一種綠色製備免表面修飾的磁性粒子增強型生物分子檢測方法
2023-04-23 10:20:01 1
1.本發明屬於生物分子檢測方法技術領域，具體涉及一種綠色製備免表面修飾的磁性粒子增強型生物分子檢測方法。
背景技術：
2.當前，惡性腫瘤、愛滋病等惡性疾病嚴重危害人類健康與生存。這些惡性疾病的早發現和早治療是降低患者死亡率和提高生存質量的最有效方法之一。生物標記物檢測是相關疾病早發現的重要手段之一，因此生物標記物等生物分子的超靈敏檢測成為臨床診斷和治療的迫切要求。但惡性疾病的生物標記物在血液中的濃度一般都比較低，甚至達到阿克級(ag/ml)的水平。因此，如何能夠超靈敏地檢測低濃度的生物分子對疾病的早期快速準確診斷和治療起著至關重要的作用。
3.酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,elisa)是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種檢測抗體或抗原的一種敏感性很高的檢測技術。
4.為了能夠檢測到更低濃度的生物分子，可以用增強elisa螢光產物的螢光信號強度方法來增加檢測靈敏度。微納米粒子和固相載體表面相比具有較大的比表面積可以直接或間接地吸附更多的待測生物分子，從而起到富集待測生物分子的作用，提高檢測靈敏度。
5.通過對現有技術的檢索發現，wang,yuan-kai等在food control，2014，40，41-45中利用磁珠elisa可以檢測到0.24ng/ml的生物分子fumonisin b1，和傳統的elisa相比，縮短了檢測時間，提高了檢測靈敏度，證明了磁珠elisa在增強檢測靈敏度的可行性。但目前磁珠elisa存在兩個主要問題：(1)傳統的磁珠製備過程中會用到一些強腐蝕性化學試劑，如羥胺、硼氫化物，有機溶劑等，而且後期通常需要經過表面修飾來降低其生物學毒性，因此這些有毒試劑會造成環境汙染嚴重，生產成本較高。(2)傳統方法製備的磁珠表面缺少氨基、羧基等活性基團，將其應用到elisa中還需要進行生物化學表面修飾。
6.基於此，有必要發明一種綠色製備免表面修飾的磁性粒子來增強型生物分子檢測方法，以解決現有傳統elisa生物分子檢測方法靈敏度低的問題和現有磁珠elisa生物分子檢測方中傳統方法製備的磁珠表面因生物學毒性和缺少氨基、羧基等活性基團需要進一步生物化學表面修飾的問題。
技術實現要素：
7.本發明為了解決現有磁珠elisa生物分子檢測方中傳統方法製備的磁珠表面因生物學毒性和缺少氨基、羧基等活性基團需要進一步生物化學表面修飾的問題，提供了一種綠色製備免表面修飾的磁性粒子來增強型生物分子檢測方法。
8.本發明採用如下技術方案：
9.一種綠色製備免表面修飾的磁性粒子增強型生物分子檢測方法，包括如下步驟：
10.步驟s1：將金屬鐵鹽和金屬銅鹽加入葉綠體溶液中，攪拌至混合均勻；
11.步驟s2：加入naoh溶液，將溶液ph值調至8-10，攪拌反應；
12.步驟s3：將溶液放入離心管中，利用離心機進行離心處理後，收集沉澱；
13.步驟s4：將超純水注入離心管中對沉澱進行洗滌後，利用離心機進行離心處理後，收集沉澱，這一洗滌過程反覆1-5次；
14.步驟s5：在真空烘箱中進行沉澱煅燒得到粉末狀鐵酸銅粒子；
15.步驟s6：將鐵酸銅粒子放入含有超純水的離心管中，加入待檢測生物分子對應的捕獲抗體，攪拌至鐵酸銅粒子和待檢測生物分子對應的捕獲抗體充分反應；
16.步驟s7：利用外加磁體產生的磁場固定鐵酸銅粒子，並用洗滌液洗滌掉未被鐵酸銅粒子捕獲的捕獲抗體；
17.步驟s8：加入封閉液，進行孵化；
