲得中間載體pyl-mcs。
合成的mcs-i片段序列如下：
5』-aattaactgcagatccaggccggccataagctttgagctctaagcgcgcctatttaaatacctgcaggtttaattaagaacgcgttcagtttaaacttaaatta-3』(下劃線分別對應psti/fsei/hindiii/saci/asci/swai/sbfi/paci/mlui/pmei位點)。
s1.2.pyl-pv4mf1的構建：用引物f-p-lox/r-fsei從pcambia1300質粒擴增2.2kb的hpt表達盒，並在兩側加入psti/loxp位點序列和fsei位點，psti和fsei雙酶切、連入中間載體pyl-mcs的相同位點，獲得中間載體pyl-loxp-hpt；用引物f-p-lox/r-fsei從pcambia2301(cambia公司)質粒擴增約2.0kb的nptii表達盒，psti和fsei雙酶切、連入中間載體pyl-mcs的相同位點，獲得中間載體pyl-loxp-nptii；用引物f-p-lox/r-fsei從pcambia3301(cambia公司)質粒擴增約1.6kb的bar表達盒，並在兩側加入psti-loxp位點序列和fsei位點，psti和fsei雙酶切後連入中間載體pyl-mcs的相同位點，獲得中間載體pyl-loxp-bar；
pv4啟動cre基因的表達盒拼接：用引物f-pv4-loxp-hindiii/r-pv4從t-pv4載體上擴增1kb左右pv4啟動子，獲得引入loxp位點的pv4啟動子片段a；參考cre酶基因序列(genbankno.dq340306)合成的1.3kbcre基因，用引物f-cre1/r-cre1擴增，作為片段b；用引物f-tnos/r-tnos-fsei從質粒pcambia1305(cambia公司)擴增0.38kb的nos終止子tnos，作為片段c；上述每個片段一側，分別帶有20～25bp的同源序列，利用基於gibson克隆的原理(gibson,2011,enzymaticassemblyofoverlappingdnafragments.methodsenzymol.,498:349-361.)的等溫重組反應後的irr-pcr(isothermalrecombinationreaction-basedpcr)方法(具有同源末端的多個小片段，混合後加入gibsonassemblymastermix(neb公司)進行等溫重組反應(50℃、30分鐘)，再以反應產物作為模板直接進行pcr擴增，體外拼接成完整大片段(chenw,zengd,shenr,max,zhangq,chenl,liuy-g,zhuq.2016,rapidinvitrosplicingofcodingsequencesfromgenomicdnabyisothermalrecombinationreaction-basedpcr.biotechnology&biotechnologicalequipment,30:864-868.)，用引物f-pv4-loxp-hindiii/r-tnos-fsei直接拼接三個片段獲得了結構為fsei-cre-loxp-hindiii的表達盒；把含花葯特異啟動子pv4的cre基因的表達盒(fsei-cre-loxp-hindiii表達盒)直接酶切連接，插入fsei和hindiii酶切的中間載體pyl-loxp-hpt，獲得植物篩選標記為hpt的cre/loxp重組表達載體pyl-pv4mf1(圖3a)。
s1.3.pyl-pv4mf2的構建：把含花葯特異啟動子pv4的cre基因的表達盒(fsei-cre-loxp-hindiii表達盒)直接酶切連接，插入fsei和hindiii酶切的中間載體pyl-loxp-nptii，獲得植物篩選標記為nptii(卡拉黴素)的cre/loxp重組表達載體pyl-pv4mf2(圖3a)。
s1.4.pyl-pv4mf3的構建：把含花葯特異啟動子pv4的cre基因的表達盒(fsei-cre-loxp-hindiii表達盒)直接酶切連接，插入fsei和hindiii酶切的中間載體pyl-loxp-bar，獲得植物篩選標記基因為bar(抗草甘膦)的cre/loxp重組表達載體pyl-pv4mf3(圖3a)。
s2.pyl-pv4mf4～6重組表達載體的構建:
s2.1.pyl-pv4mf4的構建：參考玉米ubi啟動子序列(genbankno.jx947345)用引物f-ubi-hindiii/r-ubi-saci直接從抽提的玉米葉片dna中pcr擴增獲得，ubi啟動子兩端引物引入hindiii和saci位點，再用hindiii和saci雙酶切連入pyl-pv4mf1的相同位點，獲得中間載體pyl-pv4mf1-ubi；用引物f-tnos-mlui/r-tnos-pmei從質粒pcambia1305(cambia公司)擴增0.38kb的nos終止子tnos，引入mlui/pmei雙酶切位點，再用mlui/pmei雙酶切連入中間載體pyl-pv4mf1-ubi的相同位點，最終獲得植物篩選標記為hpt，並具有pubi-mcs-tnos表達盒的cre/loxp重組表達載體pyl-pv4mf4載體(圖3b)。
s2.2.pyl-pv4mf5的構建：用hindiii和pmei雙酶切pyl-pv4mf4載體獲得pubi-mcs-tnos表達盒，直接連入相同位點的pyl-pv4mf2載體，獲得植物篩選標記為nptii，並具有pubi-mcs-tnos表達盒的cre/loxp重組表達載體pyl-pv4mf5(圖3b)。
