一種通用型食品安全快速檢測的基因晶片及檢測方法
2023-04-22 20:25:31 4
專利名稱：一種通用型食品安全快速檢測的基因晶片及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術，更具體地說涉及一種通用型食品安全快速檢測的基因晶片及檢測方法。
核酸是生物物種的遺傳物質，它包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。核酸的基本組成是四種核苷酸(或鹼基)，在DNA中它們分別由A、C、G、T代表，在RNA中它們分別由A、C、G、U代表。核苷酸(鹼基)在核酸中以串聯的方式組成鏈狀結構，DNA一般為雙鏈結構，RNA為單鏈結構；DNA的雙鏈結構可以在適當的條件下分解成單鏈，單鏈的DNA也可以與單鏈的RNA形成雙鏈結構。在一核酸結構中，一部分可以是單鏈另一部分可以是雙鏈。在雙鏈的核酸結構中鹼基A與另一鏈的T(U)通過氫鍵形成鹼基對，同理G與另一鏈的C形成鹼基對，能形成鹼基對的鹼基為互補鹼基。如一核酸鏈與另一核酸鏈有完全互補的鹼基序列，則這兩條核酸鏈稱為互補核酸鏈，互補的核酸鏈可形成穩定的雙鏈結構，由互補的兩單鏈分子結構形成雙鏈分子結構的過程稱為分子雜交。非完全互補的核酸鏈(部分互補)在特定條件下也會形成雙鏈分子結構。在生物體及試管中，單鏈的核酸鏈可在酶的作用下複製出互補的核酸鏈，在複製過程中，被複製的核酸鏈稱為模板分子，所需的酶為聚合酶，聚合酶可分為DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶等。DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA互補鏈，RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA互補鏈，逆轉錄酶以RNA為模板合成DNA互補鏈。引物為核酸片段，它與模板分子互補並雜交形成雙鏈結構。核酸聚合酶反應的始點決定於引物的位置，DNA的聚合反應從引物的3』末端開始(DNA及cDNA聚合反應)。RNA聚合酶反應需要有雙鏈的被RNA聚合酶識別的結構，稱為驅動子。引物核酸片段可以由幾個或幾十個鹼基(核苷酸)組成，引物可以是DNA，也可以是RNA，它可以是通過降解自然核酸而取得的片段，也可以通過人工化學合成。人工合成的核酸片段可具有非自然的組成單位(結構)，非自然的組成單位(結構)包括在自然界中不是核酸組分的結構，也包括不存在於自然界的化學結構。通過引物與模板分子的雜交，可以控制模板分子的複製以及模板分子的擴增。核酸序列在進化過程中和外界條件的影響下會發生變化，最常見的變化為一鹼基被另一鹼基所取代，在同一物種中，同一核酸序列的同一位置(單鹼基位置)在不同的個體之間如有不同的鹼基成分，則這一種現象稱為單鹼基(核苷酸)多態性(SNP)。在特定個體中，多態性位點的一種鹼基組成為這一位點的一種基因型(基因為核酸的功能性區域)，一個單倍體生物個體在一個多態點上只能有一個基因型，在雙倍體的生物個體中如二同源基因具有相同的基因型，這一個體為純合子，如有不同的基因型，則這一個體為雜合子。基因型測定對遺傳診斷、物種鑑定、藥物篩選等具有重大意義。DNA可以在聚合酶等的作用下被複製，即由模板鏈複製出互補鏈，DNA的複製需要有一引物，引物一般為一含有幾個或幾十個鹼基的核酸鏈，核酸鏈具有方向性分別用5』端和3』端表示，接近5』端的序列稱為5』端部分，接近3』端的稱為3』端部分，核酸複製前引物與模板在3』端有特異性地根據鹼基配對原理結合成雙鏈結構(這一過程稱為分子雜交)，此後聚合酶可從引物的3』端開始沿5』→3』方向合成與模板相互補的新鏈，新形成的雙鏈可在高溫下(＞90℃)分離成獨立的單鏈，當溫度下降時餘下的引物分子可再與相應的模板核酸分子雜交，並可在聚合酶的作用下複製出新的核酸鏈，反覆如上過程，一個核酸片段可被擴增出千萬個同樣的分子片段，如上過程即為聚合酶鏈反應過程(PCR)。一核酸樣品需擴增的部分為靶片段，進行PCR反應一般在靶片段兩端要有相應的引物，對一多態位點附近的序列專一的引物為多態性引物，對一多態性位點的特定基因型有專一性的為基因型引物，多態性引物可和基因型引物結合使用對靶片段進行PCR擴增，並測定基因型。用化學的方法可以人工合成核酸片段作為引物，引物的鹼基序列與靶片段序列相互補，另外引物序列中可具有與核酸樣品中的序列非互補的序列，這種與樣品不具互補性的序列稱為外源序列，外源序列可作為引物的部分結構。基因晶片是一種把不同核酸分子分別排列於特定位置，並用於核酸分子雜交的裝置，固定於基因晶片上的核酸分子為探針分子，與探針分子進行特異性雜交的為靶分子，探針分子可通過在晶片的位置或所帶的標記進行靶分子識別，標記可有多種形式，如放射性標記、螢光標記、納米顆粒標記、酶標記、色素標記等，用以區別不同基因型的具標記的核酸探針分子為基因型探針。由引物引發的聚合反應或擴增反應常用於分子生物學的基礎研究，基因工程，以及遺傳診斷和與分子生物學相關的檢測。要檢測一種或多種食品樣品時，所需篩選和擴增的靶分子種數可達數百以上，進行分子檢測時如用常規的PCR方法，需要合成大量的引物，並用大量的反應分別對靶分子進行篩選和擴增。這種做法所需的人力和物力、費用都很大。如果把多個引物組合在一個PCR反應中，這些引物之間的相互作用會產生副產物。已有的食品微生物病毒檢測還是沿續傳統的培養、分離、鑑定(形態鑑定、生化鑑定、血清學鑑定)程序，這種工藝操作周期長，各項累計費用高，很難對食品的安全衛生形成有效的監督。已有的食品安全(衛生)檢測一般是依照國家食品衛生標準，根據食品衛生類型比如醬滷肉類、烤魚片、糕點麵包、肉鬆、乾果等等，標準眾多，但其中最主要的是不得檢出致病菌，但已有技術卻往往很難一項一項檢測致病菌。
