用於肝祖細胞擴增或分化的細胞外基質組分的製作方法

2023-04-22 19:04:21 2

專利名稱：：用於肝祖細胞擴增或分化的細胞外基質組分的製作方法
技術領域：
：本發明一般涉及肝祖細胞的體外增殖或分化。更具體地說，本發明涉及能使包括肝幹細胞在內的肝祖細胞在體外增殖和/或分化的細胞外基質組分的鑑定和選擇。
背景技術：
：肝幹細胞及其子代(如成肝細胞和定向祖細胞)有相當大的擴增潛能。所以，這些細胞是用於細胞治療(包括生物人造肝臟或細胞移植)的理想的候選群體。儘管前景看好，但是，肝細胞治療的全部潛能還仍停留在認識階段。在某種程度上，肝幹細胞及其子代的體外增殖已證實很有挑戰性。雖然肝幹細胞及其子代能在體內成功地增殖，但是其培養條件並非從實驗室臺面轉向臨床實踐的最佳條件。例如，一些培養條件極大阻礙了細胞分裂或者任意促進細胞分化，從而降低了增殖效能。而且，一些培養條件中需要添加多種因子(如血清或飼養細胞)，而這些因子能引入汙染物，從而限制了它們在人類治療中的應用。所以，需要有能促進肝幹細胞及其子代在體外增殖的培養條件和能對幹細胞進行世系限制，使其向合適的命運分化的條件。另外，還需要有能消除對詞養細胞的需求的培養條件。
發明內容在本發明的一實施例中，提供了一種使肝祖細胞在體外增殖的方法，其包括(a)提供分離出的肝祖細胞，和(b)在包含從肝臟幹細胞區室中發現的一種細胞外基質組分或多種細胞外基質組分組合的層上培養分離出的肝祖細胞。所述細胞外基質組分可以是III型膠原、IV型膠原、層粘連蛋白、透明質素、其他糖胺聚糖、硫酸乙醯肝素蛋白聚糖、硫酸軟骨素蛋白聚糖或其組合。在一些實施例中，所述層可以包含其他細胞外基質組分，它們可以是蛋白聚糖如聚集素(agrin)、串珠素(perlecan)、整合素、巢蛋白、肌營養不良聚糖等，或基粘附分子(basaladhesionmolecule)如纖連蛋白，或其他蛋白如彈性蛋白及其組合。在本發明的優選實施例中，第一細胞外基質組分是III型膠原，第二細胞外基質蛋白是層粘連蛋白。根據本發明的方法，分離出的肝祖細胞可以是分離出的肝幹細胞、分離出的成肝細胞、定向肝祖細胞，或其組合。另外，該方法可以進一步包括在飼養細胞存在條件下，培養肝祖細胞，所述飼養細胞可以是胚胎細胞、胎兒細胞、新生兒細胞和/或鼠源細胞。飼養細胞優選為成血管細胞。該方法還可以包括在不含血清的培養基中培養肝祖細胞的步驟。優選地，所述不含血清的培養基包含胰島素(5嗎/ml)、轉鐵蛋白/Fe(5嗎/ml)和脂混合物(游離脂肪酸、高密度脂蛋白)、低含量鈣(<0.5mM)以及很少量或不含銅。所述肝祖細胞可以從胎兒、新生兒、幼體或成體肝臟中獲得。所述層粘連蛋白的濃度可以約為0.1-10jig/cm2，優選為約0.5-5嗎/cm2，更優選為0.5嗎/cm2或ljig/cm2。III型或IV膠原的濃度各為約0.1-15|ig/cm2，優選為約0.5-8嗎/cm2，更優選為約l-7)ig/cm2。在本發明的另一實施例中，提供了一種使肝祖細胞增殖的方法，其包括(a)提供含有從肝臟的幹細胞區室中發現的一種或多種細胞外基質組分的第一層；(b)提供含有從肝臟的幹細胞區室中發現的一種或多種細胞外基質組分的第二層；以及(c)在第一層和第二層之間培養分離出的肝祖細胞。所述細胞外基質組分可以是m型膠原、IV型膠原、層粘連蛋白、透明質素、蛋白聚糖(如硫酸乙醯肝素和/或硫酸軟骨素蛋白聚糖)或其組合。在一些實施例中，所述層可以包含其他細胞外基質組分，它們可以是其他蛋白聚糖(如聚集素(agrin)、串珠素(perlecan)、巢蛋白、肌營養不良聚糖)，其他基粘附分子(如纖連蛋白)和其他細胞外基質蛋白(如彈性蛋白)及其組合。在本發明的一優選實施例中，所述第一細胞外基質組分是m型膠原，所述第二細胞外基質組分是層粘連蛋白。根據本發明的方法，分離出的肝袓細胞可以是分離出的肝幹細胞、分離出的成肝細胞、定向肝祖細胞，或其組合。另外，該方法可以進一步包括在提供間充質祖細胞作為飼養細胞的條件下，培養肝祖細胞，所述間充質祖細胞可以來源於胚胎、胎兒、新生兒、幼體或成體組織，而且可以取自任何哺乳類動物。該飼養細胞優選為成血管細胞。該成血管細胞優選來自肝臟。成血管細胞優選來自與肝祖細胞相同的細胞類群。該方法還可以進一步包括在不含血清的培養基中培養肝祖細胞的步驟。所述肝祖細胞可以從胎兒、新生兒、幼體或成體肝臟中獲得。所述層粘連蛋白的濃度可以約為0.1-10pg/cm2，優選為約0.5-5昭/cm2，更優選為0.5或ljig/cm2。III型或IV膠原各自的濃度約為0.1-15|ig/cm2，優選為約0.5-8|ig/cm2，更優選為約l-7|ig/cm2。在本發明的再一實施例中，提供了一種用於肝祖細胞增殖的器皿，其包括(a)器皿(如組織培養板、實驗室晶片、生物反應器)和(b)含有在肝臟小生境的幹細胞區室中發現的至少一種細胞外基質組分的非可溶性層，其中，該非可溶性材料基本上覆蓋在器皿內的或器皿的表面上。同樣，本領域的技術人員會理解，本文公開內容所依據的思想可以很容易地用作實現本發明幾個目的的其他結構、方法和系統的設計基礎。因此，很重要的一點是，權利要求應視為包括那些未脫離本圖1是培養設計系統和膠原基質基層的示意圖。i.)成肝細胞接種在由營養培養基支持的組織培養塑料(TCP)表面上的對照培養；ii.)用來構建膠原基質基層(matrixsubstrate)的各成分的一種比例；iii.)接種了成肝細胞的膠原平板(FlatPlate)設計；iv.)膠原和成肝細胞的"三明治"式設計。圖2是往TCP表面上塗布單層基質的技術示意圖。v.)TCP表面上進行預塗布的起始步驟。基質分子在設定的時間段內不均勻地分布到該表面上。vi.)滅菌過程；vii.)1XPBS洗滌3次，中和膠原凝膠或纖維構建程序中產生的乙酸pH。viii.)含有以單層形式接種到基質上並由營養培養基支持的肝細胞的終產品。圖3提供了用於STO5培養物中發現的基質組分的免疫組織化學結果的圖片。