基於植物甾醇和甘油酯的反膠束及其治療用途的製作方法

2023-04-23 08:15:51

專利名稱：：基於植物甾醇和甘油酯的反膠束及其治療用途的製作方法
技術領域：
：本發明主要涉及一種包含水溶性治療活性劑的反膠束體系。特別地，本發明的反膠束可用於遞送藥物。本發明還涉及包含所述反膠束的藥物組合物及其製備方法。
背景技術：
：在過去幾年，各種各樣的方法被提出來用於改進耙部位的藥物遞送。第一，藥物必須以合適並且簡便的方式給藥，例如通過口服或直腸途徑，第二，活性成分必須以活性形式遞送到靶細胞。一些藥物在經過胃腸道(GIT)的過程中難以吸收並且不穩定，尤其是蛋白質和肽類。到目前為止已做出多種嘗試以改進多肽類和肽類的遞送，尤其是通過口服途徑的遞送，例如胰島素(用於治療糖尿病)、幹擾素(用於治療肝炎)、細胞因子(用於治療癌症)等。然而，目前這些藥物的給藥是通過非胃腸道注射。現今，40%的新藥只能通過非胃腸道注射給藥。儘管口服給予蛋白質和肽類面臨固有的難題，但是多種方法已被提出用以改善口服吸收。看似可信的策略包括化學修飾以穩定藥物和/或使其更具脂溶性並從而提高其擴散穿越脂質膜或胃腸道的機會。其他研究者加入穩定劑例如肽酶抑制劑(例如，抑肽酶)以減少代謝損失，還有一些研究者採用非離子表面活性劑、膽鹽及其類似物、磷脂、螯合劑或醯基肉毒鹼形式的各種吸收促進劑。許多專利和公開出版物也描述了將活性成分包囊入納米顆粒或微米顆粒的方法。但是，到目前為止，沒有一種己開發的遞送系統是完全令人滿意的，尤其是對於胰島素而言。例如，至今已公開的遞送系統只能使胰島素的吸收率在2-5%。患有1型或2型糖尿病的人常常用胰島素治療。儘管注射設備在改進並且入侵性減少(例如，筆狀設備)，但是注射劑仍然存在缺點並且非常不受歡迎。非注射式製劑具有更多優點。除了更具有患者親和性，這些製劑可以提高依從性，使得療效更好並減少與糖尿病有關的併發症。發明人之前己披露了將兩種脂質與一些金屬鹽攪拌會增加金屬生物利用度並因此用1000至5000倍更低的劑量即可獲得相同的治療活性；所述金屬鹽的可能的毒性從而可以被減少[例如，見US6,129,924、WO02/36134和WO2004/075990]。本發明的目的是克服現有技術的不足。更具體地，本發明的目的是提供包含活性成分的藥物遞送系統，該系統可口服給藥並且具有令人滿意的生物利用度。本發明涉及用於釋放所需的治療劑的跨膜轉運遞送系統，以及相關組合物和製備該遞送系統的方法。更具體地，本發明提供一種用於配藥的反膠束轉運體系。更具體地，本發明的反膠束促進生物活性分子跨黏膜上皮屏障吸收並使得活性成分被靶細胞內化。本發明的反膠束更具體地包含至少一種水溶性治療活性成分、植物甾醇、甘油酯和水。更具體地，本發明涉及具有小於或等於100nm的水性核心的反膠束。所述反膠束可以用植物甾醇和甘油酯通過特定的方法製備。所述膠束更具體地是通過下列方法獲得(a)將(i)植物甾醇，(ii)甘油酯，優選脂肪酸甘油二酯，(iii)水，尤其是純淨水，和(iv)至少一種水溶性治療活性成分接觸，(b)在4(TC或40'C以下，攪拌步驟(a)中得到的混合物，並持續足夠長的時間以形成反膠束，所述攪拌是以約1000至約5000轉/分鐘的速度機械性地進行或通過超聲處理進行。本發明進一步涉及包含本發明反膠束和藥學可接受載體、賦形劑或輔劑的組合物。具體實施例方式下列文字僅僅用於舉例說明優選的實施方案，並不限制併入一些使本發明產生效果所必需的特徵。反膠束本發明的反膠束體系的特徵在於是包含存在於油中的水微滴分散體的微乳。所述分散體在水/油表面用表面活性劑(甘油酯，更優選脂肪酸甘油二酯)來穩定。反膠束相可定義為其中由水形成內相而脂質的疏水尾部形成連續相的一種體系。包含油(類)、表面活性劑(類)和水相的反膠束還表徵為油包水微乳。膠束的尺寸似乎隨著(水)/(表面活性劑)的重量比w(混合物中被增溶的水/混合物中的表面活性劑)而線性變化。如前文所述，混合物中水的相對重量(W)優選低於或等於甘油酯優選脂肪酸甘油二酯的量的2.5倍，並且優選低於或等於1倍。