親和色譜用填充劑的製作方法

2023-04-23 05:48:16 1

專利名稱：親和色譜用填充劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及親和色譜用填充劑。尤其涉及含有蛋白質的動態結合容量高且壓力特性優異的多孔粒子的、對蛋白質純化有用的親和色譜用填充劑。
背景技術：
親和色譜法在包括單克隆抗體的蛋白質的研究、開發和製造中承擔著重要的作用。親和色譜用填充劑一般包含具有選擇性地與靶分子結合的配體的固相載體。就親和色譜法而言，固相載體上的配體對於靶分子具有高選擇性，因此，與離子色譜法、凝膠過濾色譜法、反相液體色譜法等其它色譜法相比，可以進行收率優異以及高速且經濟的純化。親和色譜用填充劑的固相載體主要使用瓊脂糖粒子(專利文獻1、2)。瓊脂糖粒子由於其高親水性，因此配體的活性高，對於靶分子的動態結合容量高。
作為其它親和色譜用填充劑的固相載體，有時使用由苯乙烯-二乙烯基苯的聚合物形成的多孔粒子(專利文獻3、4)。由苯乙烯-二乙烯基苯這樣的乙烯基單體的聚合物形成的多孔粒子一般來說彈性模量高，壓力特性優異。另外，為了兼顧親和色譜用填充劑中的高動態結合容量和壓力特性，也提出了將瓊脂糖這樣的糖鏈結合於由乙烯基單體的聚合物形成的多孔粒子的細孔而得到的粒子(專利文獻5)。另一方面，雖然有將由含有羥基的交聯性乙烯基單體的聚合物形成的多孔粒子用於色譜法的例子，但它們均僅適合於以分析為目的的凝膠過濾色譜法、反相液體色譜法(專利文獻6 8)。專利文獻I :日本特表2008-523140號公報專利文獻2 日本特表2009-522580號公報專利文獻3 日本特開平8-278299號公報專利文獻4 :日本特表平10-501173號公報專利文獻5 :日本特開2008-232764號公報專利文獻6 :日本特開2002-239380號公報專利文獻7 :日本特開2003-176363號公報專利文獻8 :日本特開2000-187028號公報

發明內容
但是，瓊脂糖粒子一般彈性模量低，因此具有在高速流過介質時柱的壓力變高這個缺點，從而壓力特性較差。另外，瓊脂糖粒子一般是從天然的海草經過長的複雜工序而製造成的，因此具有難以獲得恆定質量的瓊脂糖粒子這個缺點。另一方面，由苯乙烯-二乙烯基苯這樣的乙烯基單體的聚合物形成的多孔粒子的親水性低，因此，配體的活性低，從而具有對靶分子的動態結合容量低這個缺點。另外，將瓊脂糖這樣的糖鏈結合於由乙烯基單體的聚合物形成的多孔粒子的細孔而得到的粒子與瓊脂糖粒子同樣地是經過長的複雜工序而製造成的，因此，具有可以作為親和色譜使用的質量的粒子昂貴、或難以獲得恆定質量的粒子的缺點。進而，在現有的凝膠過濾色譜法、反相液體色譜法中使用的、由含有羥基的交聯性乙烯基單體的聚合物形成的多孔粒子不能達到兼顧作為親和色譜用填充劑的高動態結合容量和壓力特性。於是，本發明的目的在於提供蛋白質的動態結合容量高、壓力特性也優異、對蛋白質純化有用的親和色譜用填充劑。本發明的一個方式所涉及的親和色譜用填充劑其特徵在於，具有由乙烯基單體的聚合物形成的多孔粒子，所述乙烯基單體包括含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體和含有環氧基的非交聯性乙烯基單體、或者含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體，結合於上述多孔粒子的配體，以及
開環環氧基。在上述親和色譜用填充劑中，上述配體可以是含有至少I個蛋白A、蛋白A的免疫球蛋白結合域、或者其變異體的蛋白質。在上述親和色譜用填充劑中，上述乙烯基單體可以由以下構成(X-I)含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體20 90質量份、(X-2)不含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體O 40質量份、(M-I)含有環氧基的非交聯性乙烯基單體I 40質量份、以及(M-2)不含有環氧基的非交聯性乙烯基單體O 70質量份(其中，(X-1)、(X-2)、(M-1WP(M_2)的合計是100 質量份)。在上述親和色譜用填充劑中，上述開環環氧基可以利用硫甘油使上述聚合物所含有的環氧基開環而獲得。在上述親和色譜用填充劑中，上述多孔粒子可以將上述乙烯基單體100質量份與以(P-ι)為必需成分的水系混合物懸浮聚合而獲得，所述(P-I)是選自碳原子數為7 14的直鏈狀、支鏈狀以及環狀的醇、醚、醛、酮、酯、碳原子數為8 10的烷基苯中的至少I種的致孔劑(其中，致孔劑的合計量是100 400質量份，(P-I)在致孔劑的合計量100質量％中為10質量％以上)。在上述親和色譜用填充劑中，利用壓汞儀對相當於孔徑為10 5000nm範圍的細孔進行測定時上述多孔粒子的細孔容積可以是I. 00 I. 90ml/g。在上述親和色譜用填充劑中，上述多孔粒子的粒徑可以是35 ΙΟΟμπι。本發明的另一方式所涉及的離析免疫球蛋白的方法包括利用上述親和色譜用填充劑使免疫球蛋白吸附於上述填充劑的工序，以及使上述免疫球蛋白溶出的工序。本發明的另一方式所涉及的柱是填充有上述親和色譜用填充劑的親和色譜法用填充柱。利用本發明所涉及的親和色譜用填充劑，可以提供蛋白質的動態結合容量高、且壓力特性優異、對蛋白質純化有用的親和色譜用填充劑。