圖4是培養第0、5、15和31天時肝細胞特徵的定時20X顯微照片。圖4A:第0天顯現出較大團塊的成肝細胞以及分散的單個細胞。圖4B:第5天顯現出匯集成片的肝細胞和相關的間充質細胞。圖4C:第15天成肝細胞和間充質細胞數量相同。圖4D:第31天富含間充質細胞。圖5所示為在對照TCP、平板和三明治式設計系統內培養的人胎兒肝細胞在第10天的IOX顯微圖片。A)對照培養反應情況一一成肝細胞(h)被間充質細胞(np)被淹沒。B)平板培養反應情況一—成肝細胞集落，有少許間充質細胞。C)三明治式培養反應情況一一被免疫染色的表達白蛋白(紅色)和CK19(綠色)的成肝細胞(h)。圖6顯示了在各種不同基質上生長的細胞所產生的尿素產量。A)對膠原III(■)、膠原IV(*)、層粘連蛋白和膠原IV-層粘連蛋白混合物(▽)上培養的成肝細胞進行分析並與塑料對照(▼)培養進行比較。B)在TCP(*)、膠原I平板和膠原I三明治(▽)上培養的成肝細胞的尿素功能。圖7顯示了在各種不同基質上生長的細胞所產生的葡萄糖和尿素產量。A)在對照TCP(■)、平板(□)和三明治(i)系統設計上培養的成肝細胞的葡萄糖肝功能。B)在對照TCP(■)、平板(□)和三明治。)系統設計上培養的成肝細胞的肝臟氨水平圖8顯示了在肝細胞小生境的基質組分上生長的肝祖細胞的體外生長特徵。圖中所示為接種到A1)膠原III、Bl)層粘連蛋白和C1)膠原III和層粘連蛋白的混合物上的成肝細胞培養到第10天，從其所在整個平皿表面上方攝取的圖像。在IOX放大倍數下，對同一培養物進行觀察(A2、B2禾卩C2)以便闡明細胞水平的反應情況。圖9顯現出在胚胎基質基層(膠原III和膠原IV)上接種人胎兒肝細胞之後肝幹細胞集落的過度生長。第3天在所有基質基層上顯現出成肝細胞。所有條件下還顯現出非實質細胞(np)，並在顯微圖片中被予以標記。膠原III上的培養物中最初在第3天發現肝幹細胞，但在TCP、膠原III和膠原IV上培養到第10天肝幹細胞也顯現出來。圖IO所示為根據本發明選擇出的肝幹細胞。第12天，長時間培養中伴隨不同類型細胞的爆發(確定為成肝細胞)的分化動力學從HSC集落邊緣出現。A)中突出標識的區域表示從第3-11天開始進化的HSC集落，B)展現出8小時時段內的爆發。圖11為將肝細胞母液純化成HSC細胞母液的示意圖。圖12為傳代方案的示意圖最初將HSCs接種到對照TCP皿上，如A所示；再將HSCs轉移到6孔培養皿中的0.4nm多孔培養池上，如B所示；C是未處理培養池的俯視圖。D是預先塗覆在培養池上的膠原ni的俯視圖。E是轉移到培養池表面上的細胞的終產品。圖13:A)被接種在TCP的成肝細胞包圍的聚集在一起的HSC。A2)Al中HSC聚集體的放大圖。Bl)接種在TCP上的經ficol分離法純化的HSC聚集體。B2)Bl中HSC聚集體的放大圖。顯微圖片下方的信息表顯示的是免疫螢光反應情況。高活性(++)、活性(+)、可變(+/-)和陰性(-)。圖14顯示的是用於標記EpCAM、CK19禾BNCAM的免疫螢光圖。EpCAM是顯著陽性(Al相)對(A2螢光)。CK19顯現出可變性(B1&C1相)對(B2陰性HSC螢光&C2陽性螢光)。NCAM也顯現出可變性(D1&E1相)對(D2陽性&陰性HSC螢光&E2陽性螢光)圖15是接種在TCP或Bornstcin和Traub(BoTr)膠原I片段基層(SigmaIII型膠原)上時，對所形成的HSC集落數進行的比較圖。另夕卜，更詳細的圖表示在其他成體(膠原I型)和胎兒(BD膠原III&IV)基質上的集落形成圖16所示為接種在TCP或Bornstcin和Traub(BoTr)膠原I型片段基層(Sigmam型膠原)上HSC集落擴增的反應情況。箭頭指的是第7天新看到的集落。第18天，在4X顯微圖片中的BoTr表面上顯現出較大的集落聚集體，第30天，在兩個接種平面上均顯現出散開的聚集體。圖中顯示了塑料、BoTr和胎兒膠原III&IV基質上的20X形態細節。圖17所示為接種在TCP(黑色)或Bornstcin和Traub(BoTr)膠原I型片段基層(SigmaIII型膠原)(灰色)上的HSCs的整個聚集體增殖圖樣。為進行圖樣標準化，用較大的帶有波紋線的圓圈表示整個接種面(35mmD平皿)。接種在BoTr上的HSCs最早開始增殖(第5天)，得到較大的表面覆蓋率(第20天)，從表面散開時(第30天)比對照慢。當接種到含購自BD的膠原III&IV和購自Vitrogen的膠原I的不同基質基層上時，用更詳細的圖像對集落生長進行了比較。圖18給出第5-30天的標準化後的細胞數量，圖中表示出從對數生長期(第5-10天)到飽和密度動力學時期(第10-20天)再到後期匯集期(第20-30天)的變化情況。HSC的BoTr接種培養物顯示出，整個培養期間的增殖數增加。圖19所示為對數生長期(第5-10天)、飽和密度動力學時期(第10-20天)和後期匯集期(第20-30天)的變化情況，展示出細胞增殖的"增倍"和"減弱"方面。圖20顯示出HSC向4個獨特表面的轉移。最初轉移了17個集落。轉移後的14天內對HSC集落特性進行了比較。Bomstdn和Traub(BoTr)膠原I型片段基層(SigmaIII型膠原，6jig/cm2)上轉移的HSCs提供了最有效的環境。圖21所示為標準化後的比較成肝細胞(第5-ll天)、HSCs和成肝細胞(第9-17天)，以及僅HSCs(第12-30天)的白蛋白函數圖。圖22所示為在TCP(黑框)與Bornstcin和Tmub(BoTr)膠原I型片段基層(SigmaIII型膠原)(淺灰色框)上培養的肝幹細胞在第10和20天的端粒酶活性水平一一HeLa細胞(黑灰框)作為"基準比較"。A)經標準化換算為蛋白質水平的樣品活性。B)經標準化換算為細胞數的樣品活性。顯微圖片是相同的相中人HSCs、陰性對照，以及具有端粒酶表達的人HSCs。具體實施例方式在本發明的一實施例中，細胞外基質組分被鑑定出，它們能促進肝幹細胞及其子代的附著、生存和體外增殖。本文中"肝祖細胞"用來泛指包括肝幹細胞及其子代。"