更具體地，W是0.01至0.2。按照具體的實施方案，所述比例W優選自0，05至0.18。反膠束，例如其核心的尺寸，可用不同的方法表徵-X-射線散射-中子散射-透射電子顯微鏡(TEM)-動態光散射(DLS)本發明的反膠束體系中脂質組分(植物甾醇和甘油酯)的比例可以在大範圍內變化，例如植物甾醇/甘油酯的重量比可以在0.01至l(包含端點)的範圍內。根據一個具體實施方案，相對於植物甾醇(優選谷甾醇)可以採用過量的甘油酯(優選脂肪酸甘油二酯)。更具體地，植物甾醇/甘油酯的重量比大於或等於O.l，更優選自0.1至0.2。反膠束體系的化合物可以通過適當的方法分析。更具體地，植物甾醇可以用氣相色譜分析法鑑定，而甘油酯可用高效液相色譜法(HPLC)鑑定，尤其是用光散射檢測器，於矽膠柱(KromasilC18)上，在洗脫液的存在下進行，例如恆組成(isocmtic)乙腈。氣相色譜法也可用於分析甘油二酯。反膠束是動態系統。布朗運動導致膠束不斷地碰撞，這引起膠束的聚結以及水性核心的交換。膠束髮生分離和再生，並允許不同溶液之間發生化學反應。膠束之間的交換速率尤其隨著溫度、表面活性劑烴鏈的長度、以及W比(游離水使所述交換增加)而增加。在本發明的範疇之內，與納米技術中所期望的相反，膠束的水性核心必須具有特定的尺寸以允許在製備膠束時引入的一個或多個治療活性成分的分子被穩定在其中。水性核心的尺寸優選小於或等於約100nm並且優選大於或等於5nm。上述定義的比例W優選小於或等於約2.5。如實施例1所述產品的X-射線散射分析展示了微乳中的反膠束。本發明較現有技術而言的主要優勢在於植物甾醇在製備反膠束中的使用，更優選使用谷甾醇。因此，本發明提供了需要跨黏膜遞送的化合物的吸收，優選跨口腔黏膜和直腸黏膜，更優選跨口腔黏膜。並且，本發明反膠束提供了具有低吸收變化性的重要的生物利用度。本發明反膠束的另一個有利方面在於它們能被製成不同的尺寸以使其與將要包含的活性成分相適應。製備反膠束的方法在一個具體的實施方案中，本發明涉及製備具有小於或等於100nm水性核心並且包含至少一種水溶性治療活性成分、植物甾醇、甘油酯和水的反膠束的方法，其中所述方法包括下列步驟(a)將(i)植物甾醇，(ii)甘油酯，優選脂肪酸甘油二酯，(iii)水，尤其是純淨水，和(iv)至少一種水溶性治療活性成分接觸，其中比例W呵水]/[甘油酯]優選小於或等於約2.5，(b)在40。C或4(TC以下，攪拌步驟(a)中得到的混合物，並持續足夠長的時間以形成反膠束，所述攪拌是以從約1000至約5000轉/分鐘的速度通過機械方式進行或通過超聲處理進行。得到並回收的反膠束特別可用作藥物遞送系統。該方法步驟(b)尤其重要，因為它允許獲得反膠束，而該膠束可用作遞送藥物至耙部位的轉運系統。步驟(a)採用的化合物將在下文具體描述。步驟(a)所得混合物的攪拌特別是在低於或等於40'C的溫度下進行，更優選從3(TC至38'C，更優選從3(TC至35'C，持續能形成反膠束的充足時間。該充足時間可以特別地根據採用的攪拌技術變化，例如機械攪拌或超聲處理。機械攪拌或超聲處理的時間是無論採用何種方式將初始混合物轉變成單相反膠束溶液所需的時間。在具體的實施方案中，治療活性成分首先溶於水(優選純淨水)中，然後將其與其它組分接觸(步驟(a))。本領域技術人員知道如何選擇與本發明組合物一起使用的賦形劑或組分，以保持它們的有益特性。具體地，當大量加入時，甘油的存在可以阻止反膠束的形成或破壞反膠束體系。更具體地，不高於1%的甘油(百分比表示組合物中甘油重量/水的總重量)用於本發明反膠束的製備中，並優選沒有甘油。超聲處理超聲處理時的超聲波引起液體內部的聲音氣穴現象，即在液體內部形成氣泡。超聲波在反應室的每個部位產生均勻的攪拌並且在液體內部很少產生湍流。它是製備納米顆粒的最可靠和有用的方法。所得的微乳的穩定性具體由用作表面活性劑的甘油酯(優選脂肪酸甘油二酯)決定。不同類型的超聲處理材料可用於實驗室或工業規模。高強度超聲波方法是最合適的方法。為少量製備，具有20kHz超聲波的400W或600W的材料可提供滿意的效果並因此是優選的。