圖I是表示本發明的實施例I中製備的免疫球蛋白結合蛋白質(SP4Z)的胺基酸序列的圖。圖2是說明在表達載體(pETM-11)中插入的、編碼本發明的實施例I所涉及的免疫球蛋白結合蛋白質的DNA片段的構成的圖。圖3是表示本發明的實施例2中製備的免疫球蛋白結合蛋白質(SPATK)的胺基酸序列的圖。圖4是說明在表達載體(pETM-11)中插入的、編碼本發明的實施例2所涉及的免疫球蛋白結合蛋白質的DNA片段的構成的圖。
具體實施例方式下面，對於本發明的親和色譜用填充劑進行具體地說明。 I.親和色譜用填充劑本發明的親和色譜用填充劑具有由乙烯基單體的聚合物形成的多孔粒子，所述乙烯基單體包括含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體和含有環氧基的非交聯性乙烯基單體、或含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體，結合於上述多孔粒子的配體，以及開環環氧基。I. I.多孔粒子的構成構成本發明的親和色譜用填充劑的多孔粒子是由以含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體和含有環氧基的非交聯性乙烯基單體為必需成分的乙烯基單體的共聚物、或者僅以含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體為必需成分的乙烯基單體的均聚物形成的載體粒子。由於該聚合物所含有環氧基，因此，配體結合前的由該聚合物形成的多孔粒子含有環氧基。配體結合前的多孔粒子的環氧基含量是O. 05 4. Ommol/goI. I. I.含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體是在I分子中具有2個以上聚合性乙烯基(具有乙烯性不飽和鍵的基團)和I個以上羥基、且不具有環氧基的交聯性單體。通過使用含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體將多孔粒子親水化並控制成適合的彈性模量，可以獲得蛋白質的動態結合容量高、且壓力特性優異的親和色譜用填充劑。作為含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體，優選為脂肪族聚乙烯基單體，進一步優選為多元醇的(甲基)丙烯酸酯。作為含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體，具體地可以舉出甘油二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基乙烷二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷二(甲基)丙烯酸酯、丁三醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇五(甲基)丙烯酸酯、肌醇二(甲基)丙烯酸酯、肌醇三(甲基)丙烯酸酯、肌醇四(甲基)丙烯酸酯等。除此之外還可以舉出各種糖類2取代以上的(甲基)丙烯酸酯，例如還可以舉出葡萄糖二(甲基)丙烯酸酯、葡萄糖三(甲基)丙烯酸酯、葡萄糖四(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇二(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇三(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇四(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇五(甲基)丙烯酸酯等。還可以進一步舉出二氨基丙醇、三(羥甲基)氨基甲烷、葡糖胺等具有與多元氨基醇和(甲基)丙烯酸的脫水縮合反應物相同結構的含有羥基的交聯性乙烯基單體等。作為含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體，特別優選為甘油二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、肌醇三(甲基)丙烯酸酯，最優選為甘油二(甲基)丙烯酸酯。