子代"可以包括自我複製的肝幹細胞、成肝細胞、其多能祖細胞，以及定向分化成特定細胞類型(如肝細胞)的祖細胞。"克隆源細胞擴增"(donogenicexpansion)是指能從一個細胞開始擴增，經傳代培養和反覆擴增，仍保持母細胞表型的細胞生長特性。"集落形成"是指能在一周或兩周內進行有限次細胞分裂(通常5-7次細胞分裂)的二倍體實質細胞的特性，其包括具有能進行傳代培養的有限能力的細胞。"多能"表示細胞能形成一種以上命運的子細胞。"專能"或"定向祖細胞"是指具有一種成體命運的細胞。肝幹細胞(HSCs)是在胎兒和新生兒肝臟的管板(ductalplate)(又稱界板)以及幼體和成體肝臟的赫令管(CanalsofHering)中發現的多能細胞，端粒酶的表達，證明這些細胞能自我複製(ref)，而且移植時(refs)能形成成熟的肝臟細胞。這些細胞是EpCAM+、NCAM+、ALB+、CK8/18+、CK19+、CD133/l+，對所試驗的所有造血標誌物(如CD34、CD38、CD45、CD14)、間充質細胞標誌物(CD146、VEGFr、CD31),以及P450s或a-甲胎蛋白的表達呈陰性。已經發現HSCs是成肝細胞和定向(單能)膽囊祖細胞的源頭。成肝細胞(HBs)是在胎兒和新生兒肝臟的整個實質中發現的多能細胞，以單細胞或細胞小集落形式束縛在赫令管的端部。成肝細胞來源於肝幹細胞。成肝細胞共用肝幹細胞上存在的許多抗原，但有重要區別。例如，成肝細胞不表達NCAM，而是表達ICAMI，而且成肝細胞表達大量的oi-甲胎蛋白和P450s胎兒形式。這些HBs產生單能祖細胞、定向肝祖細胞和膽囊祖細胞。肝定向祖細胞是肝系和膽囊系的單能祖細胞。它們的抗原特性與成肝細胞重疊，但是，膽囊定向祖細胞表達CK19，但不表達AFP或ALB;而肝定向祖細胞表達AFP禾卩ALB，但不表達CK19。定向膽囊祖細胞既直接來源於肝幹細胞，也來源於成肝細胞。間充質細胞(MCs)包括許多不同類型(按成熟細胞列舉，括號中為它們的前體)的間充質細胞的各種不同世系階段中的細胞包括基質(間充質幹細胞)、內皮(成血管細胞)、星狀細胞(星狀細胞前體)和各種造血細胞(造血幹細胞)。雖然本文討論和舉例的肝祖細胞中大部分(如果不是全部的話)涉及人源細胞群，但本文的教導不應局限於人。事實上，本領域的普通技術人員通常應該可以將本文的教導應用到哺乳動物(如小鼠、大鼠、狗等)肝祖細胞的擴增中。所以，本發明的範圍欲包括任一及所有哺乳動物的肝祖細胞。還應注意，適於根據本發明進行體外增殖的肝祖細胞並不局限於根據任一特定方法分離或鑑定出的那些肝袓細胞。作為示例，肝祖細胞的分離和鑑定方法已有文獻記載，如美國專利6,069,005;美國專利申請09/487,318、10/135,700禾口10/387,547，其公開內容通過引用整體併入本申請。肝幹細胞和成肝細胞具有獨特的抗原性，能通過前面敘述的方案進行分離。例如，肝幹細胞和成肝細胞共用多種抗原(如細胞角蛋白8、18和19、清蛋白、CD133/1和上皮細胞粘附分子(EpCAM))，對造血標誌物(如血型糖蛋白A、CD34、CD38、CD45、CD14)和間充質細胞標誌物(如CD146、CD31、VEGFr或KDR)呈陰性。另夕卜，肝幹細胞和成肝細胞能通過大小(肝細胞7-9pm;成肝細胞10-12pm)、培養形態學(肝細胞形成濃密的、形態一致的集落，而成肝細胞形成索狀結構，其中散布有清晰的溝槽_—假定性小管)、某些抗原表達模式中的差異(EpCAM在整個肝幹細胞中都有表達，但只在成肝細胞的細胞表面表達)，或者通過不同的抗原特性(肝幹細胞中存在N-CAM，而成肝細胞表達a-甲胎蛋白(AFP)和ICAM1)加以區分。胎兒和新生兒肝臟中，肝幹細胞存在於管板(又稱"界板")內，而成肝細胞是主要的實質細胞群(>80%)。幼體和成體組織中，肝幹細胞存在於赫令管內，而成肝細胞是束縛在赫令管端部的細胞。正常組織中成肝細胞由少量細胞組成，但卻大量(如結節)見於病變肝臟中(如肝硬化)。本發明人發現，在肝臟的肝細胞小生境內或附近發現的細胞外基質組分能用於肝祖細胞擴增而不誘導分化，優於現有技術。下面會詳細介紹，在基質組分上培養的細胞(在肝臟肝細胞小生境內或附近發現的高豐度細胞)在某些基質組分上(如層粘連蛋白)聚集形成橢球狀結構，而在另一些組分(如ni型膠原)上鋪展開形成單層。在肝細胞小生境中發現的細胞外基質組分的具體類型屬於肝祖細胞按自我複製模式擴增的信號必需物，自我複製模式是指對稱的細胞分裂(子細胞與母細胞相同或近乎相同)。我們進一步認為，肝幹細胞的成熟依存於指導(至少一定程度上)肝幹細胞分化的基質組分的獨特組合。某些細胞外基質組分允許肝祖細胞發生由不對稱分裂引起的擴增，這類擴增與某些分化一起發生。但另一些位於發現有完全成熟肝細胞的肝臟組織區域中的細胞外基質會引起細胞生長停滯和完全分化。所以，用胚胎組織(或肝細胞小生境)中發現或富含的基質組分進行體外培養，有助於維持成熟形式的肝幹細胞。同樣，用從成熟組織中發現的或成熟組織中富含的基質組分培養，也可以影響這些細胞的分化。的確，將位於肝腺泡中心靜脈附近狄氏間隙內的肝祖細胞平鋪到與成熟實質細胞有關的基質組分如I型膠原和某些形式的纖連蛋白上，其分裂緩慢，之後停止增殖，該過程同時伴隨著對肝細胞命運的世系限制。肝祖細胞不能附著到纖連蛋白上或者不能在纖連蛋白上生存，那些確實附著的肝祖細胞則快速凋亡和死亡。但是，肝祖細胞產生後代的附著、生存和功能發揮需要有纖連蛋白存在。所以對細胞外基質組分的具體類型或化學特性的要求具有世系依賴性，也就是說，這些需求與細胞的具體成熟階段相關。本發明的範圍不應局限於任何一種基質組分或其組合。與本文的教導一致，本發明描述和講解了任一種和所有細胞外基質組分及其組合在形成能被用於維持體外細胞擴增或分化的基質方面的應用。雖然這些組分中有許多會在下面討論，但為了闡述清楚，將以層粘連蛋白、IV型膠原和/或III型膠原作為從胚胎組織或肝細胞小生境中發現或高豐度存在於其中的一類細胞外基質組分的代表例予以討論。