該過程中溫度和發射期的電子控制在這類設備中也是可能的。存在可用於工業應用的同一類型的材料。在具體時間內(3-5分鐘，一次或多次)，物理參數取決於採用的材料、混合物的體積及其粘度。本領域技術人員能很容易地確定這樣的參數。更特定地，混合物的溫度不得超過4(TC以避免反應物的降解。溫度優選低於約38。C，更優選低於約35'C。機械攪拌常用物質採用螺旋漿式攪拌器，其快速運動產生湍流和漩渦使得顆粒互相貫通，並在混合物內部形成納米顆粒。攪拌速度優選自1000至5000轉/分鐘。採用的體積、設備、攪拌速度和W比例由治療活性成分決定並必須與之相適應。如上所述，混合物的溫度不得超過4(TC以避免反應物的降解。溫度優選低於約38t)，更優選低於約35-C。反膠束化合物甘油酯可用於製備本發明反膠束體系的甘油酯，尤其是脂肪酸甘油酯，可以從大多數動物並更優選從植物中分離。甘油酯包括甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯。在具體實施方案中，本發明優選使用的甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯具有下列結構式(I):CHORgCH2OR3(|)其中Rj是具有14至24個碳原子的直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸的醯基殘基，氫原子，或單-，二-或三-半乳糖或葡萄糖；R2是具有2至18個碳原子的直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸的醯基殘基；R3是具有14至24個碳原子的直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸的醯基殘基，或氫原子。根據一個優選的實施方案，R,和R3中至少一個，優選僅一個，表示油酸醯基殘基(C18:1[順]-9)。根據一個特定的方案，R2具有一個不飽和鍵(例如烯鍵)且有利地具有18個碳原子，優選地R2是油酸殘基(油醯基團)、其雙鍵(順-6、7、9、11和13)的位置異構體之一或其異支鏈化(iso-branched)異構體之一。根據另一個具體方案，^代表油醯基。根據另一個具體方案，R2代表乙醯基。根據一個優選實施方案，R3代表氫原子。不飽和植物油特別優選用作甘油酯的來源，特別是經過首次冷榨的橄欖油。作為普遍規則，含有高濃度油酸的油將被選作本發明的甘油酯的有用來源。這種油通常包含高比例的對本發明有用的甘油酯。根據本發明的具體方案，優選的脂肪酸甘油二酯選自1，2-二油酸甘油酯和l-油醯基-2-乙醯甘油酯。它們中的一部分還是市售可得的，並且尤其是那些被發現在所要求保護的本申請中最為活躍的。這種情況具體的是l-油醯基-2-乙醯甘油酯和1，2-二油醯基甘油酯，它們是具有高純度含量的市售產品。具體地，包含約44%二油酸甘油酯的甘油單油酸酯，其中約14%是1，2-二油酸甘油酯。這樣的化合物是藥學上可接受的(歐洲藥典(第4版)，USP25/NF20，以及日本食品添加劑標準)。這樣的產品可例如以PECEOL⑧的名字通過Gattefoss6公司市售獲得。植物甾醇可用於製備本發明反膠束體系的甾醇是植物甾醇。谷甾醇是優選的可用於本發明反膠束體系的植物甾醇。植物甾醇與膽固醇相比具有很多優點，植物甾醇能穿越黏膜，尤其是口腔和直腸黏膜。因此，本發明的反膠束提供了一種手段以繞開不方便的或不舒適的非腸道途徑並同時使物質無需通過胃給藥，胃是對包括蛋白質在內的許多物質不利的環境。因此，作為一種遞送手段，本發明的反膠束是非常有利的，因為它們使得要給予的活性成分能夠被大量並均勻地吸收。混合在本發明反膠束體系中的谷甾醇可以是[p]-或M-谷甾醇，優選[卩]-谷甾醇，或者可以含有至少這兩種穀甾醇之一的植物提取物的形式混入。尤其可能使用的是各種各樣的市售產品。更具體地，可以使用從大豆中提取的市售的谷甾醇。