18.步驟s9：利用外加磁體產生的磁場固定鐵酸銅粒子，用洗滌液進行洗滌；
19.步驟s10：加入待檢測生物分子，等待至捕獲抗體和待檢測生物分子充分反應；
20.步驟s11：利用外加磁體產生的磁場固定鐵酸銅粒子，用洗滌液洗滌掉未反應的待檢測生物分子；
21.步驟s12：加入檢測抗體，等待至待檢測生物分子和檢測抗體充分反應；
22.步驟s13：利用外加磁體產生的磁場固定鐵酸銅粒子，用洗滌液洗滌掉未反應的檢測抗體；
23.步驟s14：加入標有鹼性磷酸酶的鏈黴親和素，等待至檢測抗體和鏈黴親和素相交聯；
24.步驟s15：利用外加磁體產生的磁場固定鐵酸銅粒子，用洗滌液洗滌掉未交聯的第二抗體；
25.步驟s16：加入化學螢光底物，等待至鹼性磷酸酶和化學螢光底物進行反應生成螢光產物；
26.步驟s17：加入終止液，檢測溶液的吸光度以計算待測生物分子濃度。
27.進一步地，所述金屬鐵鹽包括氯化鐵或硝酸鐵中的一種，所述金屬銅鹽包括氯化銅或硝酸銅中的一種，金屬鐵鹽和金屬銅鹽的物質的量之比為2:1。
28.進一步地，步驟s2中所述攪拌反應的時間為12-24h。
29.進一步地，所述離心處理的轉速為8000-12000rpm/min，離心處理的時間為10-30min。
30.進一步地，步驟s5中所述沉澱煅燒的溫度為200℃，沉澱煅燒的時間為8-12h。
31.進一步地，步驟s8中所述孵化的溫度為37℃，孵化的時間為1-2h。
32.進一步地，所述含有鐵酸銅粒子的溶液和待檢測生物分子對應的捕獲抗體反應的溫度為37℃，反應的時間為10-30min。
33.進一步地，所述的捕獲抗體和待檢測生物分子反應的溫度為37℃，反應的時間為10-30min。
34.進一步地，所述的待檢測生物分子和檢測抗體反應的溫度為37℃，反應的時間為10-30min。
35.進一步地，所述的檢測抗體和鏈黴親和素相交聯的溫度為37℃，相交聯的時間為
10-30min。
36.進一步地，所述的鹼性磷酸酶和化學螢光底物進行反應生成螢光產物的溫度為37℃，時間為10-30min。
37.本發明的有益效果如下：
38.與現有傳統elisa生物分子檢測方法相比，本發明所述的綠色製備免表面修飾的磁性粒子來增強型生物分子檢測方法具有以下優點：一、磁珠具有更大的比表面積，能夠吸附更多的生物分子，從而提高檢測靈敏度；二、磁珠能夠在液體中自由運動，能夠吸附更多的生物分子，從而提高檢測靈敏度；三、磁珠可以通過外加磁珠進行操縱，有利於檢測。
39.與現有磁珠elisa生物分子檢測方法相比，本發明所述的綠色製備免表面修飾的磁性粒子來增強型生物分子檢測方法具有以下優點：一、利用葉綠體製備磁珠避免了傳統的磁珠製備過程中會用到一些強腐蝕性化學試劑，從而避免了磁珠表面生物學毒性和製備過程造成的環境汙染；二、利用葉綠體製備磁珠的表面具有氨基、羧基等活性基團，可以直接應用到elisa檢測中，避免了生物化學表面修飾。
40.本發明有效解決了現有傳統elisa生物分子檢測方法靈敏度低的問題和現有磁珠elisa生物分子檢測方中傳統方法製備的磁珠表面因生物學毒性和缺少氨基、羧基等活性基團需要進一步生物化學表面修飾的問題。
具體實施方式
41.下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
42.實施例
43.綠色製備免表面修飾的磁性粒子來增強型生物分子檢測方法，以人白介素6(il-6)生物分子檢測為例，包括如下步驟：
44.步驟s1：將金屬鐵鹽和金屬銅鹽加入葉綠體溶液中，攪拌至混合均勻；
45.步驟s2：加入naoh溶液，將溶液ph值調至8-10，攪拌反應；
46.步驟s3：將溶液放入離心管中，利用離心機進行離心處理後，收集沉澱；