胚胎基質組分的非限制例包括特定類型的膠原，包括膠原IV型(進一步包括al、a2、a3、a4、a5、a6)和膠原III型；層粘連蛋白(包括l、y1、(32、a3、a5);透明質素；多種形式的硫酸軟骨素蛋白聚糖或其糖胺聚糖鏈；多種形式的硫酸乙醯肝素蛋白聚糖或其糖胺聚糖鏈(如某些多配體蛋白聚糖)。從成熟組織中發現的基質組分的非限制例包括穩定形式的膠原(如i和n型)，多種形式的纖連蛋白；硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(如聚集素、串珠素)，肝素蛋白聚糖；皮膚素蛋白聚糖(如軟骨相關性硫酸皮膚素蛋白聚糖)和彈性蛋白。各種不同的細胞培養基都可以適用本發明。通過向培養基中添加或去除生長因子和/或分化因子，可以影響細胞的增殖和/或分化率。例如，添加血清，能減慢肝祖細胞的生長，引起對肝細胞命運的世系限制，以及引起間充質細胞群(基質和內皮)的快速擴增。添加表皮生長因子會導致對肝細胞命運的世系限制。優選地，在有些實施例中，本文所述基質組分與不含血清的培養基聯合使用。現已研發出成肝細胞用的不含血清的培養基，見美國專利申請09/678,953所述，該申請公開內容整體併入本文。目前認為但不受理論限制，本發明的基質組分提供了許多通常由詞養細胞提供的生存、生長和/或增殖信號。所以，本發明在相當大程度上可以替代為維持肝祖細胞的活力和擴增潛能而使用胚胎基質飼養細胞的需求。下面通過非限制性例子對本發明的一個實施例進行描述。實施例培養基與緩衝液除非另外說明，處理肝臟組織和維持細胞培養的過程中均使用不含血清的培養基。該培養基含有500ml添加了0.1%牛血清白蛋白(第五組分)的RPMI1640、10ng/ml牛holo-轉鐵蛋白(飽和鐵)、5|ig/ml胰島素、500^1硒、5mlL-穀氨醯胺、270mg煙醯胺、5mlAAS抗生素、500^1氫化可的松、1.75^12-巰基乙醇和38^1按已公布的美國專利申請09/678,953所述製備的游離脂肪酸混合物。將此培養基滅菌，使用前調節pH至7.4。"細胞洗滌緩衝液"含有添加了1%牛血清白蛋白的500mlRPM11640、50(Hd硒和5mlAAS抗生素。"酶消化緩衝液"含有100ml添加了60mgIV型膠原酶和30mgDNA酶(37。C溶解)的細胞洗滌緩衝液。組織獲取與製備從認證機構如美國加利福尼亞州阿拉米達高等生物科學資源所(AdvancedBiosciencesResourcesofAlameda)獲取16-22周孕齡之間的人胚胎的肝臟組織。理想的是，組織在被分離後18小時內被接收並抵達，用作多個組織部分或者偶爾用作適度完整的肝臟。一般來說，整個組織的體積約為4-12ml，含有大量紅血細胞(RBCs)。用機械法將肝臟解離，再用酶消化緩衝液對組織進行部分消化，產生實質細胞團。洗滌這些細胞團、低速離心，以便基本上去除游離漂浮的造血細胞，但保留肝實質。然後將解離後的肝分割成每份3ml，每份中加入25ml酶消化緩衝液。32°C，溫和攪拌30分鐘後，倒掉上清液，存放在4"C。再用新鮮的酶消化緩衝液對剩餘的沒有變成碎片的團塊另外消化30分鐘。對組織碎片進行的酶消化過程結束後，在250旋轉離心力(RCF)下將細胞懸浮液離心；倒掉上清液；將離心團塊重懸在等量的細胞洗滌緩衝液中。分離技術取自胎兒肝臟的肝細胞懸浮液中充滿造血細胞，尤其是紅系細胞。事實上，人胎兒肝臟的初始細胞懸浮液平均由僅6-9%的實質細胞和其餘為各種不同的非實質細胞尤其是紅系細胞組成。由於去除紅系細胞的常規方法如使用裂解緩衝液可能對肝祖細胞有毒性，所以最好選用其他方法。例如，使用已經公布的方法(Lilja等人，1997;Lilja等人，1998)經過反覆低速離心，可以將紅系細胞和實質細胞分開。可以使用另外一種更有效的方法一一補體介導細胞毒性法，使候選幹細胞的損失降低到最小程度。用膠原酶消化後，將抗人紅血細胞(RBC)抗體用所述細胞懸浮液(1:5000稀釋)在37。C溫育15分鐘。為了刺穿並裂解抗體標記的紅細胞，加入補體(如LowTox豚鼠補體)(1:3000稀釋)，在37'C溫育10分鐘。由於紅細胞釋放出血紅蛋白，所以細胞上清液會變成淡粉紅色。造血細胞被去除後，懸浮液由至少80-90%的實質細胞組成。將除去造血細胞後得到的懸浮液再用新鮮膠原酶溶液進行30分鐘的第二輪酶消化，以最大程度的減小細胞團塊，之後用75iim尼龍篩過篩。用臺盼藍排除法估測細胞活力，其活力常規在95%以上。過濾後，肉眼觀察到，大多數成肝細胞呈細胞團塊，每個聚集團含4-8個細胞。這些技術組合有助於形成基本上不含紅血細胞但富含實質肝細胞的細胞懸浮液。進一步的富集方案包括Ficoll分離法(FicollFractionation),用於分離成肝細胞。簡單來說就是，將細胞懸浮在10ml不含苯酚紅的基本培養基中，然後覆蓋在50ml離心管內等體積的分離介質Ficoll-Paque(AmershamPharmacia)上方。1000Xg離心25分鐘。收集分界面細胞和成團細胞。Ficoll分離法得到的團塊中實質細胞一般佔80%以上，這些細胞基本上都是成肝細胞，界面中含13-14%的初始細胞群，其抗原特性各異，說明存在實質細胞、造血細胞和內皮細胞。Fico11分界面細胞得到0.1%的管板細胞集落，其數量比初始細胞懸浮液中的管板細胞增加10倍。雖然用Ficoll分離法分離成肝細胞時每次得到的結果可能是一致的，但是用該方法分離幹細胞時每次製備得到的結果往往變化較大。免疫選擇技術是另一種富集和/或分離肝幹細胞(管板細胞)或其他亞群的技術。免疫選擇方案中使用在細胞上強表達的抗原(如所有肝祖細胞上發現的EpCAM)和一個肝祖細胞亞群上的其他抗原(如管板細胞上的NCAM)是比較理想的。免疫選擇技術可以採用這些程序所適用的各種不同方法中的任一方法進行，可以採用細胞儀、親合板粘附或磁珠。