在這種產品中，谷甾醇通常佔產品重量的50%至70%並且通常與分別約15X的菜油甾醇和谷甾垸醇(sitostanol)以混合物的形式存在。從各種松樹中提取的被稱作妥爾油(talloil)的市售谷甾醇也可以被採用。通常，可能採用與谷甾垸醇混合的谷甾醇。優選地，所述混合物包含按混合物重量計至少50%的谷甾醇。通過按照下列方法進行，能夠獲得具有高於95%、或者甚至99%純度的(3-谷甾醇用丙酮對市售混合物進行連續重結晶化，使得p-谷甾醇通過去除混合物中存在的菜油甾醇和谷甾垸醇被預純化。然後，用洗脫液混合物，例如甲醇，尤其是100%甲醇或甲醇和乙腈的混合物，尤其是80-20的混合物或其它可能獲得純度高於95%或甚至高於99%的谷甾醇的中間比例的混合物，由此在製備C18柱上通過高壓液相色譜法，將如此預純化的產品進行1至3個步驟的純化。該純度通過氣相色譜法測定。谷甾醇以及因此谷甾烷醇還可以按照文獻中的技術從植物中提取而製備，例如ClaudeCerdon在Montpellier發表的標題為--ModulationdelaproductiondesapogeninessteroidiquesenreponseaI'inhibitiondelasynthesede3161"013的論文第95頁。該提取優選通過根據具體而言法國專利FR2316247中描述的方法與金屬絡合來進行，其中描述了將3-羥基-甾體和3-氧代-甾體從含有這些化合物的混合物中分離出來的方法。為實施該提取，己知具有相對高含量的谷甾醇的任何植物或源於植物的產品均可使用。舉例而言，具有相對高的游離谷甾醇含量的植物或源於植物的產品的實例具體可提及橄欖油、大豆油、棉花葉、咖啡葉、小麥胚芽，它們的游離植物甾醇含量以及谷甾醇在游離植物甾醇部分的百分比在下表中給出tableseeoriginaldocumentpage12%是按重量計。谷甾烷醇的相對含量還未被研究。還必須指出的是游離植物甾醇部分含有一定比例的24R和24S異構體，它們可根據植物的不同而變化。對該比例所知甚少，因為它很少被研究。該比例以及在純化過程中不能與谷甾醇分離的谷甾烷醇的相對數量可以解釋一些植物中植物甾醇部分的較好的相對活性，並且尤其是本發明所述反膠束體系的製備中必需的過量的植物甾醇。如上所述，植物甾醇和甘油酯的比例可以在大範圍內變化，例如植物甾醇/甘油酯的重量比可以在0.01至l(包含端點)的範圍內變化。根據一個具體實施方案，可以使用較植物甾醇(優選谷甾醇)而言過量的甘油酯(優選脂肪酸甘油二酯)。更具體地，植物甾醇/甘油酯的重量比大於或等於O.l，更優選從O.l至0.2。治療活性化合物任何水溶性治療劑均可以用於本發明，其包括但不限於多肽、蛋白質、多糖、核酸[DNA或RNA(尤其是RNAi)或其片段]和水性藥物組合物。具有特定治療意義的蛋白質更優選被用於本發明。由於這些活性成分在生物介質中不穩定，具體而言它們能被GIT中存在的內源性酶降解，因此它們通常通過注射途徑給藥。本發明感興趣的治療劑是任何治療性的蛋白質或糖蛋白類，例如胰島素、促紅細胞生成素、瘦素(leptin)、生長因子、生長激素釋放激素、集落刺激因子、水溶性激素(甲狀旁腺激素或其片段或類似物，促黃體激素釋放激素(LHRH)或其類似物(例如，那法瑞林，布舍瑞林，戈舍瑞林)，多糖(例如，肝素)、幹擾素、肝素樣化合物、以及細胞因子。其還包括DNA、RNA片段或質粒、RNA幹擾劑、免疫劑和/或疫苗劑等。這些混入本發明反膠束體系的治療劑可以穿越黏膜上皮屏障並因此在耙部位顯示治療效果。水溶性活性成分更優選存在於反膠束的水性核心中。治療劑的穩定性和活性可以主要通過混合物中的水濃度來控制。用溶於水相的酶進行了研究，研究顯示酶活性可以被優化並且動力學反應取決於水的相對濃度。混入反膠束體系的活性成分的量由它們在親水相(水性核心)中的溶解度決定。優選地，混入在反膠束體系的治療劑的量與活性成分有關。反膠束體系的用途本發明的反膠束改善了混入其中的活性成分的生物利用度，使得它在靶部位的治療用途具有減少的毒性。由於它的微乳性質，反膠束體系提供了不同類型的製劑，該製劑包含賦形劑、載體或不同的輔劑，它們可以通過不同途徑給藥，包括經黏膜給藥，例如通過口腔或直腸給藥。