如果考慮耐鹼性，則優選甲基丙烯酸酯類、丙烯醯胺類、甲基丙烯醯胺類。考慮耐鹼性時，特別優選的含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體是甘油二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三甲基丙烯酸酯、肌醇三甲基丙烯酸酯，最優選的是甘油二甲基丙烯酸酯。I. I. 2.含有環氧基的非交聯性乙烯基單體含有環氧基的非交聯性乙烯基單體是在I分子中具有I個聚合性乙烯基和I個以上環氧基的非交聯性單體。含有環氧基的非交聯性乙烯基單體具有的環氧基的數量優選在I分子中為I 3個，更優選為I個。含有環氧基的非交聯性乙烯基單體是用於在多孔粒子的配體結合前導入合適量的環氧基的必需成分，所述多孔粒子由包含含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體和含有環氧基的非交聯性乙烯基單體的乙烯基單體的共聚物獲得。 作為含有環氧基的非交聯性乙烯基單體，可以在工業上容易地獲得在I分子中具有I個聚合性乙烯基和I個環氧基的非交聯性單體。作為這樣的含有環氧基的非交聯性乙烯基單體，例如可以舉出(甲基)丙烯酸縮水甘油酯、(甲基)丙烯酸4-羥基丁酯縮水甘油醚、(甲基)丙烯酸3，4-環氧環己基甲酯、α-(甲基)丙烯醯基-ω-縮水甘油基聚乙二醇等(甲基)丙烯酸酯類；乙烯基苄基縮水甘油醚等芳香族乙烯基化合物；烯丙基縮水甘油醚、3，4-環氧基-I- 丁烯、3，4-環氧基-3-甲基-I- 丁烯等，特別優選(甲基)丙烯酸縮水甘油酯、(甲基)丙烯酸4-羥基丁酯縮水甘油醚。除此之外，作為乙烯基單體，可以單獨使用含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體來代替含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體和含有環氧基的非交聯性乙烯基單體。作為含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體，例如可以例示季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯縮水甘油醚、肌醇二(甲基)丙烯酸酯縮水甘油醚、肌醇三(甲基)丙烯酸酯縮水甘油醚等。此外，可以將含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體、與上述含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體和含有環氧基的非交聯性乙烯基單體一起使用。I. I. 3.優選的乙烯基單體乙烯基單體優選由以下構成(X-I)含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體20 90質量份、(Χ-2)不含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體O 40質量份、(M-I)含有環氧基的非交聯性乙烯基單體I 40質量份、以及(Μ-2)不含有環氧基的非交聯性乙烯基單體O 70質量份(其中，(X-1)、(X-2)、(M-1WP(M_2)的合計是100 質量份)。(X-I)含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體的具體例、優選例是如在上述I. I. I.含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體中所述的內容。(X-I)優選為20 90質量份，更優選為25 85質量份，最優選為30 80質量份。如果(X_l)含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體為20質量份 90質量份，則蛋白質的動態結合容量優異。(X-2)不含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體是在I分子中具有2個以上聚合性乙烯基、不具有羥基和環氧基的交聯性單體。(X-2)不含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體補充(X-I)含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體而使用，並控制成合適的彈性模量，由此有時可以提高壓力特性。作為(X-2)不含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體，優選為芳香族聚乙烯基單體、脂肪族聚乙烯基單體，作為芳香族聚乙烯基單體，優選二乙烯基苯，作為脂肪族聚乙烯基單體，優選多元(甲基)丙烯酸酯化合物。