s2.3.pyl-pv4mf5的構建：用hindiii和pmei雙酶切pyl-pv4mf4載體獲得pubi-mcs-tnos表達盒，直接連入相同位點的pyl-pv4mf3載體，獲得植物篩選標記為bar，並具有pubi-mcs-tnos表達盒的cre/loxp重組表達載體pyl-pv4mf6(圖3b)。
s3.pyl-pv4mf7～9重組表達載體的構建：
s3.1.pyl-pv4mf7的構建：用引物f-p35s-hindiii/r-p35s-saci從質粒pcambia1305(cambia公司)直接擴增獲得加hindiii和saci位點雙位點花椰菜病毒p35s啟動子，再用hindiii和saci雙酶切連入pyl-pv4mf1的相同位點，獲得中間載體pyl-pv4mf1-35s；用引物f-tnos-mlui/r-tnos-pmei從質粒pcambia1305(cambia公司)擴增0.38kb的nos終止子tnos，引入mlui/pmei雙酶切位點，再用mlui/pmei雙酶切連入中間載體pyl-pv4mf1-35s的相同位點，最終獲得植物篩選標記為hpt，並具有p35s-mcs-tnos表達盒的cre/loxp重組表達載體pyl-pv4mf7載體(圖3c)。
s3.2.pyl-pv4mf8的構建：用hindiii和pmei雙酶切pyl-pv4mf7載體，獲得p35s-mcs-tnos表達盒，直接連入相同位點的pyl-pv4mf2，獲得植物篩選標記為nptii，並具有p35s-mcs-tnos表達盒的cre/loxp重組表達載體pyl-pv4mf8(圖3c)。
s3.3.pyl-pv4mf9的構建：用hindiii和pmei雙酶切pyl-pv4mf7載體，獲得p35s-mcs-tnos表達盒，直接連入pyl-pv4mf3的相同位點，獲得植物篩選標記為bar，並具有p35s-mcs-tnos表達盒的cre/loxp重組表達載體pyl-pv4mf9(圖3c)。
實施例3
無篩選標記(markerfree)轉基因植株的獲得與分析：
s1.含pv4的cre/loxp重組表達載體pyl-pv4mf1的水稻轉化與檢測
s1.1.水稻的遺傳轉化：把cre/loxp重組表達載體pyl-pv4mf1質粒轉入農桿菌eha105，得到轉化有pyl-pv4mf1質粒的農桿菌，用於轉化水稻(日本晴)胚愈傷組織。水稻遺傳轉化方法按照nishimura等(2006)詳細報導的方法進行(nishimura,etal.2006,aprotocolforagrobacterium-mediatedtransformationinrice.natprotoc.，1:2796-2802。下同)。將水稻未成熟種子或成熟種子，在25℃黑暗條件下誘導愈傷組織。用適量的pyl-pv4mf1質粒的農桿菌懸浮於加有100μmol/l乙醯丁香酮的侵染液培養基(aam培養基)(nishimura，etal.,2006)中，28℃震蕩培養(200rpm，0.5h)，用分光光度計調od550值為0.3～0.4，即可用於愈傷組織的浸染。挑選顏色新鮮呈淡黃色、生長旺盛的顆粒狀胚性愈傷組織，和前述調節好od值的農桿菌菌液混合，浸泡20min，吸乾菌液後轉到共培養培養基(2n6-as培養基)(nishimura，etal.,2006)，暗培養3天後，轉移到含50mg/l潮黴素的篩選培養基(n6d-s培養基)(nishimura，etal.,2006)上，每2周繼一次代，繼代2次。抗性篩選後，把帶有綠點的抗性愈傷轉到有分化培養基(hiei，etal.,1994)上，分化出轉化苗，獲得t0轉化植株。
s1.2.轉化植株基因組pcr檢測：對獲得的t0代植株葉片，用sds法抽提基因組dna作為模板，用pcr擴增方法，檢測外源hpt片段(約330bp)，引物為f-hpt/r-hpt所用擴增程序：94℃預變性4min；94℃變性30sec，58℃褪火30sec，72℃延伸30sec，共30個循環；最後72℃再延伸5min。結果顯示，野生型(wt)對照都不能擴出外源基因，轉基因植株都能擴出上述hpt片段(圖4)。
s1.3.t0代轉化體cre基因的rt-pcr表達檢測：
利用trizol方法，抽提t0轉化體(#1)抗性愈傷組織、分化產生的根、莖、葉以及成熟花葯的總rna，用mmv逆轉錄試劑盒，oligdt引物反轉錄為cdna，用引物f-rt-cre/r-rt-cre、f-hpt/r-hpt和factin1/ractin1分別進行cre基因(約290bp)、hpt(約330bp)和水稻內源actin1基因(內參，約250bp)的rt-pcr表達檢測。所用擴增程序：94℃預變性4min；94℃變性30sec，58℃褪火30sec，72℃延伸30sec，共25個循環；最後72℃再延伸5min。結果顯示，pv4驅動cre基因只在花葯裡表達，在愈傷、根、莖和葉中均無表達(圖5)，說明pv4確實是花葯特異表達啟動子。
s2.轉pyl-pv4mf1水稻t1代植株篩選標記刪除鑑定
s2.1.pv4控制cre/loxp系統的標記基因刪除原理：pv4是花葯特異啟動子，在轉基因的t0轉化體中，只在花葯中驅動cre基因表達，而在其他器官不表達。在花葯中，當cre基因表達時，位於兩個同向loxp位點間的hpt基因(標記基因)和cre基因同時被刪除，只留下一個loxp位點。由於標記刪除發生在t0代植株的雄配子而不發生在雌配子，在t1代植株中，這種篩選標記刪除是雜合的；但在下一代(t2)植株中，就能分離獲得大量的標記完全刪除純合的轉基因植物(圖6)。