本發明的目的是提供一種通用型食品安全快速檢測的基因晶片及檢測方法，它能克服現有技術的上述不足。
一種通用型食品安全快速檢測的基因晶片及檢測方法，包括食品樣品的採樣、培養、分離、鑑定，其特徵是在一塊基因晶片上設計有27種菌種的分子探針，同時進行定性與定性定量分析，根據基因型探針在基因晶片上的信號判斷多態性位點的基因型，根據檢測數據再比照食品類型以判斷食品合格的方法。
本發明的優點是大大縮短了食品衛生(安全)檢測的周期，擴大了檢測範圍，減少了檢測費用，縮小了檢測誤差，增強了食品安全指數，能對食品市場的安全衛生形成有效的監督。
下面通過實施例說明本發明。
對某種食品的樣品進行微生物(致病菌、病毒)檢驗。製作檢測食品的基因晶片，基因晶片上的分子探針是與多態性引物的外源序列相互補的核酸分子，包括沙門氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、出血性大腸桿菌、李斯特氏菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、溶藻膠弧菌、創傷弧菌、炭疽桿菌、糞鏈球菌、布氏桿菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、狂牛症病原；大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、黴菌、酵母菌的核酸片段(分子)。其長度由10-50個核苷酸組成，每一種探針分別用已知的方法固定於晶片的表面，配製一個試劑盒，試劑盒包括用於對多態性靶片段進行擴增的引物，擴增一多態性靶片段的引物包括專一的多態性引物和二個專一的基因型引物，試劑盒還包括核酸提純的試劑、PCR反應的酶、此外試劑盒包括二個或多個分別有不同標記的基因型探針，標記為螢光色素或其它的可用化學或物理方法識別的納米範圍的結構，試劑盒還包括用於分子雜交的緩衝液。在進行基因型測定時採用如下操作程序①從這種食品的樣品中提取微生物的DNA，提取的DNA溶於水或適當的緩衝液；②用PCR反應試劑對提取的DNA核酸進行PCR擴增，用一多態性引物和二個專一的基因型引物對一多態性靶片段進行擴增，多組引物可以在同一試管中使用(複合PCR反應)，複合的程度可為二組或二組以上的引物，擴增後的產物具有單鏈的多態性外源序列和單鏈的基因型外源序列，反應的體積一般在10-100微升；③多個PCR的反應產物可合併，並進行適當的純化、濃縮等處理(必要時可除去未反應的引物)，然後與雜交用的緩衝液結合，最終體積在0.1-1毫升範圍內。雜交液中包含具有不同標記的基因型探針；④用已知的方法和儀器進行基因晶片雜交和清洗，並用雷射掃描儀或其它相應的儀器採集晶片上的信號；⑤根據信號在晶片上的位置、特徵和信號的強度的比例，可測定多態性位點的基因型。根據以上檢測結果可以得出這種食品是否存在有以上探針設計的(27種)菌(屬)種，即進行了菌(屬)種的定性檢測，對於致病菌沙門氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、出血性大腸桿菌、李斯特氏菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、溶藻膠弧菌、創傷弧菌、炭疽桿菌、糞鏈球菌、布氏桿菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、狂牛症病原只做定性檢測，即這種食品檢測中只要存在以上一種致病菌，即宣布這種食品為不合格品。如果這種食品沒有檢測出以上致病菌，對於大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、黴菌、酵母菌再進行定量分析，定量分析用已知技術進行。通過以上方法得出這種食品中微生物的定性定量檢驗結果(檢測數據)。將所有食品衛生檢驗標準輸入到計算機中，建立一個分類別、分層次、分等級的標準庫，根據這種食品定性定量檢驗結果(檢測數據)再比照食品標準進行判斷得出這種食品檢驗的結論。
本方法用於食品的檢測，包括所有食品衛生檢驗標準集合的計算機軟體，所有食品衛生檢驗標準包括常用食品的國際標準、國家標準、行業標準、以及相關的企業標準，將這些標準集合成一個分類別、分層次、分等級的食品衛生檢驗標準軟體。食品衛生檢驗標準軟體是用以比照食品檢驗結果的，做出結論性判斷。