目前已知反膠束體系作為微反應裝置，可用於納米材料的製備。它們可以載有蛋白質類酶。與水溶性底物的催化反應可以在微乳內部的巨大水-油內表面上進行。生物分子的活性和穩定性可以被控制，主要是通過介質中水的濃度。在反膠束體系中混入治療劑提供了下列優點所述治療劑更加穩定，它們能通過黏膜被吸收，膠束在血液中的運輸不會被改變並且活性成分在靶部位獲得了理想的生物學效果。本發明的目的涉及一種包含如上定義的反膠束以及藥學可接受載體、賦形劑或輔劑的藥物組合物。本發明的另一個目的涉及如上定義的反膠束在製備要遞送一種或多種水溶性治療活性劑的藥物組合物中的用途，尤其是經黏膜遞送。該藥物組合物具體而言是用於阻止或治療與疾病或病症相關的一種或多種症狀。本發明的另一個目的涉及向哺乳動物(尤其是人)遞送一種或多種水溶性治療活性劑的方法，該方法包括給予如上定義的反膠束組合物。在一個具體實施方案中，本發明提供了經黏膜遞送一種或多種水溶性治療活性劑的方法，該方法包括向所述哺乳動物(尤其是人)經黏膜給予如上定義的反膠束組合物。本發明提供了預防、治療、或改善與人類疾病或病症有關的一種或多種症狀的方法，該方法包括給予有此需要的所述人群有效量的如上定義的反膠束組合物，該組合物包含一種或多種水溶性的對與所述疾病或病症相關的一種或多種症狀的預防、治療或改善有用的治療劑。在具體實施方案中，本發明提供了預防、治療或改善與疾病或病症相關的一種或多種症狀的方法，該方法包括向有需要的對象經黏膜給予有效量的如上定義的反膠束組合物，該組合物包含一種或多種水溶性的對與所述疾病或病症相關的一種或多種症狀的預防、治療或改善有用的治療劑。具體而言，如上文定義的水溶性治療活性劑包括蛋白質、多肽、肽類、糖蛋白、多糖、如上文定義的核酸、或它們的混合物。其中多肽和肽類的例子是胰島素、幹擾素、和細胞因子，待治療的疾病更具體而言分別是糖尿病、肝炎、和癌症。其中免疫劑和/或疫苗劑被使用，由此獲得的本發明的反膠束體系可用作疫苗。關於藥學可接受的賦形劑、介質或載體，任何本領域技術人員熟知的任何賦形劑、介質或載體均可使用。引用了下列例子但並不受其限制乳糖，玉米澱粉，葡萄糖，蔗糖，甜味劑例如麥芽糖醇糖漿，阿拉伯膠，明膠，角叉菜聚糖，硬脂酸，硬脂酸鎂，糊精，麥芽糊精，甘露醇，滑石粉，天然來源的脂肪，尤其是富含不飽和脂肪酸和植物甾醇的植物來源的油。具體而言，如果最後需要，可使用對本領域技術人員而言公知的其他添加劑，如穩定劑、乾燥劑、粘合劑或pH緩衝劑。本發明優選的賦形劑促進了最終產品與黏膜的粘著。本發明組合物可以通過不同方式給藥，尤其是，經過口服途徑，採用口腔或消化吸收，或更主要的是經過口腔中的黏膜組織。本文使用的術語"黏膜"和"黏膜的"是指黏膜組織例如上皮，固有層，和消化道的平滑肌層。本文使用的"經黏膜遞送"、"經黏膜給藥"以及類似的術語是指組合物向黏膜組織給藥。"經黏膜遞送"、"經黏膜給藥"以及類似的術語包括但不限於通過支氣管、牙齦、舌、鼻、口、陰道、直腸、以及腸黏膜組織遞送組合物。在本發明的優選實施方案中，本發明反膠束組合物以膠囊、囊片、氣霧劑、噴霧劑、溶液、混懸劑、乳劑、扁囊劑、片劑、軟彈性明膠膠囊、氣霧劑、散劑或顆粒劑的形式經黏膜給藥。本發明組合物可以以液體的形式裝入膠囊，該膠囊在嘴中釋放其內含物。優選地，本發明的反膠束組合物被施予哺乳動物，更優選人，以預防或治療疾病或病症。下列實施例旨在示例本發明的實施而對其範圍不造成限制。實施例實施例1:經直腸途徑向動物給予胰島素的運輸遞送系統的製備向溶有1g谷甾醇的2ml乙醇中添加含有100UI胰島素(UmulineZn長效)的1ml純淨水，然後再加入40mlPeceol(從Gattefoss6市售獲得的甘油單油酸酯)。對混合物進行兩次(每次3分鐘)超聲波處理，將溫度控制在低於35°C。所得產品由含有胰島素的穩定反相納米膠束的均質混合物組成。它可以經直腸途徑以2ml/kg的劑量給予動物(5UI胰島素鋅/24h/kg)。