抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體及其製備與應用的製作方法

2023-04-22 23:53:36 1

專利名稱：抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體及其製備與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，涉及一種RNA幹擾載體，特別涉及一種抑制豬源P53基因表達的RNA幹擾載體及其製備與應用。
背景技術：
RNA幹擾(RNA interference, RNAi )是正常生物體內抑制特定基因表達的一種現象，它是指當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA (double strandedRNA, dsRNA)時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默的現象，這種現象發生在轉錄後水平，又稱為轉錄後基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。外源 dsRNA進入細胞後產生的小分子幹擾RNA (small interfering RNA, siRNA)的反義鏈和多種核酸 酶形成了沉默複合物(RNA-induced silencing complex, RISC), RISC具有結合和切割mRNA的作用而介導RNA幹擾的過程。RNAi的發現具有劃時代的意義，它不僅深入揭示了細胞內基因沉默的機制，而且它還是後基因組時代基因功能分析的有力工具，極大地促進了人類揭示生命奧秘的進程。這種技術已經成為研究基因功能的重要工具，並將在病毒病、遺傳性疾病和腫瘤病的治療方面發揮重要作用。目前為止較為常用的5種製備siRNAs的方法包括化學合成、體外轉錄、長片斷dsRNAs 經 RNase III類降解(e. g. Dicer, E. coll, RNase III)、siRNA 表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs，以及PCR製備的siRNA表達框在細胞中表達。其中，化學合成與體外轉錄方法都是在體外得到siRNA後再導入細胞內，但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點siRNA進入細胞後容易被降解；進入細胞siRNA在細胞內的RNAi效應持續時間短。針對這種情況，出現了質粒、病毒類載體介導的siRNA體內表達，該方法的基本思路是將siRNA對應的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動子後，這樣就能在體內表達所需的siRNA分子。這種方法總體的優點在於不需要直接操作RNA，能達到較長時間的基因沉默效果，具有表達穩定、持久，抑制效果明顯的特點。通過質粒表達siRNAs大都是用Pol III啟動子啟動編碼shRNA (short hairpinRNA)的序列。選用Pol III啟動子的原因在於這個啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉錄合成RNA，遇到4-5個連續的U即終止，非常精確。當這種帶有Pol III啟動子和shRNA模板序列的質粒轉染哺乳動物細胞時，這種能表達siRNA的質粒確實能夠下調特定基因的表達，可抑制外源基因和內源基因。採用質粒的優點在於，通過siRNA表達質粒的選擇標記，siRNA載體能夠更長時間地抑制目的基因表達。而且，由於質粒可以複製擴增，與其它合成方法相比，能夠顯著降低製備siRNA的成本。此外，帶有抗生素標記的siRNA表達載體可用於長期抑制研究，通過抗性輔助篩選，該質粒可以在細胞中持續抑制靶基因的表達數星期甚至更久。

發明內容
本發明的首要目的在於提供一種幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板。
本發明的另一目的在於提供一種抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體。本發明的再一目的在於提供上述抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體的製備方法。本發明的目的還在於提供上述幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板或抑制豬源P53基因表達的RNA幹擾載體的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現通過大量篩選和實驗得到幹擾豬源p53基因的有效靶片段，其序列為
5 』 -GTTGGGAGAATTTATGAAA-3』。根據上述靶片段序列設計shRNA的轉錄模板的正義鏈和反義鏈，loop結構的序列為TTCAAGAGA，轉錄終止序列採用6個T結構。為了便於插入載體，在正義鏈的5』端添加了BamH I酶切位點粘性末端GATCC，3』端添加了 Hind III酶切位點粘性末端A ；反義鏈的5』端添加了 Hind III酶切位點粘性末端AGCTT，3』端添加了 BamH I酶切位點粘性末端G。最終得到幹擾豬源P53基因的shRNA的正義鏈，如SEQ ID NO. 2所示，幹擾豬源p53基因的shRNA的反義鏈，如SEQ ID NO. 3所示。一種幹擾豬源P53基因的ShRNA的轉錄模板為SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3退火雜交形成的雙鏈DNA。