本方法用於食品的檢驗是通用的可適用於所有食品。基因晶片的設計、使用只是對所檢驗的食品的樣品負責，不考慮食品的種類、標準，食品取樣後用生物晶片(基因晶片)進行檢測，檢測結果出來後再比較某類食品的標準進行判斷。
根據本方法可以生產試劑盒，試劑盒內有用於對多態性靶片段進行擴增的引物，包括專一的多態性引物和基因型引物，以及核酸提純的試劑、PCR反應的酶、緩衝液等。
用此方法具體檢測的微生物菌種、病毒種類因時間的推移及標準的變化可增添新的致病菌、病原微生物和病毒。
用此方法進行的聚合酶反應是在PCR進行，定量PCR儀能在PCR反應過程中通過光學系統觀測反應的進行程度。
此方法可用於RNA靶分子，進行逆轉錄反應然後進行聚合酶鏈反應，用反應結果判斷基因表達或測定RNA病毒(微生物)的種類和數量。
此方法可用於DNA靶分子進行聚合酶鏈反應，或由逆轉錄反應、DNA聚合反應、RNA聚合反應等組成的恆溫擴增反應。通過擴增的結果判定靶片段的存在或判斷靶片段的基因型，以及判斷相關物種的數量。
此方法可對病毒和微生物進行檢測，用於食品衛生、商檢、環保、醫療等。
權利要求
1.一種通用型食品安全快速檢測的基因晶片及檢測方法，包括食品樣品的採樣、培養、分離、鑑定，其特徵是在一塊基因晶片上設計有27種菌種的分子探針，同時進行定性與定性定量分析，根據基因型探針在基因晶片上的信號判斷多態性位點的基因型，根據檢測數據再比照食品類型以判斷食品合格的方法。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是生物晶片探針有沙門氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、出血性大腸桿菌、李斯特氏菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、溶藻膠弧菌、創傷弧菌、炭疽桿菌、糞鏈球菌、布氏桿菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、狂牛症病原；大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、黴菌、酵母菌的核酸片段。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵是定性與定性定量分析是在一塊基因晶片上完成。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵是根據基因型探針在生物晶片上的信號判斷多態性位點的基因型，多態性引物和基因型引物的5』端部分分別具有專一的外源序列，多態性引物和基因型引物的3』端部分分別具有與靶序列相互補的序列，外源序列和互補序列之間有非自然性結構。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵是試劑盒有用於對多態性靶片段進行擴增的引物，包括專一的多態性引物和基因型引物，以及核酸提純的試劑、PCR反應的酶、緩衝液。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵是對於致病菌沙門氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、出血性大腸桿菌、李斯特氏菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、溶藻膠弧菌、創傷弧菌、炭疽桿菌、糞鏈球菌、布氏桿菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、狂牛症病原只做定性檢測。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵是對於大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、黴菌、酵母菌進行定性定量分析。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵是一種通用的食品檢測生物晶片，將所有食品衛生檢驗標準輸入到計算機中，根據檢測數據再比較某類食品的標準進行判斷。
全文摘要
一種通用型食品安全快速檢測的基因晶片及檢測方法，其特徵是在一塊基因晶片上設計有27種菌種的分子探針，同時進行定性與定性定量分析，根據基因型探針在基因晶片上的信號判斷多態性位點的基因型，根據檢測數據再比照食品類型以判斷食品合格的方法。本發明的優點是大大縮短了食品衛生(安全)檢測的周期，擴大了檢測範圍，減少了檢測費用，縮小了檢測誤差，增強了食品安全指數，能對食品市場的安全衛生形成有效的監督。
文檔編號C12Q1/04GK1546684SQ20031010575
公開日2004年11月17日 申請日期2003年11月28日 優先權日2003年11月28日
發明者劉樹青, 江曉路 申請人:中國海洋大學