實施例2:經口服給藥向對象給予胰島素的運輸遞送系統的製備向溶有10g谷甾醇的10ml乙醇中添加含有200UI胰島素(Umuline長效)的2ml純淨水，然後再加入28mlPeceol。對混合物進行兩次(每次3分鐘)超聲波處理，將溫度控制在低於35°C。所得產品由含有胰島素的穩定反相納米膠束的均質混合物組成。將其裝入膠囊，每個膠囊含有lg所得產品(5UI速效胰島素每個膠囊)。然後它可以被施予需要胰島素的患者。該患者在嘴中破開膠囊並在嘴中保持從膠囊中得到的液體約一分鐘(使混合物中的谷甾醇與嘴黏膜粘著並獲得快速吸收)。實施例3:向對象口腔給予促紅細胞生成素的運輸遞送系統的製備溶有10g谷甾醇的10ml乙醇與含有80000UI促紅細胞生成素(EPREX40000Ul/ml)的2ml水溶液混合，然後再混入28mlPeceol。用扁平烤盤攪拌器以1200轉/分鐘攪拌混合物，將溫度控制在低於35°C。所得產品由含有促紅細胞生成素的穩定反相納米膠束的均質混合物組成。將其裝入膠囊，每個膠囊含有1g所得產品(1000UI促紅細胞生成素每個膠囊)。然後它可以被施予需要促紅細胞生成素的患者。該患者在嘴中破開膠囊並在嘴中保持從膠囊中得到的液體約一分鐘(使混合物中的谷甾醇與嘴黏膜粘著並獲得快速吸收)。實施例4:含有促紅細胞生成素的反膠束的製備向溶有3g谷甾醇的4.5ml乙醇中添加含有2000UIEPO的1mlEPREX,然後再加入72mlPeceo胸。用加熱至35。C的磁力攪拌器攪拌混合物15分鐘。W比例是0.04。然後以2ml/kg的劑量經直腸途徑向大鼠給藥(50Ul/kg)。實施例5:含有促紅細胞生成素的反膠束的製備向溶有3g谷甾醇的4.5ml乙醇中添加含有4000UIEPO的2mlEPREX,然後再加入72mlPeceo跑。用加熱至35。C的磁力攪拌器攪拌混合物15分鐘。W比例是0.08。然後以2ml/kg的劑量經直腸途徑向大鼠給藥(100UI/kg)。實施例6:用於直腸內給予含質粒的反膠束的運輸遞送系統的製備和給藥溶有125pg谷甾醇的200乙醇與含有3mg質粒pEGFP-Nl的250Hl水溶液混合，然後再混入4.75mlPeceo贈。用扁平烤盤攪拌器以1200轉/分鐘攪拌混合物，將溫度控制在低於35'C。所得產品是含有質粒的穩定反相納米膠束的均質混合物。被施予的產品含有pEGFP-Nl的反膠束如上所述製備。pEGFP-Nl(購自Clontech)，用於增強的綠螢光蛋白(eGFP)的哺乳動物表達載體，在轉化到有活性的大腸埃希氏菌ToplO細胞(Invitrogen)中並用來自Qiagen公司的EndoFreePlasmidMegaKit按照製造商的指導純化後使用。方法八隻大鼠(Wistar,250-300g)經直腸途徑注射500|il該產品。採集注射後第1、2、4和8分鐘時的血樣(每次兩隻大鼠)至含有抗凝劑的試管內。以1500rpm離心25分鐘後，血漿被用於轉染研究。HepG2(人肝細胞瘤細胞系)和CV1(猴腎成纖維細胞細胞系)被存放在補充有10%胎牛血清的Dulbecco改性Eagle's培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA，)中，並在轉染研究之前24小時以5><104個細胞/孔的密度接種在24-孔平板中。針對轉染，去除培養基並在室溫下將含有質粒pEGFP-Nl的反膠束的大鼠血漿200W加入不同的盤中20分鐘。在加入500pl新鮮培養基後，在螢光顯微鏡下通過測定螢光細胞的百分比而測量基因表達之前，培養細胞48小時。陰性對照血漿對應於未注射含有質粒pEGFP-Nl的反膠束的大鼠樣品。根據製造商的指導，FuGENETM6(Roche)被用作轉染的陽性對照。結果得到的轉染％(螢光細胞％)tableseeoriginaldocumentpage18實施例7:藥理學實驗促紅細胞生成素的生物活性促紅細胞生成素(EPO)是主要的人體紅血球生成調節劑。EPO的分子量是30-34kDa。重組EPO在商業上是通過在中國倉鼠卵巢的真核細胞系中的EPOcDNA克隆的表達而獲得的。