一種用於診斷遲發性耳聾的GJB2基因p.V37I突變診斷試劑盒的製作方法

2023-04-22 19:09:01

專利名稱：一種用於診斷遲發性耳聾的GJB2基因p.V37I突變診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種試劑盒，具體地說，是一種用於診斷遲發性耳聾的GJB2基因 P.V37I突變診斷試劑盒。
背景技術：
聽力是語言發育過程中不可缺少的因素之一。對患有兒童永久性聽力損失 (Permanent Childhood Hearing Impairment，PCHI)的患兒進行早期的預防和幹預可取得良好的言語和認知發育。目前，普遍性新生兒聽力篩查(Universal Newborn Hearing Screening, UNHS)可早期發現新生兒期的聽力損失，但對於發生於新生兒期以後的遲發性耳聾(發病率在9歲兒童中約為0. 25%。-0. 99%。)，由於缺乏有效的風險因素評估和早期識別標識，尚缺乏有效的早期發現手段。新生兒聽力篩查技術在世界各國廣泛開展，可通過此篩查早期發現新生兒期聽力損失並進行早期幹預，以避免新生聾兒由聽力障礙而帶來的言語、語言等發育障礙。但發生於新生兒期以後的遲發性耳聾不能被新生兒聽力篩查所發現，目前尚缺乏能夠早期預警或早期發現的有效手段。遲髮型耳聾的最初發現目前主要依靠家長對患兒聽力狀況的觀測或患者自我檢測，發現時間較晚，容易因為聽力損失影響言語、語言等學習交流能力的正常發展。耳聾基因檢測技術近十年來已在國內外得到廣泛應用，可對遺傳性耳聾進行有效檢測和診斷。遲發性耳聾基因檢測原理上可對存在遲發性耳聾遺傳風險的患兒進行早期預警，結合聽力篩查以達到早期檢測、幹預和康復的目的。但此方法的瓶頸在於目前尚不知曉明確的可導致常見遲發性耳聾遺傳易感性的早期分子標識(基因突變)，因此無法有針對性的開展遲發性耳聾基因檢測。GJB2基因為中國人群常見聾病基因，其基因突變可導致隱性遺傳性耳聾。在GJB2 基因眾多突變中，P. V37I突變較為常見，帶有p. V37I排它性突變(包括p. V37I純合，以及 P.V37I與另外一個功能喪失突變的複合雜合兩種基因型)的個體易出現輕中度耳聾。中國專利文獻CN101363054A公開了一種體外檢測遺傳性耳聾相關縫隙連接蛋白 26基因GJB2突變的方法及檢測用試劑盒，通過進行聚合酶鏈反應，對GJB2基因基礎啟動區、外顯子1、外顯子2及剪切區域進行完整擴增，然後進行DNA序列測定，檢測GJB2基因突變的存在，能提高GJB2基因突變的檢出率和GJB2基因相關性遺傳性耳聾的診斷率。中國專利文獻CN1873027A公開了一種用於體外診斷非症候群性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2 突變的引物及其應用，提供用於體外診斷非症候群性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2基因全編碼區突變及233-235delC熱點突變的引物，可一次性完成GJB2全編碼區和兩側重要剪切序列的擴增，該發明還提供含有該引物和ApaI內切酶的試劑盒或類似產品，適用於對非症候群性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2基因突變進行大規模的篩查及診斷、遺傳諮詢。李景之等運用PCR直接測序的方法對139例無親緣關係的NSHL患者進行突變篩查，將兩種突變P. F115C和p. V37I構建到pEGFP表達載體，並轉染Hela細胞，研究其細胞表達和定位情況(詳見非症候群性耳聾(NSHL)患者Cx26基因突變分析及兩種突變體的亞細胞定位.遺傳，2009，31 (7): 705-712.)。但是國際、國內尚無關於p. V37I排它性突變與遲發性耳聾相互關聯的報導。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種GJB2基因p. V37I突變的應用。本發明的再一的目的是，提供一種用於診斷遲發性耳聾的GJB2基因p. V37I突變診斷試劑盒。本發明的另一的目的是，提供一種用於診斷遲發性耳聾的GJB2基因p. V37I突變診斷試劑盒的應用。為實現上述目的，本發明採取的技術方案是一種GJB2基因p. V37I突變在製備診斷遲發性耳聾產品中的應用，所述的P. V37I突變是p. V37I排他性突變。所述的p. V37I排他性突變是p. V37I純合基因型突變。所述的p. V37I排他性突變是p. V37I與一個功能喪失突變的複合雜合基因型突變。為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是一種用於診斷遲發性耳聾的 GJB2基因p. V37I突變診斷試劑盒，所述的試劑盒含有兩對巢式PCR擴增引物，所述的擴增引物為
第一輪 PCR 的引物GJB2 FO (SEQ ID N0.3)*GJB2 RO (SEQ ID NO. 4);第二輪 PCR 的引物GJB2 FI (SEQ ID N0.5)fPGJB2 RI (SEQ ID NO. 6)。所述的試劑盒還包括dNTP、DNA聚合酶及其緩衝液。為實現上述第三個目的，本發明採取的技術方案是所述的試劑盒在製備診斷遲髮型耳聾產品中的應用。本發明優點在於
1、本發明於國際、國內首次發現與遲發性耳聾高度相關的常見分子標識漢/a 基因 p. V37I排它性突變，並確立了基於該分子標識的基因篩查方法及其在新生兒篩查中的優先應用範圍；
2、通過對遲發性耳聾常見遺傳易感性早期分子標識的發現和相關應用性研究，可將由￠/ 基因P. V37I排它性突變所引起的遲發性耳聾預警時間提前至新生兒期，可廣泛應用於遺傳易感性遲發性耳聾早期檢測、幹預和康復，聾病基因篩查及診斷、遲發性耳聾聽力-基因聯合篩查及相關研究領域。