作為多元(甲基)丙烯酸酯化合物，例如可以舉出乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，4-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，6-己二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯等，特別優選三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯。(X-2)不含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體優選為O 40質量份，更優選為O 20質量份。如果(X-2)超過40質量份,則有時蛋白質的動態結合量降低。(X-I)含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體與(X-2)不含有羥基和環氧 基的交聯性乙烯基單體有時作為混合物在工業上供給，在本發明的範圍內，也可以將它們直接使用。(M-I)含有環氧基的非交聯性乙烯基單體的具體例、優選例是如在上述I. I. 2.含有環氧基的非交聯性乙烯基單體中所述的內容。(M-I)含有環氧基的非交聯性乙烯基單體優選為I 40質量份，更優選為2 30質量份，最優選為3 15質量份。如果(M-I)含有環氧基的非交聯性乙烯基單體為I質量份 40質量份，則由得到的聚合物形成的多孔粒子所含有的環氧基含量為合適的量。作為(M-2)不含有環氧基的非交聯性乙烯基單體，優選親水性乙烯基單體，進一步優選含有羥基的非交聯性乙烯基單體。作為(M-2)不含有環氧基的非交聯性乙烯基單體，在使用親水性單體時，補償親和色譜用填充劑的親水性，從而有時能夠表現靶分子的高動態結合容量。在親水性乙烯基單體之中，作為不含有羥基的非交聯性親水性乙烯基單體，例如可以舉出二甲基丙烯醯胺、丙烯醯基嗎啉、(甲基)丙烯酸甲氧基乙酯、雙丙酮(甲基)丙烯醯胺、N-乙烯基-2-吡咯烷酮等。作為含有羥基的非交聯性乙烯基單體，例如可以舉出甘油單(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基乙烷單(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷單(甲基)丙烯酸酯、丁三醇單(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇單(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇單(甲基)丙烯酸酯、肌醇單(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羥基乙酯、羥乙基(甲基)丙烯醯胺等，優選甘油單甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸羥基乙酯、羥乙基丙烯醯胺、聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯，最優選甘油單甲基丙烯酸酯。(M-2)不含有環氧基的非交聯性乙烯基單體優選為O 70質量份，更優選為超過O質量份且40質量份以下。如果(M-2)超過70質量份，則有時壓力特性差。作為優選的乙烯基單體中合適的量比的具體例，可以舉出由(X-I)含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體25 85質量份、(X-2)不含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體O 20質量份、(M-I)含有環氧基的非交聯性乙烯基單體2 30質量份、以及(M-2)不含有環氧基的非交聯性乙烯基單體O 70質量份構成的乙烯基單體，或者由
(X-I)含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體30 80質量份、(X-2)不含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體O 20質量份、(M-I)含有環氧基的有非交聯性乙烯基單體3 15質量份、以及(M-2)不含有環氧基的非交聯性乙烯基單體超過O質量份且40質量份以下構成的乙烯基單體。其中，在任一乙烯基單體的具體例中，(X-1)、(X-2)、(M-1)和(M-2)的合計均是100質量份。I. I. 4.多孔粒子的製造多孔粒子可以通過公知的接種聚合、懸浮聚合等來製造。作為接種聚合法，也優選使用日本特公昭57-24369號公報記載的二階段溶脹聚合法。