rhEPO效力的早期測定是通過一些參數例如紅細胞壓積、紅血球體積和網狀細胞數增加之後在普通大鼠和小鼠中進行的。最近的研究評價了循環中的網狀細胞的數量是紅血球生成的功能狀態的早期指標，並且外周血中網狀細胞的百分比評估己被用於考察EPO的生物活性。EPREX:由JANSSEN-CILAG實驗室製造，2000Ul/ml批次A:EPO50Ul/kg:單劑量皮下給藥批次B:EPO100UI/kg:單劑量皮下給藥批次C:EPO50UI/kg:單劑量直腸給藥(實施例4)批次D:EPO100Ul/kg:單劑量直腸給藥(實施例5)實驗方法在取血樣96h之後，八周齡的正常紅血球的小鼠接受一次產品給藥。每一批產品用3隻大鼠進行實驗。網狀細胞計數採用自動流式細胞計數器進行。tableseeoriginaldocumentpage19產品C和D(含有促紅細胞生成素的反膠束)對紅血球生成具有顯著的影響，與經皮下給藥的EPO相等。實施例8:體內試驗糖尿病鏈脲黴素大鼠模型一長效胰島素使用的產品是按照實施例1製備的產品。研究目的比較長效胰島素經皮下給藥和將相同劑量的胰島素混入本發明反膠束經直腸途徑給藥的降低血糖的活性。給藥途徑的評價含有脂質納米顆粒的產品在胃和十二指腸中被降解，尤其是被脂酶降解。對患者給藥優選經由黏膜吸收在嘴部位進行。由於這種給藥方式不適用於大鼠，選擇了使得與口服給藥具有同樣效果的經黏膜吸收的直腸途徑。經過直腸途徑被吸收的物質不像口服施予的物質那樣會經過肝臟，而是通過黏膜組織遞送至血流中。給藥途徑批次2:皮下批次3:直腸施用產品批次2:Umulinzinc5Ul/kg批次3:NPX:在膠束載體中的Umulinzinc5UI/kg(實施例1)給藥量用直腸探針2ml/kg/天方法以50mg/kg劑量靜脈給予雄性Wistar大鼠(體重250-300g)鏈脲黴素(STZ)，提供處於胰島素依賴型和非胰島素依賴型糖尿病(l型和2型)中間的糖尿病。給藥三天後，血糖在20和30mmol/l之間並幾乎穩定地持續隨後7天。給予藥物7天，對距離治療開始0天、72h和7天收集的血樣進行血糖生物學化驗。結果tableseeoriginaldocumentpage21結論-以每日5UI/Kg劑量皮下給予的胰島素鋅(批次2)使血糖恢復至正常值。-產品NPX(胰島素鋅納米顆粒，批次3)對血糖具有顯著影響治療開始後72h，6隻動物中的4隻重新獲得了與皮下給予胰島素後同樣的正常血糖水平。該動物的胰島素的生物利用度與注射給予胰島素時的生物利用度相似。兩隻動物對於注射的胰島素的輕微不同的結果是由於向動物進行直腸給藥時通常會遇到的困難。向人類口服給藥時會避免這類困難。實施例9:體內試驗糖尿病鏈脲黴素大鼠模型一速效胰島素研究目的比較速效胰島素經皮下給藥和將相同劑量胰島素混入本發明反膠束經直腸途徑給藥的降低血糖的活性及生物利用度。實驗方法通過靜脈注射鏈脲黴素(60mg/kg)使雄性Wistar大鼠(體重150-200g)患糖尿病。四天後，經過處理的大鼠呈現胰島素依賴型糖尿病，若干天后，伴隨有胰島素依賴。對每批3隻大鼠進行實驗。只進行一次給藥，對照產品通過皮下給藥，而受試膠束(Mc)產品通過直腸給藥。對照產品和受試Mc產品的胰島素劑量相同5Ul/kg。治療組-對照組不經過STZ處理-速效胰島素組(速效UMULINE)經皮下途徑給藥-速效胰島素組(速效UMULINE)經直腸途徑給藥-速效胰島素組McUMULINE經直腸給藥-無胰島素的Mc製劑組經直腸給藥在7個時間點進行血糖和胰島素化驗15分鐘，30分鐘，60分鐘，120分鐘，180分鐘，360分鐘以及24小時。tableseeoriginaldocumentpage23結論經直腸途徑的Mc吸收動力學與經皮下途徑的Mc吸收動力學相當Tmax=2-3小時。消除動力學是相當的。較皮下途徑而言，Mc製劑的相對生物利用度是55X，以AUC為基實施例10:水加入量的優化上文實施例中給出的含有適量peceol、谷甾醇和乙醇的樣品，通過改變溶有蛋白質的水的量而製備。稀釋規模以0.3%的水增加量進行。