附圖1是巢式PCR擴增示意圖。附圖2是￠/ 基因所有外顯子PCR擴增的條件。附圖3是巢式PCR擴增產物電泳效果圖。附圖4是GJB2基因p. V37I純合突變。附圖5和附圖6是GJB2基因p. V37I排他性突變。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例1
￠/ 基因為中國人群常見聾病基因，其基因突變可導致隱性遺傳性耳聾。在￠/ 基因眾多突變中，P. V37I突變較為常見，帶有p. V37I排它性突變(包括p. V37I純合，以及 P.V37I與另外一個功能喪失突變的複合雜合兩種基因型)的個體易出現輕中度耳聾。所述的￠/ 基因的胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的p.V37I突變表示GJB2胺基酸序列的第37位由纈氨酸(V)突變為異亮氨酸(I)，見SEQ ID NO. 2。p. V37I排他性突變包括p. V37I純合(體細胞一對基因均攜帶p. V37I突變)，以及 P.V37I與另外一個功能喪失突變的複合雜合(體細胞一對基因一個攜帶p. V37I突變，另一個攜帶可導致GJB2基因功能喪失的其它突變)兩種基因型，該基因型特點為所有有功能的 GJB2基因都帶有p. V37I突變，即p. V37I排它性突變。通過超過1000例樣本的研究，本發明首先發現p. V37I在中國人群中的攜帶率為 6.1% (ri=3032，見表1)，是目前所發現的最常見的耳聾基因突變位點。既往研究顯示，當個體攜帶￠/ 基因P. V37I排它性突變時，其產生輕中度聽力下降的可能性大大增加，且部分病例表現為進行性聽力下降。本發明研究過程中，假設並證明了 ￠/ 基因P. V37I排他性突變與遲發性耳聾相關，可作為早期分子標識來進行遲發性耳聾風險評估和基因預警，過程如下
通過門診和21427例上海地區幼兒園兒童篩查，共收集45例可疑或確診的中國人群遲發性耳聾病例。確診病例定義為出生時雙側耳新生兒聽力篩查通過，在9歲前發展為雙側遲發性耳聾(聽力較好耳PTA在0. 5k、lk、2k以及4 kHz平均聽閾彡40 dBHL)，(n=14，年齡2-9歲，平均發病年齡5. 0歲);非確診病例組定義為出生時未行新生兒聽力篩查，在5歲或以後出現雙側PCHI (n=31，平均發病年齡8歲，年齡5_12歲)。GJB2基因突變檢測通過PCR擴增及雙向測序檢測。GJB2基因p. V37I排他性突變在確定病例組發生率為21. 4% (3/14)，非確診病例組發生率為19. 4%(6/14)，在對照組中，1516例新生兒中發生率為0. 4% (6/1516)，詳見下表1。 表1 p. V37I排他性突變在各人群中的攜帶率
權利要求
1.一種GJB2基因p. V37I突變在製備診斷遲發性耳聾產品中的應用，其特徵在於，所述的p. V37I突變是p. V37I排他性突變。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的p.V37I排他性突變是p. V37I純合基因型突變。
3.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的p.V37I排他性突變是p. V37I與一個功能喪失突變的複合雜合基因型突變。
4.一種用於診斷遲發性耳聾的GJB2基因p. V37I突變診斷試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒含有兩對巢式PCR擴增引物，所述的擴增引物為第一輪 PCR 的引物GJB2 FO (SEQ ID N0.3)*GJB2 RO (SEQ ID NO. 4);第二輪 PCR 的引物GJB2 FI (SEQ ID N0.5)fPGJB2 RI (SEQ ID NO. 6)。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒還包括dNTP、DNA聚合酶及其緩衝液。
6.根據權利要求4和5任一所述的試劑盒在製備診斷遲髮型耳聾產品中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種GJB2基因p.V37I突變在製備診斷遲發性耳聾產品中的應用，所述的p.V37I突變是p.V37I排他性突變。本發明還提供一種用於診斷遲發性耳聾的GJB2基因p.V37I突變診斷試劑盒及其應用。本發明優點在于于國際、國內首次發現與遲發性耳聾高度相關的常見分子標識GJB2基因p.V37I排它性突變，並確立了基於該分子標識的基因篩查方法及其在新生兒篩查中的優先應用範圍；可將由GJB2基因p.V37I排它性突變所引起的遲發性耳聾預警時間提前至新生兒期，廣泛應用於遺傳易感性遲發性耳聾早期檢測、幹預和康復，聾病基因篩查及診斷、遲發性耳聾聽力-基因聯合篩查及相關研究領域。
文檔編號C12Q1/68GK102304584SQ20111027342
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月15日 優先權日2011年9月15日
發明者吳皓, 楊濤 申請人:上海交通大學醫學院附屬新華醫院