磁性免疫選擇法包括細胞表達的分離，例如使用與磁性微珠結合的單克隆抗體HEA125禾nMiltenyiBiotec公司(德國BergischGladbach)的autoMACSTM或CliniMACS⑧磁性柱分離系統，按照生產商推薦的操作方案，從人肝細胞懸浮液中分離EpCAM。NCAM、CD146、KDR(VEGFr)和CD133/1細胞的免疫選擇方法與之類似。試驗所有進行的試驗中，均使用6孔平皿，每個孔接種0.8X106個實質細胞。在接種開始後的第一個IO小時，向培養基中添加10%胎牛血清。一般認為，在起始鋪板期間添加血清，會促使組織消化所用的酶失活，而且對初始的附著有幫助。之後，只使用不含血清的培養基。通常每隔24小時更換一次培養基，有些情況下，隔3天更換一次培養基。除非另外說明，實驗值均通過標準化換算為營養培養基體積和細胞數。基於尿素能與二乙醯一肟直接相互作用的原理進行試驗，以確定所收集的培養基樣品的尿素濃度。診斷試劑盒用的標準和試劑從Sigma公司購買。對這些試劑盒進行調整以適應96孔微板的使用。首先製備稀釋後的濃度標準。使用系列稀釋，減小標準濃度，使標準範圍在0-30.76mg/dL之間。然後將血-尿素-氮(bun)酸性試劑和bun顯色劑按1.3:1.0混合，製成混合試劑。本試驗方案包括先往各微板孔內加9ml合適的樣品(如空白、標準或樣品)，再加100ml混合試劑。50°C，溫育大約25分鐘或者溫育到在濃度標準內看到明顯的標準顏色變化為止。然後將微板底物置於冰上冷卻3分鐘。冷卻之後立即使用CytoFluor多孔細胞計數儀在535nm測定光密度變化。氨-叫根據NH3能與溴酚藍(氨指示劑)發生反應的原理進行比色試驗，使用VITROSDT60II化學系統(Ortho-ClinicalDiagnostics,RochesterNY)進行試驗分析。該自動過程需要10|il樣品、5分鐘溫育時間、37'C環境室和605nm吸收測定管。置於該化學分析儀內部後，玻片上標示出光密度變化，並且相對預先校準的標準標示出所在位置。VITROSDT60II化學系統使用的是雙反應序列。首先，葡萄糖氧化酶催化樣品葡萄糖氧化形成H202。然後過氧化氫酶在染料前體存在條件下催化氧化偶聯，其中，用反射光測定染料濃度。各個試驗包括先在各化學玻片上滴加10pl合適的樣品(如空白、標準或樣品)。置於該化學分析儀內部後，玻片上標示出光密度變化，並且相對預先校準的標準標示出所在位置。免疫染色用乙酮/甲醇(50/50)混合物將培養物固定，持續2分鐘，再用1XPBS洗滌，10%山羊血清封閉45分鐘。之後進行細胞免疫染色。加入標記螢光探針的人第一抗體，室溫下處理l-8小時。使用未標記的第一抗體時，則用標記螢光探針的第二抗體進行細胞染色。增殖使用放大倍數為4X、10X和20X的相差顯微術，通過集落生長大小變化成像來評估肝袓細胞的增殖情況；使用低倍物鏡，可以觀察到全部集落。對集落重複成像，並相對預先在統計比較分析所用MetaMorph圖像處理軟體上校準的已知尺寸對顯微圖片進行標準化處理後，獲得生長曲線。組織培養基質的製備對照研究包括將人胎兒肝細胞直接接種到組織培養塑料(TCP)上(圖1A)。製備3個不同濃度(0.5、1.0或2嗎/cm2)的纖連蛋白平板，將pH調節到7.5。製備膠原I型平板，濃度l-1.5mg/ml。製備過程中，按特定比例加入10XDMEM禾B0.1MNaOH，將高密度Vitrogen100(CohesionTechnologies,PaloAlto,CA)變成液態膠原I型。更具體點說，圖IB所示為本發明的一個實施例，該實施例中，將0.25ml0.1MNaOH、0.25ml10XDMEM或PBS、1.5mg/mlVitrogen100加到一起，在4'C輕輕地混合成均質溶液。混合過程中，最好避免將氣泡混入新形成的膠原I型懸浮液內，因為空氣間隙能破壞膠原的穩定性。將該膠原I懸浮液預先鋪在平皿孔表面，分別製備圖IC和1D所示的平板(FP)和"三明治"式設計。平板製備中，向6孔板的每個孔內加入0.4ml膠原I懸浮液。在37'C和5。/。C02條件下靜置1小時，讓膠原I懸浮液形成凝膠。然後準備接收肝祖細胞。三明治板的製備可以和平板相同。但是，為了將細胞製成"三明治"，將第二層膠原懸浮液倒在表面上附著細胞的平板上。如平板一樣，在37"C和5%(:02條件下溫育1小時，以凝固成新的頂部膠原層。之後，加入0.5ml不含血清的培養基，用作營養支持。製備2個不同濃度(0.52或1.0|ig/cm2)的層粘連蛋白平板，pH調節到7.5。使用5個不同蛋白濃度(2.1、4.2、6.3、8.3或10.4嗎/cm2)中的1個濃度製備鋪在平皿上的膠原覆蓋層。鋪皿後，在37。C和5%C02下靜置10小時，使該基質附著。鋪皿過程如圖2所示，其中基質分子在醋酸緩衝液中和平皿內不均勻地隨機分布。約10小時內，這些基質分子穩定下來並以單一均勻陣列附著在孔表面上。UV滅菌2小時，1XPBS漂洗，使酸性pH中和。用pH3乙酸製備膠原III板，用0.5M乙酸製備膠原IV板，製備方法與上面類似。製備組合板時，將III型膠原和層粘連蛋白共同鋪在TCP表面上，它們各自的濃度分別為6.25嗎/cn^和0.52昭/cm2。將IV型膠原和層粘連蛋白共同鋪在TCP表面上，它們各自的濃度分別為4.2嗎/cm2和1.0嗎/cm2。肝幹細胞區室中基質組分的鑑定通過免疫組織化學技術對胎兒肝部分的肝細胞區室內基質組分進行體內鑑定，通過胚胎間充質詞養細胞產生的基質組分試驗對肝細胞區室內基質組分進行體外鑑定。使用成血管細胞(肝幹細胞的自身間充質搭檔)和鼠胚胎基質飼養細胞(如STO細胞)作為這些實驗的代表性細胞。如表I所示，該研究確定飼養細胞(如成血管細胞和STO飼養細胞)產生層粘連細胞、in型膠原和iv型膠原、透明質素和硫酸乙醯肝素蛋白聚糖。注意，肝幹細胞具有透明質素(圖3)和己鑑定出的膠原的受體。表Itableseeoriginaldocumentpage21更詳細的比較研究見表II。