—種抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體，具有如圖I所不的結構，命名為pGenesilencer-GFP-p53，包括骨架載體、豬U6 RNA聚合酶III啟動子和上述幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板。所述的骨架載體為pEGFP-Cl載體；所述的pEGFP_Cl載體的多克隆位點中的BamHI和Hind III酶切位點進行了突變；所述的BamH I酶切位點由5』 -AAGCTT-3』突變為5』 -AAGTTT-3』，所述的 Hind III酶切位點由 5』 -GGATCC-3』 突變為 5』 -GGAACC-3』。所述的抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體具有骨架載體pEGFP_Cl的特性，其多克隆位點如圖2所示。所述的豬U6 RNA聚合酶III啟動子取代了 pEGFP_Cl載體的Π複製起點，在豬U6RNA聚合酶III啟動子後接入了幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板。上述抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體的製備方法，包括如下步驟(I)突變 pEGFP-Cl 載體多克隆位點(multiple cloning site,MCS)中的 BamH I和Hind III酶切位點，得到BamH I和Hind III酶切位點突變的重組載體pEGFP-Cl-BH。(2) PCR擴增得到如SEQ ID NO. 4所示的Mlu I酶切位點+TAT+Spe I酶切位點+SV40ori (複製起點)序列+Stu I酶切位點的DNA片段S。(3)將步驟(2)得到的片段S和步驟(I)得到的重組載體pEGFP-Cl-BH分別用MluI和Stu I酶切，將酶切後的片段連接得到重組載體pEGFP-Cl-Spe I ；(4) PCR擴增得到如SEQ ID NO. 5所示的Spe I酶切位點+pU6基因全長序列(豬U6 RNA聚合酶III啟動子序列)+BamH I酶切位點+ATA+Hind III酶切位點+Mlu I酶切位點的DNA片段U6。(5)將步驟(4)得到的片段U6和步驟(3)得到的重組載體pEGFP_Cl-Spe I分別用Spe I和Mlu I酶切，將酶切後的片段連接得到重組載體PEGFP-C1-U6。(6)將SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3退火雜交得到幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板。(7)將步驟(5)得到的重組載體pEGFP-Cl-U6用BamH I和Hind III酶切，酶切後的片段與步驟(6)得到的幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板連接得到抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體。步驟(I)中所述的突變的方法優選為①以pEGFP-Cl載體上1386_1646bp片段(SP Sma I到Mlu I酶切位點之間)為靶片段，設計BI和B2引物突變掉BamH I酶切位點，以pEGFP-Cl載體為模板，PCR擴增得到靶片段B; BI :5，-CCCCGGGAACCCGGATCTAGATAA-3，，B2 :5』 -ACGCGTAGATACATTGATGAGTTTGGACAA-3』 ；②將①中得到的靶片段B和pEGFP-Cl載體分別用Sma I和Mlu I酶切，將酶切後的片段連接得到BamH I酶切位點突變的重組載體pEGFP_Cl_B ；③以pEGFP-Cl載體上606_1357bp片段(即Nhe I到EcoR I酶切位點之間)為靶片段，設計Hl和H2引物突變掉Hind III酶切位點，以pEGFP-Cl載體為模板，PCR擴增得到靶片段H;Hl :5，-CTAGCTAGCTACCGGTCGCCA-3，，H2 :5， -GGAATTCGAAGTTTTTGAGCTCGA-3，；④將③中得到的靶片段H和②中得到的重組載體pEGFP-Cl-B分別用Nhe I和EcoR I酶切，將酶切後的片段連接得到BamH I和Hind III酶切位點突變的重組載體pEGFP-Cl-BH。步驟(2)中所述的PCR擴增是以pEGFP-Cl載體為模板、S上遊和S下遊為引物，S 上遊5，-CGACGCGTTATACTAGTGGTGTGGAAAGTCCCCA-3，，S 下遊5，-GAAGGCCTTAGGCCTCCAAAAAAGCCTC-3，。步驟(4)中所述的PCR擴增是以ST細胞(豬睪丸細胞)的cDNA為模板、pU6_上遊和pU6-下遊為引物，pU6-上遊5，-GGACTAGTTGGCTCCAGACCTCGCGGTGGT-3，，pU6-下遊5，-CGACGCGTAAGCTTATAGGATCCTGTGCTGCCGAAGCGA-3，。步驟(6)中所述的退火雜交的條件優選為95°C，5min ；72°C,15min ;4°C保存。上述幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板或抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體在抑制豬源P53基因表達中的應用。上述抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體在抑制豬源靶基因中的應用，通過將幹擾豬源靶基因的shRNA的轉錄模板取代幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板實現。