47.步驟s4：將超純水注入離心管中對沉澱進行洗滌後，利用離心機進行離心處理後，收集沉澱，這一洗滌過程反覆1-5次；
48.步驟s5：在真空烘箱中進行沉澱煅燒得到粉末狀鐵酸銅粒子；
49.步驟s6：將鐵酸銅粒子放入含有超純水的離心管中，加入待檢測生物分子對應的捕獲抗體小鼠抗人il-6捕獲抗體，攪拌至鐵酸銅粒子和待檢測生物分子對應的捕獲抗體小鼠抗人il-6捕獲抗體充分反應；
50.步驟s7：利用外加磁體產生的磁場固定鐵酸銅粒子，並用洗滌液洗滌掉未被鐵酸銅粒子捕獲的捕獲抗體小鼠抗人il-6捕獲抗體；
51.步驟s8：加入封閉液質量分數為1％的牛血清白蛋白pbs溶液，進行孵化。
52.步驟s9：利用外加磁體產生的磁場固定鐵酸銅粒子，用洗滌液進行洗滌。
53.步驟s10：加入待檢測生物分子il-6，等待至捕獲抗體小鼠抗人il-6捕獲抗體和待檢測生物分子il-6充分反應；
54.步驟s11：利用外加磁體產生的磁場固定鐵酸銅粒子，用洗滌液洗滌掉未反應的待檢測生物分子il-6；
55.步驟s12：加入檢測抗體生物素化山羊抗人il-6檢測抗體，等待至待檢測生物分子il-6和檢測抗體生物素化山羊抗人il-6檢測抗體充分反應；
56.步驟s13：利用外加磁體產生的磁場固定鐵酸銅粒子，用洗滌液洗滌掉未反應的檢測抗體生物素化山羊抗人il-6檢測抗體；
57.步驟s14：加入標有鹼性磷酸酶的鏈黴親和素，等待至檢測抗體生物素化山羊抗人il-6檢測抗體和鏈黴親和素相交聯；
58.步驟s15：利用外加磁體產生的磁場固定鐵酸銅粒子，用洗滌液洗滌掉未交聯的鏈黴親和素；
59.步驟s16：加入化學螢光底物對硝基苯磷酸二鈉鹽，等待至鹼性磷酸酶和化學螢光底物對硝基苯磷酸二鈉鹽進行反應生成螢光產物；
60.步驟s17：加入終止液naoh溶液，檢測溶液的吸光度以計算待檢測生物分子il-6濃度。
61.所述的金屬鐵鹽為六水氯化鐵，物質的量為0.0001mol。
62.所述的金屬銅鹽為二水合氯化銅，物質的量為0.00005mol。
63.所述的葉綠體溶液是用0.2g植物綠色葉子提取的葉綠體稀釋成的10ml溶液。
64.所述的攪拌反應的時間為12h。
65.所述的離心處理的轉速為10000rpm/min。
66.所述的離心處理的時間為20min。
67.所述的沉澱煅燒的溫度為200℃。
68.所述的沉澱煅燒的時間為10h。
69.所述的含有鐵酸銅粒子的溶液和待檢測生物分子il-6對應的捕獲抗體小鼠抗人il-6捕獲抗體的反應的溫度為37℃。
70.所述的孵化的溫度為37℃。
71.所述的孵化的時間為1h。
72.所述的含有鐵酸銅粒子的溶液和待檢測生物分子il-6對應的捕獲抗體小鼠抗人il-6捕獲抗體的反應的時間為20min。
73.所述的捕獲抗體小鼠抗人il-6捕獲抗體和待檢測生物分子il-6反應的溫度為37℃。
74.所述的捕獲抗體小鼠抗人il-6捕獲抗體和待檢測生物分子il-6反應的時間為20min。
75.所述的待檢測生物分子il-6和檢測抗體生物素化山羊抗人il-6檢測抗體反應的溫度37℃。
76.所述的待檢測生物分子il-6和檢測抗體生物素化山羊抗人il-6檢測抗體反應的時間為20min。
77.所述的檢測抗體生物素化山羊抗人il-6檢測抗體和鏈黴親和素相交聯的溫度為37℃。
78.所述的檢測抗體生物素化山羊抗人il-6檢測抗體和鏈黴親和素相交聯的時間為
20min。
79.所述的鹼性磷酸酶和化學螢光底物對硝基苯磷酸二鈉鹽，進行反應生成螢光產物的溫度為37℃。
80.所述的鹼性磷酸酶和化學螢光底物對硝基苯磷酸二鈉鹽進行反應生成螢光產物的時間為20min。