表IItableseeoriginaldocumentpage22表II中開展的調査描述了人肝幹細胞的反應情況，包括細胞附著、細胞生存、形成幾何形狀培養物、形成獨特集落、分裂率、免疫組織化學應答，以及功能性葡萄糖和尿素產物。對於附著來說，當在層粘連蛋白或III型或IV型膠原或成體基質I型膠原上培養時，人肝幹細胞引起細胞基質間的相互作用。在所研究的基質中，僅層粘連蛋白上的附著力最小。另外，層粘連蛋白促進少量附著細胞快速凋亡，所以除層粘連蛋白外，其他所有基質底層上培養的細胞生存時間超過10天。值得注意的是，成熟實質細胞的附著、生存和發揮功能需要有纖連蛋白存在。接著觀察形成的培養物幾何形狀。層粘連蛋白和纖連蛋白誘導形成3D橢球狀聚集體，而其他基層誘導形成單層細胞。另外觀察到覆在層粘連蛋白、in型膠原和iv型膠原上的細胞出現克隆原擴增，而在I型膠原和纖連蛋白上分別觀察到形成集落或無生長。III型膠原使分裂率約小於24小時，而接種在I型膠原上的細胞生長緩慢，然後進入生長停滯期，之後保持細胞活力和功能。還對白蛋白(ALB)、細胞角蛋白(CK19)、a-胎蛋白(AFP)、E-鈣粘著蛋白(E-CAD)、上皮細胞粘附分子(EpCAM)、神經細胞粘附分子(NCAM)和細胞角蛋白8和18(CK8禾tl18)的免疫組織化學應答做了比較。最主要和活躍的應答表現為NCAM(+)、EpCAM(++)、ALB(+)禾卩CK8和CK18(+)。有趣的是，CK19由層粘連蛋白、III型膠原和IV型膠原上培養的肝細胞強表達，但覆蓋在I型膠原和纖連蛋白上的細胞則不表達，表現為陰性。這一發現暗示，早期的雙潛能(bipotent)活性受到成熟組織中富含的基質組分的世系限制。而且，膠原I上培養的細胞的高AFP和ALB活動說明實質細胞對定向肝祖細胞進行世系限制，葡萄糖和尿素產物的強表達數據證實了這一發現。接著通過一項為期31天的定時研究，從直接覆蓋在TCP表面的肝祖細胞轉向人成肝細胞和肝幹細胞及相關間充質細胞搭檔的形態學特徵。第0天，肝細胞均勻分布在TCP表面上。最初的成肝細胞(h)群以橢球狀團塊形式存在，含有3-8個成肝細胞(i)，但也發現存在單個細胞(T)，如圖4A中20X顯微圖片所示。這張圖中，成肝細胞的平均直徑確定為約10-12|im，而直徑小於約10iam的小一些的細胞被認為是間充質細胞、殘餘的RBCs或肝幹細胞。細胞培養物沒有匯集到一起，而是形成多個各不相同的橢球狀聚集體，附著在表面上。培養到第5天，殘餘的RBCs脫離TCP表面，發生死亡。剩下的細胞群中大多數為成肝細胞和各種不同的間充質細胞(mes)，它們穩定下來，形成各自如圖4B所示的形態。這一穩定過程促使成肝細胞(h)培養物匯集到一起，證明成肝細胞群被鋪展開，開始發生細胞-細胞接觸。而且，成肝細胞保留了良好的細胞差異，具有清晰的膜輪廓和平滑的細胞質特徵。另外，成肝細胞和間充質細胞類型之間的共培養相互作用有限，它們之間的共同邊界較少而且離散。培養到第15天(圖4C)，成肝細胞具有"顆粒"狀細胞膜和細胞質特徵，符合衰退細胞的特徵。另外，成肝細胞與間充質細胞之間的比例達到相等，這暗示隨著成肝細胞的消除，非實質細胞正佔據著更大的表面區域。這一發現與"成纖細胞過生長"的典型現象類似，甚至培養基中未添加血清亦是如此。這些變化說明TCP培養條件有利於間充質細胞擴增，而對成肝細胞增殖和生存不利。的確，第31天，由於間充質細胞完全覆蓋了培養表面，所以成肝細胞要麼死亡，要麼重新組織，形成腳手架(scaffolding),如圖4D中20X顯微圖片所示。接下來比較僅在TCP上培養和在FP或三明治式I型膠原凝膠上培養的人肝祖細胞。第10天的培養狀況如圖5所示。就圖4A所示的"TCP上細胞"的培養對照來說，成肝細胞(h)顯現出顆粒狀細胞質特徵，沒有明顯的細胞邊界。另外，間充質細胞(mcs)(大多為內皮和基質)環繞在成肝細胞集落周圍。成肝細胞在塑料上的外觀與同時在膠原I型(FP)上培養(圖5B)的成肝細胞的外觀截然不同。後一成肝細胞顯現出確定的細胞邊界和顆粒狀細胞質——穩定成肝細胞的特徵。另外，間充質細胞顯現出有限的增殖，但也保留了明顯的細胞邊界特徵。使用圖4C所示三明治式設計培養的成肝細胞證實了所引起的細胞-細胞接觸、確定的細胞邊界，以及肝細胞和膽囊功能的雙表達(從對白蛋白(紅色)和CK19(綠色)表達進行的免疫染色中得到證實)。這些結果說明該祖細胞群中雙潛能的穩定性(stabilizationofbipotency)。尿素由成熟肝細胞特異產生。所以，可以用尿素表達來指示組織特異性基因表達和分化的顯著程度。因此，為了研究未成熟肝細胞的分化程度與體外基質蛋白質的函數關係，在培養若干小時後，確定培養基中的尿素濃度。圖6顯示了在胚胎和胎兒肝組織中主要的細胞外基質上培養的成肝細胞。這些體內基質的一部分包括III型膠原(■)、IV型膠原(參)、層粘連蛋白(〇)和膠原IV-層粘連蛋白混合物(▽)，相對於TCP對照(▼)，對這些基質進行分析和比較。為進行尿素分析，對成肝細胞監控l-5天，其標準化的尿素結果標於縱軸上。總體上，TCP上的對照細胞(▼)在整個研究期間的活力較差——最大和最小尿素濃度為5.5X10—6禾卩1.5X10—6mg/dL。更具體一點說，第1天，接種到"膠原IV"或"膠原IV和層粘連蛋白"上的成肝細胞達到9.5Xl(^mg/dL的尿素水平時，立刻觀察到區別；所有試驗的其他培養產生的尿素水平接近5.3Xl(T6mg/dL——或在高度活躍的和固定附著的成肝細胞之間有56%的偏差。除了接種在"膠原IV和層粘連蛋白"上的成肝細胞顯現出尿素功能有輕微下降的跡象外，第1天和第2天的結果之間沒有注意到有變化。但到了第3天，IV型膠原(參)培養物顯露出最佳的尿素功能活性，其達到1.2X10—5mg/dL，而其他培養物表達的尿素水平量低33%。到第5天，所有尿素水平併入2X10—6mg/dL的最小尿素表達水平，這暗示培養基中氨被耗盡，因為尿素表達需要氨因子的參與。尿素產量用尿素濃度/細胞表示(圖6B)。