本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果(I)本發明公開的幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板和抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體能有效抑制豬源p53基因的表達。(2)抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體可以在豬源細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久，可以進行較長期研究；即使是對轉染帶有篩選標記質粒的細胞進行瞬時篩選，也有助於富集帶質粒的細胞，可以幫助解決一些難轉染的細胞由於轉染效率低造成的問題。
(3)抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體具有骨架載體pEGFP_Cl的特性，其以EGFP作為轉錄效率指示標記,原核篩選標誌Kan和真核篩選標誌neo共用同為一段基因,質粒相對較小，可實施流式篩選和G418篩選；還可以表達外源基因，有利於穩定表達外源蛋白或基因敲除靶基因的細胞系的篩選。(4)通過將幹擾豬源靶基因的shRNA的轉錄模板取代幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板能夠得到抑制豬源其它基因表達的RNA幹擾載體，為研究其它豬源基因的作用提供了基礎。


圖I是抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體結構圖。圖2抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體的多克隆位點示意圖。 圖3是靶片段B PCR擴增結果圖。圖4是靶片段H PCR擴增結果圖。圖5是片段S結構示意圖。圖6是片段S PCR擴增結果圖。圖7是片段U結構示意圖。圖8是片段U PCR擴增結果圖。圖9是相對螢光定量-PCR檢測PK-15細胞內p53基因的表達水平圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。表I.實施例中所用序列
名稱l￥￥lSiBJ位點
Bi5，-CCCCGGGAACC(GGATCTAGATAA-3，Sma I
B25，-ACGCGTAGATAC—AJTGATGAGTTTGGACAA-3』Mlu I
Hl5'-CTAGCTAGCTACCGGTCGCCA-3'Nhe I
H2S3-Ggaattcgaagtttttgagctcga-S1EcoR I
$上遊 s^cgacgcgttatactagtggtgtggAaagtcccca-Bimiu ι , sPe I
s —卜'遊 5 ^gaaggccttaggcctccaaaaaagcctc-s 』Stu I
pU6-丨:遊 S'-GGACmGITGGCTCCAGACCTCGCGGTGGT-S*Spc I
pU6-卜■遊 5'-CGACGCGTAAGCTTATAGGATCCTGTGCTGCCGAAGCGA-3， Spe I、HmdIIl、
BamH I
p53 shRNA 5'-GATCCGTTGGGAGAATTTATGAAATTCAAGAGAWTC'ATAAATTI 丨義"Hi CTC』CT A ACTTTTTTA-3'_.....p53"shRNA.............5,:AGCT^AAAAAGTTGGGAGA^^^AA^CTC^^^................................................................................................
權利要求
1.一種幹擾豬源P53基因的ShRNA的轉錄模板，其特徵在於為SEQ ID NO. 2和SEQID NO. 3退火雜交形成的雙鏈DNA。
2.一種抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體，其特徵在於包括骨架載體、豬U6 RNA聚合酶III啟動子和權利要求I所述的幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板。
3.根據權利要求2所述的抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體，其特徵在於 所述的骨架載體為pEGFP-Cl載體；所述的pEGFP-Cl載體的多克隆位點中的BamH I和Hind III酶切位點進行了突變； 所述的豬U6RNA聚合酶III啟動子取代了 pEGFP-Cl載體的Π複製起點，在豬U6 RNA聚合酶III啟動子後接入了權利要求I所述的幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板。
4.根據權利要求3所述的抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體，其特徵在於所述的BamH I酶切位點由AAGCTT突變為AAGTTT，所述的Hind III酶切位點由GGATCC突變為GGAACC。