在聚合時，除了上述單體以 夕卜，將水、致孔劑作為必需成分，根據需要地使用聚合引發劑、高分子分散劑、表面活性劑、鹽、接種粒子、水溶性聚合抑制劑等。多孔粒子的製造中優選的聚合法是以上述乙烯基單體100質量份與(P-I)為必需成分的水系混合物的懸浮聚合法，所述(P-ι)是選自碳原子數為7 14的直鏈狀、支鏈狀以及環狀的醇、醚、醛、酮、酯、碳原子數為8 10的烷基苯中的至少I種的致孔劑。此時，可以進一步並用作為(P-2)的(P-I)以外的致孔劑。相對於100質量份單體，致孔劑的用量優選合計為100 400質量份。(P-ι)的用量優選在致孔劑的合計量100質量％中為10質量％以上。具體地例示(P-I)的致孔劑，作為醇，可以舉出I-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、4-庚醇、2，4-二甲基-3-戊醇、5-甲基-2-己醇、2-乙基-I-己醇、2-辛醇、3-辛醇、5-甲基-3-庚醇、I-壬醇、3，5，5-三甲基己醇；作為醚，可以舉出己基甲基醚、二丁基醚、桉樹腦；作為醒，可以舉出庚醛、辛醛、2-乙基-I-己醛、壬醛、3，5，5-三甲基己醛、I-癸醛、
十二烷醛；作為酮，可以舉出2-庚酮、3-庚酮、4-庚酮、2，4_ 二甲基_3_戊酮、4，4_ 二甲基-2-戊酮、5-甲基-2-己酮、2-辛酮、3-辛酮、5-甲基-3-庚酮、2，6-二甲基-4-庚酮、2-壬酮、3-壬酮、4-壬酮、3，3，5-三甲基環己酮、2-癸酮、3-癸酮、2- i^一烷酮、4-叔戊基環己酮、2-己基環戊酮、2-庚基環戊酮、二環己基酮；作為酯，可以舉出甲酸己酯、乙酸戊酯、乙酸異戊酯、丙酸丁酯、丙酸異丁酯、丁酸丙酯、丁酸異丙酯、異丁酸丙酯、異丁酸異丙酯、戊酸乙酯、異戊酸乙酯、新戊酸乙酯、己酸甲酯、乙酸己酯、乙酸環己酯、乙酸-2-乙基丁酯、丙酸異戊酯、丁酸丁酯、異丁酸丁酯、丁酸異丁酯、異丁酸異丁酯、戊酸丙酯、異戊酸丙酯、己酸乙酯、庚酸甲酯、乙酸庚酯、丙酸己酯、丁酸戊酯、丁酸異戊酯、異丁酸戊酯、異丁酸異戊酯、戊酸異丁酯、己酸丙酯、己酸異丙酯、庚酸乙酯、辛酸甲酯、乙酸辛酯、乙酸異辛酯、乙酸-2-乙基己酯、丁酸己酯、丁酸環己酯、戊酸戊酯、異戊酸異戊酯、己酸丁酯、己酸異丁酯、辛酸乙酯、壬酸甲酯、乙酸壬酯、己酸戊酯、壬酸乙酯、2-乙基己酸丙酯、3，5，5-三甲基己酸乙酯、癸酸甲酯、δ-十二內酯、乙酸癸酯、癸酸乙酯、乙酸香茅酯、十二烷酸甲酯、乙酸十二烷基酯、十二烷酸乙酯；作為燒基苯,可以舉出二甲苯、乙基苯、異丙基苯、正丙基苯、正丁基苯、叔丁基苯、仲丁基苯、異丁基苯、乙基甲苯、甲基異丙基苯、菜等。
作為(P-I)的致孔劑，從不阻礙親水性、且能夠很高地維持配體的活性考慮，優選醇、醚、醛、酮、酯，進一步優選酮、酯，最優選碳原子數為7 10的酮、酯。(P-2)是(P-I)以外的致孔劑，是可以為了調整多孔粒子的細孔容積而加入的成分。20°C時(P-2)在水中的溶解度優選為20%以下。作為致孔劑的構成，如果以(P-2)致孔劑、即碳原子數低於7的直鏈和支鏈的醇、醚、醛、酮、酯、碳原子數低於8的烷基苯為主成分，則不能成為適於蛋白質分離等的大小的細孔徑，而且有時細孔容積變小。另外，如果以碳原子數超過14的醇、醚、醛、酮、酯、或者碳原子數超過10的烷基苯為主成分，則有時細孔容積變小或者形成非多孔的微小粒子。相對於上述單體總量100質量份,包含(P-I)的致孔劑的合計量通常為100 400質量份，優選為150 300質量份。如果致孔劑的合計量低於100質量份，則不能成為適於蛋白質分離等的大小的細孔徑，而且有時細孔容積變小。如果致孔劑的合計量超過400質量份，則細孔容積變得過大或者形成非多孔的微小粒子。
(P-I)優選相對於致孔劑的合計量為10質量％以上,優選為20質量％以上。如果(P-ι)在致孔劑的合計量中為10質量％以下，則有時細孔容積變小。懸浮聚合時的聚合溶劑是水。在不損害本發明效果的範圍，水中可以含有醇等有機溶劑等。相對於100質量份單體總量，水的量優選為200 10000質量份，更優選為500 5000質量份。如果水的量為上述範圍內，則聚合中粒子彼此的合一受到抑制，易於控制粒徑的，生產率優異。作為聚合引發劑，可以使用過硫酸鉀、過硫酸鈉、過硫酸銨等過硫酸鹽、過氧化氫、叔丁基過氧化氫、叔丁基過氧馬來酸、過氧琥珀酸、2，2』 -偶氮雙〔2-N-苄基脒基〕丙烷鹽酸鹽等水溶性引發劑；過氧化苯甲醯、過氧化月桂醯、氫過氧化枯烯、過氧化二碳酸二異丙酯、過氧化新癸酸異丙苯酯、過氧化辛酸異丙苯酯、過氧化2-乙基己酸叔丁酯、3，5，5-過氧化三甲基己醯、偶氮雙異丁腈、偶氮雙異戊腈等油溶性引發劑；並用了有機過氧化物和亞硫酸鈉、雕白粉、抗壞血酸鈉等還原劑的氧化還原系引發劑等，優選為油溶性引發劑或者油溶性的氧化還原引發劑，從生產率方面考慮，更優選為油溶性引發劑。相對於100質量份單體總量，引發劑的量優選為O. 