s2.2.pcr鑑定標記刪除的轉基因植物：對獲得的t1代植株葉片，用sds法抽提基因組dna作為模板，用pcr擴增方法，檢測標記基因刪除情況。用引物p1、p2、p3同時進行三引物pcr擴增；其中p2位於hpt基因編碼區內測，與p1擴增產物約500bp；p1和p3位於兩個loxp位點外側，當沒發生刪除時距離約5.2kb，在30sec延伸條件下是不能擴增的，而只有當發生刪除時，才能擴增出刪除hpt/cre後產生的230bp的小片段。所用擴增程序：94℃預變性4min；94℃變性30sec，60℃褪火30sec，72℃延伸30sec，共30個循環；最後72℃再延伸5min。結果顯示，t1代植株大多發生了預期的標記刪除(圖7)。
s2.3.刪除小片段pcr產物測序鑑定：對p1/p3擴增的刪除hpt/cre後產生的230bp的小片段pcr產物進行直接測序，結果表明該片段與預期的片段序列完全一致(圖8)。
上述結果表明，pv4控制的cre/loxp重組表達載體在轉基因植物t1代中，就能按預期設計在花葯中實現標記基因的刪除，在其下一代植株中，就能獲得標記刪除純合的轉基因植物。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
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華南農業大學
一種花葯特異表達啟動子pv4及其應用
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水稻
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12
71
dna
artificialsequence
f-pv4-loxp-hindiii
12
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13
48
dna
artificialsequence
r-pv4
13
gtacggtcagtaaattggacatgcttgatgttgtgaaagagcctttcc48
14
48
dna
artificialsequence
f-cre1
14
ggaaaggctctttcacaacatcaagcatgtccaatttactgaccgtac48
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44
dna
artificialsequence
r-cre1
15
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16
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f-tnos
16
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r-tnos-fsei
17
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19
39
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19
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20
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21
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36
dna
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22
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f-hpt
24
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25
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r-hpt
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26
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f-rt-cre
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r-rt-cre
27
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28
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p1
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21
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p2
29
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30
23
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p3
30
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31
104
dna
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多克隆位點片段mcs-i
31
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cctgcaggtttaattaagaacgcgttcagtttaaacttaaatta104