5.權利要求4所述的抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體的製備方法，其特徵在於包括如下步驟 (1)突變pEGFP-Cl載體多克隆位點中的BamHI和Hind III酶切位點，得到BamH I和Hind III酶切位點突變的重組載體pEGFP-Cl-BH ； (2)PCR擴增得到如SEQID NO. 4所示的Mlu I酶切位點+TAT+Spe I酶切位點+SV40複製起點序列+Stu I酶切位點的DNA片段S ； (3)將步驟(2)得到的片段S和步驟(I)得到的重組載體pEGFP-Cl-BH分別用MluI和Stu I酶切，將酶切後的片段連接得到重組載體pEGFP-Cl-Spe I ； (4)PCR擴增得到如SEQID NO. 5所示的Spe I酶切位點+豬U6 RNA聚合酶III啟動子序列+BamH I酶切位點+ATA+Hind III酶切位點+Mlu I酶切位點的DNA片段U6 ； (5)將步驟(4)得到的片段U6和步驟(3)得到的重組載體pEGFP-Cl-SpeI分別用SpeI和Mlu I酶切，將酶切後的片段連接得到重組載體PEGFP-C1-U6 ； (6)將SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 3退火雜交得到幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板； (7)將步驟(5)得到的重組載體PEGFP-C1-U6用BamHI和Hind III酶切，酶切後的片段與步驟(6)得到的幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板連接得到抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體。
6.根據權利要求5所述的抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體的製備方法，其特徵在於步驟(I)中所述的突變的方法為 ①以pEGFP-Cl載體上1386-1646bp片段為靶片段，設計BI和B2引物突變掉BamHI酶切位點，以pEGFP-Cl載體為模板，PCR擴增得到靶片段B ；BI :5』 -CCCCGGGAACCCGGATCTAGATAA-3』，B2 :5』 -ACGCGTAGATACATTGATGAGTTTGGACAA-3』 ； ②將①中得到的靶片段B和pEGFP-Cl載體分別用SmaI和Mlu I酶切，將酶切後的片段連接得到BamH I酶切位點突變的重組載體pEGFP_Cl_B ； ③以pEGFP-Cl載體上606-1357bp片段為靶片段，設計Hl和H2引物突變掉HindIII酶切位點，以pEGFP-Cl載體為模板，PCR擴增得到靶片段H ；Hl :5』 -CTAGCTAGCTACCGGTCGCCA-3』，H2 :5』 -GGAATTCGAAGTTTTTGAGCTCGA-3』 ； ④將③中得到的靶片段H和②中得到的重組載體pEGFP-Cl-B分別用Nhe I和EcoR I酶切，將酶切後的片段連接得到BamH I和Hind III酶切位點突變的重組載體pEGFP-Cl-BH。
7.根據權利要求5所述的抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體的製備方法，其特徵在於 步驟(2)中所述的PCR擴增是以pEGFP-Cl載體為模板、S上遊和S下遊為引物，S 上遊5』 -CGACGCGTTATACTAGTGGTGTGGAAAGTCCCCA-3』，S下遊5』 -GAAGGCCTTAGGCCTCCAAAAAAGCCTC-3』 ； 步驟(4)中所述的PCR擴增U6是以ST細胞cDNA為模板、pU6_上遊和pU6_下遊為引物，pU6-上遊5』 -GGACTAGTTGGCTCCAGACCTCGCGGTGGT-3』， pU6-下遊5，-CGACGCGTAAGCTTATAGGATCCTGTGCTGCCGAAGCGA-3，。
8.根據權利要求5所述的抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體的製備方法，其特徵在於 步驟(6)中所述的退火雜交條件為95°C，5min ；72°C,15min ;4°C保存。
9.權利要求I所述的幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板或權利要求2 4任一項所述的抑制豬源P53基因表達的RNA幹擾載體在抑制豬源p53基因表達中的應用。
10.權利要求2 4任一項所述的抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體在抑制豬源靶基因中的應用，其特徵在於通過將幹擾豬源靶基因的shRNA的轉錄模板取代幹擾豬源P53基因的shRNA的轉錄模板實現。
全文摘要
本發明公開了一種抑制豬源p53基因表達的RNA幹擾載體及其製備方法與應用，屬於基因工程領域。該RNA幹擾載體以pEGFP-C1為骨架載體，包括豬U6RNA聚合酶Ⅲ啟動子和幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板。將pEGFP-C1BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位點突變；將豬U6 RNA聚合酶Ⅲ啟動子和幹擾豬源p53基因的shRNA的轉錄模板通過酶切和連接的方式引入到pEGFP-C1載體上得到。該RNA幹擾載通過持續抑制靶基因的表達來進行RNA幹擾研究和/或鑑定基因功能，為抗病轉基因育種豬奠定了基礎。
文檔編號C12N15/85GK102839180SQ20121034946
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者沈海燕, 張建峰, 郭鵬舉, 張春紅, 周恆 , 朱餘軍 申請人:廣東省農業科學院獸醫研究所