01 10質量份,更優選為O. 05 5質量份。這些聚合引發劑可以溶解在水、單體混合物或者致孔劑中而提供給聚合體系，也可以單獨添加到室溫和加熱中的聚合體系。使用過硫酸鹽等在聚合中顯示成酸性或者鹼性的引發劑、且必須防止環氧基水解時，優選在將PH維持在中性附近的緩衝溶液中進行懸浮聚合。通過照射紫外線、電子束等，也可以不使用引發劑地進行懸浮聚合，也可以使用公知的光自由基引發劑。作為高分子分散劑，可以使用皂化度為80 95%的聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮等水溶性聚合物。作為表面活性劑，可以使用十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、聚氧乙烯十二烷基醚硫酸酯鹽等陰離子性表面活性劑、聚氧乙烯烷基醚等非離子性表面活性劑等。作為鹽，可以優選使用氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉等。作為接種粒子，可以使用重均分子量為1,000 100，000左右的聚苯乙烯粒子、聚
(甲基)丙烯酸烷基酯粒子等。作為水溶性聚合抑制劑，可以優選使用碘化鉀等碘化物鹽、亞硝酸鈉等亞硝酸鹽、硫代硫酸鈉等硫代硫酸鹽、磺化萘氫醌銨鹽等水溶性醌化合物等。
在接種聚合中，通過調整接種粒子的大小和量、單體的量、致孔劑的量，可以獲得具有作為本發明的親和色譜用填充劑所必需的粒徑的多孔粒子。在懸浮聚合中，通過調整高分子分散劑和表面活性劑的種類和量、攪拌速度、攪拌槳和聚合容器的形狀和大小，可以獲得作為本發明的親和色譜用填充劑所必需的粒徑的多孔粒子。多孔粒子的細孔容積通過改變單體與致孔劑之比來調節是公知的。除此之外，也可以通過在聚合時使用的鹽、聚合抑制劑的種類和量、聚合溫度等來調節多孔粒子的細孔容積。作為親和色譜用填充劑的多孔粒子的細孔容積，可以通過配體結合前的多孔粒子的細孔容積和結合的配體的量來調節。使用氧化還原系引發劑以外的引發劑時，聚合的溫度和時間優選為40 100°C、30分鐘 24小時，更優選為60 90°C、1 10小時。聚合完成後，從後述的配體易於結合方面考慮，優選使用接種粒子和/或致孔劑的良溶劑來洗滌。作為洗滌溶劑，可以優選使用丙酮、乙醇、異丙醇等。另外，可以根據需要 地在洗滌前後使用超聲波分散機等來分散多孔粒子。從提高壓力特性、提高蛋白質等的動態結合容量方面考慮，優選進一步採用傾析、過濾等方法來除去小粒子、粗大粒子。I. I. 5.環氧基含量配體結合前的多孔粒子含有的環氧基是用於結合配體的官能團，而且還是在進一步開環後提高作為親和色譜用填充劑的親水性的原因的官能團。配體結合前的多孔粒子的環氧基含量是O. 05 4. Ommol/g,優選為O. 08 2. 5mmol/g,最優選為O. 10 I. 5mmol/g。如果配體結合前的多孔粒子的環氧基含量為O. 05mmol/g以上，則配體的結合量是適當的，蛋白質動態結合容量的降低被抑制。如果配體結合前的多孔粒子的環氧基含量為4. Ommol/g以下，則在保存中的配體活性的降低被抑制，蛋白質動態結合容量的降低也被抑制。配體結合前的多孔粒子的環氧基含量可以通過以下方式來定量在多孔粒子中過量地添加鹽酸而對鹽酸進行加成反應來將環氧基開環，用過量的氫氧化鈉水溶液中和殘餘的鹽酸後，用鹽酸對殘餘的氫氧化鈉進行反滴定。配體結合前多孔粒子的環氧基含量可以通過含環氧基的乙烯基單體的量、聚合溫度、聚合時間、聚合液的pH、進而聚合後的開環處理等來調整。I. 2.親和色譜用填充劑的構成本發明的親和色譜用填充劑包含上述多孔粒子、結合於上述多孔粒子的配體、和開環環氧基。作為本發明的親和色譜用填充劑的一個實施方式，包含配體結合多孔粒子，該配體結合多孔粒子將配體結合於由上述特定聚合物形成的多孔粒子，並具有使該聚合物所含有的環氧基開環而得到的開環環氧基。上述配體結合多孔粒子的體積平均粒徑優選為35 100 μ m，並且利用壓汞儀測定相當於孔徑為10 5000nm範圍的細孔時的細孔容積優選為I. 00 I. 90ml/g。1.2. I.配體對於配體，只要對靶物質具有適度親和性，則其種類沒有特別限定，例如可以使用蛋白A、蛋白G、抗生物素蛋白等的蛋白質；胰島素等肽；單克隆抗體等抗體；酶；荷爾蒙；DNA ；RNA ;肝素、路易斯X、神經節苷酯等糖類；亞氨基二乙酸、合成色素、2-氨基苯基硼酸、4-氨基苯甲脒、穀胱甘肽、生物素、生物素衍生物這樣的低分子化合物。在上述例示的配體可以使用其全部，也可以使用通過重組體、酶處理等而得到的其片段。另外，也可以是人工合成的肽、肽衍生物。作為分離或者純化免疫球蛋白優選的配體，例如為蛋白A和蛋白G，進ー步優選為蛋白A的免疫球蛋白結合域，最優選為在蛋白A的免疫球蛋白結合域的末端加成含有連續4個以上組氨酸単元的肽而得到的蛋白質，作為這樣的蛋白質，例如可以舉出後述的通式(I)或者通式(2)表示的免疫球蛋白結合蛋白質。應予說明，在本發明中，所謂「蛋白質」是指具有肽結構単元的所有分子，例如為包含人為地改變天然型蛋白質的部分片斷、天然型蛋白質的胺基酸序列的變異體的概念。另夕卜，所謂「免疫球蛋白結合域」表示単獨具有免疫球蛋白結合活性的多肽功能単元，所謂「免疫球蛋白結合蛋白質」表示對免疫球蛋白具有特異性的親和性、且包含「免疫球蛋白結合域」的蛋白質。所謂「免疫球蛋白結合」表示結合在免疫球蛋白分子的互補性決定區域(CDR)以外的區域、尤其是Fe片段。在本發明中，與親和色譜法有關而使用的用語「配體」表示與親和色譜法的靶物質結合的部分。1.2.2.免疫球蛋白結合域·