樣品於35'C下攪拌均勻，如上文所述。通過目測(混濁度)和小角度X-射線散射測定水含量對於反膠束體系穩定性的影響。結果組合物中含有6.9%(即，W約是0.175)和更多的水時，微乳變得越來越混濁並且隨著水量的增加開始出現兩相。水的百分比是以水總重組合物總重表示的。權利要求1.反膠束體系，其包含至少一種水溶性的治療活性成分、植物甾醇、甘油酯和水。2.根據權利要求1的反膠束體系，其中膠束具有小於或等於100nm的水性核心。3.根據權利要求1或2的反膠束體系，通過下述方法獲得-(a)使(i)植物甾醇，(ii)甘油酯，(iii)水，和(iv)至少一種水溶性治療活性成分相接觸，(b)在4(TC或4(TC以下，攪拌步驟(a)中得到的混合物，並持續足夠長的時間以形成反膠束，所述攪拌是以約1000至約5000轉/分鐘的速度機械性地進行或通過超聲處理進行。4.根據前述任一項權利要求的反膠束體系，其中比率W二(水)/(甘油酯)優選小於或等於約2.5。5.根據前述任一項權利要求的反膠束體系，其中植物甾醇/甘油酯的重量比在0.01至l的範圍內。6.根據前述任一項權利要求的反膠束體系，其中植物甾醇/甘油酯的重量比大於或等於O.l，更優選為0.1至0.2。7.根據權利要求3-6中任一項的反膠束體系，其中攪拌步驟(b)是在3(TC至38'C的溫度範圍內進行。8.根據前述任一項權利要求的反膠束體系，其中比例W二(水)/(甘油酯)小於或等於約1。9.根據前述任一項權利要求的反膠束體系，其中甘油酯具有下列結構式(I):formulaseeoriginaldocumentpage3(I)其中Rt是具有14至24個碳原子的直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸的醯基殘基，氫原子，或單-、二-或三-半乳糖或葡萄糖；R2是具有2至18個碳原子的直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸的醯R3是具有14至24個碳原子的直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸的醯基殘基，或氫原子。10.根據前述權利要求的反膠束體系，其中R,和R3中至少一個，優選僅一個，代表油酸(C18:1[順]-9)的醯基殘基。11.根據前述權利要求9和10中任一項的反膠束體系，其中R2是油酸殘基(油醯基團)、其雙鍵(順-6、7、9、11和13)的位置異構體之一或其異支鏈化異構體之一。12.根據前述權利要求9和10中任一項的反膠束體系，其中R2代表乙醯基。13.根據前述權利要求9-12中任一項的反膠束體系，其中R3代表氫原子。14.根據前述權利要求9-13中任一項的反膠束體系，其中甘油酯選自1，2-二油酸甘油酯和l-油醯基-2-乙醯甘油酯。15.根據前述權利要求1-14中任一項的反膠束體系，其中植物甾醇是谷留醇。16.根據前述權利要求1-15中任一項的反膠束體系，其中所述水溶性治療劑是肽、多肽、蛋白質、核酸[DNA或RNA(更優選RNAi)或其片段]或水性藥物組合物。17.根據權利要求16的反膠束體系，其中所述水溶性治療劑選自由胰島素、促紅細胞生成素、瘦素、生長因子、生長激素釋放激素、集落刺激因子、水溶性激素(甲狀旁腺激素或其片段或類似物，促黃體激素釋放激素(LHRH)或其類似物(例如，那法瑞林，布舍瑞林，戈舍瑞林)，幹擾素、細胞因子、多糖(例如，肝素)、肝素樣化合物、DNA、RNA片段或質粒、RNA幹擾劑、以及免疫劑和域疫苗劑)組成的組。18.藥物組合物，其包含前述任一項權利要求定義的反膠束和藥學可接受的載體。全文摘要本發明主要涉及包含水溶性治療活性劑的反膠束體系。本發明的反膠束具體用於遞送藥物。本發明還涉及包含所述反膠束的藥物組合物及其製備方法。文檔編號A61K9/48GK101102747SQ200580037669公開日2008年1月9日申請日期2005年11月2日優先權日2004年11月2日發明者J-C·莫雷爾申請人:丹德拉醫藥股份公司