這些圖表示經過24小時以後的尿素濃度，在所做的標記中，實心黑圈數據點表示TCP上的成肝細胞(對照)，實心白圈(〇)數據點表示來自接種在I型膠原(平板，FP)上的培養物中的成肝細胞，灰色三角形(A)數據點分別表示在I型膠原層間(三明治式設計)培養的成肝細胞。這樣，在第3-6天對培養物進行定時評估。如各系統所示，第3天尿素濃度水平較高，但在整個研究期間其水平卻在連續下降。還注意到，整個研究期間，對照中的尿素水平相對較低。在FP和三明治結構中培養的成肝細胞的活性類似，在第3天和第4天，分別為8.0Xl(T5mg/dL和5.0X10-6mg/dL。與培養塑料上的對照培養相比，這些值相當於活性提高了約80%。同樣，平板系統顯示，在第5、6天，成肝細胞活性較高。根據顯示結果，成肝細胞FP活性比三明治式活性高出約8%，比TCP培養高出約115%。使用另外兩項試驗比較接種在各種不同基質上的細胞的功能活性。圖7分別繪出了第3天的葡萄糖和氨產量，該圖表示的是尿素日活性最高(圖6)的時間。圖7A中葡萄糖比較結果顯示，TCP培養對照所產生的葡萄糖水平為1.5X10—3mg/dL，用黑色實心框(■)表示，膠原I型FP培養產生的葡萄糖水平為1.63Xl(T3mg/dL，用白色實心框(□)表示，三明治式膠原I型培養產生的葡萄糖水平為2.6X10—3mg/dL，用實心灰色框表示。三明治式和TCP或FP培養之間的比較結果顯示，三明治式培養中的葡萄糖水平比其他細胞系統反應高出約64%。圖7B顯示，TCP培養中積聚的氨濃度為4.5Xl(T3mmol/L，FP系統中為2.8X10-3mmol/L，三明治式膠原系統為2.6X10—3mmol/L。FP和三明治式培養中氨水平下降，對照中氨水平約多出60%。如圖8所示，成肝細胞展現出形態變化，其變化是由其基質的幾何學控制的。圖8A1、8B1和8C1顯示的是培養到第10天的低倍圖像和整個表面特徵。圖8A2、8B2禾Q8C2通過相同培養物的高倍圖像顯現出詳細的形態學差異。圖8A1中，平皿表面先鋪上6.25mg/cn^膠原III，然後接種胎兒肝細胞。第10天，大量相互連接的組織塊和粘著的凝膠狀基質形成。另外，這一培養顯現出新近形成但隨機散布的脫細胞圓形亞群(subdivision)。為進行更詳細的圖像分析，圖8A2的顯微圖片顯示了一部分圖8A1的放大圖。這一放大顯現出密集圖樣中的人成肝細胞網絡。為比較這種細胞環境作用，將肝細胞母液接種到覆蓋有0.52mg/cmS層粘連蛋白的平皿表面上培養，如8B1和8B2所示。圖8B1中，大量分段的"白色斑點"散布在整個接種表面。這些聚集體在圖8B2中確認為緊密的橢球狀聚集體，其中橢球體伸長至與表面接觸。由於橢球體生長以及移動培養基的力引起大的橢球體擺動，所以許多表面附著鍵斷裂，細胞從培養物中被洗脫。但是，橢球體有可能移植到膠原I和膠原in基質上，再次使細胞附著和進一步鋪展開。為進行細胞-基質作用的第三次比較，將同樣的肝細胞置於預先分別鋪有6.25和0.52mg/cm1交原III-層粘連蛋白的平皿表面上培養。如圖8C1所示，使用白色背景，整個培養結果顯現出大量相互連接的組織團。另外，還顯現出了不含組織和基質組分的非均質脫細胞區域。同樣，圖8C2顯現出有活性並且穩定的共同培養的成肝細胞和非實質細胞。大多數細胞是成肝細胞，它們呈"圓石塊"狀排列。另外觀察到實質細胞和非實質細胞搭檔之間的一些邊界的相互作用。使用由胚胎組織中富含的基質(如層粘連蛋白和膠原ni和IV)製備的培養基，誘導成肝細胞的特定形態和功能變化，同時還進行肝幹細胞(HSC)的選擇(前體到成肝細胞)。圖9顯示了分別接種在TCP、層粘連蛋白、膠原III和膠原IV表面上、培養了3-10天的胎兒肝細胞的形態。將第3天的IOX圖像分別稱為TCP3、層粘連蛋白3、膠原III3和膠原IV3，而將第10天的4X圖像分別稱為TCPIO、層粘連蛋白10、膠原III10和膠原IV10。第3天對照TCP3集落顯現出大量成肝細胞(h)和少量非實質細胞(np)。相對來說，層粘連蛋白上的第3天培養物主要由成肝細胞組成，但附著的細胞減少，鋪展開的細胞增多。相比而言，膠原III上的細胞選擇出肝幹細胞。可以看到肝幹細胞集落是緊密聚集在一起的細胞，形態均一，倍增時間是1.2天。這些細胞具有HSC特異性抗原(如EpCAM+、NCAM+、白蛋白+、AFP-、CK19+、CK8+禾卩18+)的特徵表達。另外，HSC集落細胞的特徵直徑為7-9mm，其中細胞核佔據了大部分細胞質。集落細胞在大約第3天發生實質化並且仍然被成肝細胞包圍。接種在膠原IV上的肝細胞也在整個培養面展現出許多成肝細胞，同時兩個小HSC集落開始形成。第10天拍攝第IO天結果的顯微照片，放大4X，以便使某些HSC集落整體被攝入照片內。TCP10對照培養中，小HSC集落形成並且仍然被大量成肝細胞包圍。這一小集落獲得清晰的中間凸起、外部厚實的脊。層粘連蛋白IO培養中，成肝細胞聚集成小的緊密成團的聚集體，在小直徑集落內形成具有球形排列的三維結構和厚的組織層。膠原III10培養物中含有大量"平坦並伸展開"的HSC集落，維持緊密聚集的細胞-細胞相互作用，表面上排除其他類型細胞的存在。在所示顯微照片中，HSC增殖集落之間沒有見到成肝細胞。最後，膠原IVIO培養物同時含有成肝細胞和新出現的HSC集落，該集落具有明顯的集落邊界和高出來的邊界脊。對HSC集落進一步詳細研究，如圖IO所示。這些圖中，附著基質為膠原IV，鋪皿濃度為4.15嗎/cm2，在第12天給肝幹細胞集落拍照。如圖所示，在這一集落附近或顯微照片的其他位置沒有觀察到其他細胞表型。所以，這一環境可以認為是對特定類型細胞的選擇。在得到如圖10A所示的IOX顯微照片之前的第4-11天，用肉眼監控HSC集落。這一時段中，緊密的HSCs從少於約IO個細胞的小聚集體開始，增殖成更大的集落，其中含有成百上千的細胞，見圖10A中標出的突出圓形區域內所示。但在第12天的8小時時段內，增殖細胞在HSC集落邊緣發生兩個顯著的"爆發"或過度生長，導致細胞具有成肝細胞特有的抗原和形態特徵。