蛋白A的免疫球蛋白結合域可以是天然型免疫球蛋白結合域，或者也可以是重組型的免疫球蛋白結合域。蛋白A的免疫球蛋白結合域優選為選自A域、B域、C域、D域、E域、以及Z域中的至少I種。A域、B域、C域、D域、以及E域的胺基酸序列記載在例如、Moks T,Abrahms L,et al., staphylococcal protein Aconsists of live IgG-bindingdomains, Eur J Biochem. 1986，156，637-643的Fig. I中。該文獻由於該參照而包含在公開中。另外，與在上述文獻中記載的各域胺基酸序列具有70%以上(優選為90%以上)同源性的胺基酸序列形成的蛋白質也能夠作為本發明中的蛋白A的免疫球蛋白結合域使用。重組型免疫球蛋白結合域在免疫球蛋白結合活性中可以作為與改變前的免疫球蛋白結合域同等的結合域來處理，例如優選保持與天然型蛋白A的免疫球蛋白結合域的胺基酸序列具有70%以上(優選為90%以上)的同源性。作為具體例，可以舉出在Ni I sson B. etal.,蛋白·工程(Protein engineering), 1987 年,第 I 卷，2 號，107-113 頁中記載的 Z 域(序列號I)、由Hober S等帶來的在美國專利申請2006/0194955A1中記載的具有鹼耐受性的Z域的變異體(mutant)。在本發明的親和色譜用填充劑中使用的配體可以具有多個相同或者不同種類的免疫球蛋白結合域。例如，作為蛋白A的免疫球蛋白結合域，上述配體可以為(D域-A域)η (在此，η表示I以上的整數(優選為I 6)，在D域與A域之間可以存在任意的胺基酸序列)，即，可以包含含有A域和D域的重複單元。另外，由於本發明的親和色譜用填充劑在使用時具有與鹼水溶液接觸的機會，因此，上述配體可以包含含有蛋白A的Z域的重複單元。另外，在本發明中，配體可以將上述各域、或者其片段或者變異體単獨含有或者組合含有2個以上。在本發明中，所謂免疫球蛋白結合域的片段，是指具有該域的胺基酸序列的一部分、且具有免疫球蛋白結合活性的片段。優選免疫球蛋白結合域的片段是指與該域的胺基酸序列具有90%以上、更優選為具有95%以上的序列同一性、且具有免疫球蛋白結合活性的片段。另外，在本發明中，所謂免疫球蛋白結合域的變異體是指優選與該域的胺基酸序列具有90%以上、更優選具有95%以上序列同一性、且具有免疫球蛋白結合活性的變異體。
免疫球蛋白結合域可以包含選自例如Z域、或其片段或者變異體中的至少I個。對於 Z 域，記載在 Nilsson B. et al.,蛋白·工程(Protein engineering), 1987 年，第 I 卷，2 號，107-113 頁中。另外，在本發明中，配體可以將Z域、或其片段或者變異體単獨含有或者組合含有2個以上(優選為4 10個)。作為Z域的變異體，例如可以舉出具有在專利第4391830號中記載的序列的蛋白質。例如，在專利第4391830號的權利要求I中記載了含有序列號I中規定的2個以上重複單元(Z域)、23位的胺基酸殘基是蘇氨酸的蛋白質。另外，所謂Z域的片段(Z片段)是指具有Z域的胺基酸序列的一部分、且具有免疫球蛋白結合活性的片段，例如，優選具有Z域的胺基酸序列的90%以上，更優選具有95%以上。另外，所謂Z域的變異體是指與例如Z域的胺基酸序列具有90%以上同源性、且具有免疫球蛋白結合活性的變異體，優選具有95%以上同源性。Z域的變異體優選與Z域比較改良鹼耐受性。這種情況下，Z域的變異體與Z域比較是否改良鹼耐受性可以通過後述的實施 例記載的方法來確認。I. 2. 3.免疫球蛋白結合蛋白質I作為優選的配體一個例子的免疫球蛋白結合蛋白質(以下，也稱為「蛋白質I」)以下述通式(I)表示。R-R2.....(I)(式(I)中，R表示含有4 20個組氨酸連續的部位的由4 300個胺基酸形成的胺基酸序列，R2表示含有至少I個蛋白A的免疫球蛋白結合域的由50 500個胺基酸形成的胺基酸序列(在此，R2結合於R的末端是免疫球蛋白結合域的C末端或者N末端)。)在上述通式(I)中，R表示的胺基酸序列含有的胺基酸的數量優選為8 100個，R含有的組氨酸連續的部位的組氨酸數量優選為4 8個。