這些過度生長清楚可辨，是因為其分化細胞鬆散聚集，具有較大直徑和明顯的溝(膽小管)。圖10B所示為20X顯微照片，聚焦中心在該過度生長的細胞上方。這張圖中，過度生長的肝袓細胞的直徑為15-21nm，細胞質與細胞核的比例增加，具有單一細胞核，發生細胞-細胞接觸，仍有確定的細胞邊界和細胞外基質間隔。另外，從HSC集落髮生的分化細胞的形態追蹤顯示，在擴增開始的頭8小時期間，約有1200個新細胞。門靜脈周區內和肝幹細胞小生境中的基質組分與所發現的成熟實質細胞相關性基質組分截然不同，並且引起人肝幹/祖細胞的純化亞群發生不同的生物反應。這些差異有可能提供改變細胞反應和激活動態表達的各種不同信號。明確不同種類的細胞外基質組分在體內和體外誘導細胞活性的機理，可以在體外重現微環境以擴增和分化HSC群，供病變組織的更換或再群體化(r印opulation)。這樣，通過移植細胞，可以避免將整個器官一起更換。而且，可以植入帶有包含在合適細胞外基質和可溶性信號傳導環境中的肝祖細胞的體外裝置如生物反應器，這些細胞生活在裝置亞區室中，具有活組織結構。這樣，生物人工裝置可以被用於藥物學研究、疫苗開發，並且可用作器官衰竭和器官移植之間的橋梁。的確，這些研究所得結果暗示，使用這些細胞可以是一種改善細胞起源限制的方法，目前這些限制阻礙了細胞治療和生物反應器裝置介導的治療選擇。雖然結合具體實施例對本發明加以描述，但應當理解，本發明能夠被進一步改動，本申請欲涵蓋依照本發明原理作出的任何變化、用途或變更，其包括那些脫離本發明公開內容，但屬於本發明所屬領域內的已知或公知常識，並且可以應用於權利要求範圍所述的必要特徵的內容。權利要求1.一種使肝祖細胞在體外增殖的方法，其包括(a)提供分離出的肝祖細胞，以及(b)在從肝臟幹細胞區室中發現的一種或多種細胞外基質組分上培養分離出的肝祖細胞。2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述從肝臟幹細胞區室中發現的細胞外基質組分選自ni型膠原、iv型膠原、層粘連蛋白、透明質素或其組合。3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述從肝臟幹細胞區室中發現的細胞外基質組分是III型膠原或IV型膠原或其組合。4.根據權利要求2所述的方法，其中，所述肝祖細胞進一步在選自m型膠原、基粘附分子、蛋白聚糖、糖胺聚糖硫酸乙醯肝素、彈性蛋白或其組合的細胞外基質組分上培養。5.根據權利要求4所述的方法，其中，所述基粘附分子是纖連蛋白。6.根據權利要求4所述的方法，其中，所述蛋白聚糖是硫酸乙醯肝素蛋白聚糖、硫酸軟骨素蛋白聚糖或其組合。7.根據權利要求4所述的方法，其中，所述糖胺聚糖是硫酸乙醯肝素、肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質素或其組合。8.根據權利要求2所述的方法，其中，所述細胞外基質組分是III型膠原和層粘連蛋白。9.根據權利要求1所述的方法，其中，所述分離出的肝祖細胞是分離出的肝幹細胞、分離出的成肝細胞、定向肝祖細胞或其組合。10.根據權利要求9所述的方法，其中，所述分離出的肝祖細胞是分離出的肝幹細胞。11.根據權利要求1所述的方法，其中，在飼養細胞存在條件下進一步培養所述肝祖細胞。12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述飼養細胞是胚胎或胎兒的細胞。13.根據權利要求12所述的方法，其中，所述飼養細胞是成血管細胞或肝星狀前體細胞。14.根據權利要求11所述的方法，其中，所述飼養細胞來自任何哺乳動物的組織。15.根據權利要求11所述的方法，其中，所述詞養細胞來自與所述肝祖細胞相同的細胞類群。16.根據權利要求11所述的方法，其中，所述詞養細胞是鼠源細胞。17.根據權利要求16所述的方法，其中，所述飼養細胞是STO飼養細胞。18.根據權利要求1所述的方法，其進一步包括不含血清的培養基。19.根據權利要求1所述的方法，其中，所述肝祖細胞從成體肝臟中獲得。20.根據權利要求19所述的方法，其中，所述成體肝臟是成人的肝臟。21.根據權利要求2所述的方法，其中，所述層粘連蛋白的濃度約為0.1隱10jig/cm2。22.根據權利要求21所述的方法，其中，所述層粘連蛋白的濃度約為0.5-5嗎/cm2。23.根據權利要求22所述的方法，其中，所述層粘連蛋白的濃度約為0.5pg/cm2。24.根據權利要求22所述的方法，其中，所述層粘連蛋白的濃度約為lpg/cm2。25.根據權利要求2所述的方法，其中，所述III型或IV型膠原的濃度各約為0.1-15fig/cm2。26.根據權利要求25所述的方法，其中，所述m型或IV型膠原的濃度各約為0.5-8嗎/cm2。27.根據權利要求25所述的方法，其中，所述m型或IV型膠原的濃度約為l-7pg/cm2。28.—種使肝祖細胞增殖的方法，其包括(a)提供含有從肝臟的幹細胞區室中發現的第一細胞外基質組分的第一層；(b)提供含有從肝臟的幹細胞區室中發現的第二細胞外基質組分的第二層；以及(c)在上述第一層和第二層之間培養分離出的肝祖細胞。29.—種用於肝祖細胞增殖的器皿，其包括(a)器皿，以及(b)含有在肝臟的幹細胞區室中發現的至少一種細胞外基質組分的非可溶性材料，其中，該非可溶性材料基本上覆蓋上述器皿的至少一個表面。30.根據權利要求29所述的器皿，其中，所述器皿是組織培養板、生物反應器、實驗室培養池或實驗室晶片。全文摘要本發明提供了一種使肝祖細胞在從肝臟的幹細胞區室或小生境中發現的一種或多種細胞外基質組分上或其內部體外增殖的方法。本發明還提供了用於祖細胞增殖的器皿，其包括培養皿、生物反應器或實驗室晶片。文檔編號C12N5/074GK101384705SQ200680050921公開日2009年3月11日申請日期2006年11月15日優先權日2005年11月16日發明者蘭德爾·E·麥克萊蘭,洛拉·M·裡德申請人:北卡羅來納大學教堂山分校