另外，在上述通式(I)中，R2表示的胺基酸序列含有的胺基酸的數量優選為120 480個。在上述通式(I)中，R表示的胺基酸序列和R2表示的胺基酸序列之中至少ー個優選包含I 50個由含有選自賴氨酸、精氨酸、以及半胱氨酸中的I種胺基酸的胺基酸形成的域t。這種情況下，可以在上述胺基酸序列中含有多個相同或者不同的域t。另外，在上述通式(I)中，R-優選為下述通式(2)表示的基團。R1T-.....(2)(式中，R1表示含有4 20個組氨酸連續的部位的由4 100個胺基酸形成的胺基酸序列(在此，在R1中，上述組氨酸連續的部位的末端與r結合)，r表示由7 200個胺基酸形成的任意胺基酸序列)在上述通式(2)中，R1表示的胺基酸序列含有的胺基酸的數量優選為4 25個，R1含有的組氨酸連續的部位的組氨酸數量優選為4 8個，r表示的胺基酸序列含有的胺基酸數量優選為10 50個。另外，在上述通式(2)所示的r表示的胺基酸序列中可以含有TEV域。在r表示的胺基酸序列中含有TEV域，由此可以通過利用TEV蛋白酶的剪切來分離R和R2，而且TEV域在載體中的固定化量多，並且實現了提高該載體的免疫球蛋白保持能力這個效果，因而是優選的序列。另外，可以在r表示的胺基酸序列中含有TEV域的變異體(Mutant)(與能否利用該TEV蛋白酶進行剪切沒有關係，與TEV域的氨基序列具有70%以上、優選具有90%以上的同源性)。構成本發明中使用的蛋白質I的胺基酸的總個數優選為54 800，用於與粒子結合的用途時，更優選為80 600。1.2.4.免疫球蛋白結合蛋白質2配體可以是耐鹼性的免疫球蛋白結合性蛋白質。作為耐鹼性的免疫球蛋白結合性蛋白質，作為優選的配體的另ー個例子的免疫球蛋白結合蛋白質(以下，也稱為「蛋白質2」)由下述通式(3)表示。R-R2.....(3)(式中，R表示含有4 20個組氨酸連續的部位的由4 300個胺基酸形成的胺基酸序列，R2表示含有Z域、或其片段或者變異體的由50 500個胺基酸形成的能夠與免 疫球蛋白結合的胺基酸序列(在此，R2結合於R的末端是免疫球蛋白結合域的C末端或者N末端))在上述通式(3)中，R表示的胺基酸序列含有的胺基酸數量優選為8 100個，R含有的組氨酸連續的部位的組氨酸數量優選為4 8個。另外，在上述通式(I)中，R2表示的胺基酸序列含有的胺基酸數量優選為120 480個。另外，在上述通式(3)中，R-優選為下述通式(4)表示的基團。R1T-.....(4)(式中，R1表示含有4 20個組氨酸連續的部位的由4 100個胺基酸形成的胺基酸序列(在此，在R1中，上述組氨酸連續的部位的末端與r結合)，r表示由7 200個胺基酸形成的任意胺基酸序列)另外，與上述通式(2)同樣地，在上述通式(4)中！·表示的胺基酸序列中可以含有TEV域。在r表示的胺基酸序列中含有TEV域，由此可以通過利用TEV蛋白酶的剪切來分離R和R2，而且TEV域實現了本發明的效果(在載體中的固定化量多、且提高該載體的免疫球蛋白保持能力)，因而是優選的序列。另外，可以在r表不的氣基酸序列中含有TEV域的變異體(Mutant)(與能否利用該TEV蛋白酶進行剪切沒有關係，與TEV域的氨基序列具有70%以上、優選具有90%以上的同源性)。在上述通式(4)中，R1表示的胺基酸序列含有的胺基酸數量優選為4 25個，R1含有的組氨酸連續的部位的組氨酸數量優選為4 8個，r表示的胺基酸序列含有的胺基酸數量優選為10 50個。在上述通式(3)中，R表示的胺基酸序列和R2表示的胺基酸序列之中至少ー個優選包含I 50個由含有選自賴氨酸、精氨酸、以及半胱氨酸中的I種胺基酸的胺基酸形成的域t。這種情況下，可以在上述胺基酸序列中含有多個相同或者不同的域t。在本發明的親和色譜用填充劑中，採用蛋白質2作為配體時，對於在鹼性條件下的洗滌(例如利用氫氧化鈉等鹼性液的洗滌)具有高耐受性。作為其理由，認為是通過將組氨酸連續的部位加成在Z域而使多孔粒子和Z域的結合位置與沒有組氨酸連續部位時不同，以及對固定化後的Z域引起一些結構變化而使鹼耐受性提高等。雖然不能利用實驗來確認實際的理由，但是耐鹼性的實驗結果顯示出具有由加成組氨酸連續部位而產生的作用效果。
此外，利用本發明的親和色譜用填充劑離析免疫球蛋白時，通過例如利用本發明的親和色譜用填充劑使免疫球蛋白吸附於上述填充劑的エ序(第一的エ序)、和使上述免疫球蛋白溶出的エ序(第二的エ序)，可以離析免疫球蛋白，優選進ー步經過用鹼性液對上述填充劑進行CIP洗滌的エ序(第三的エ序)。在第一エ序中，使含有免疫球蛋白的溶液在免疫球蛋白吸附於該填充劑的配體的條件下流過填充有上述親和色譜用填充劑的柱等中。在此，所謂含有上述免疫球蛋白的溶液，可以是含有免疫球蛋白的任意溶液，例如可以舉出血清等來自生物體的檢測體、雜交瘤細胞培養基的上清等。作為上述免疫球蛋白吸附的條件，例如可以舉出免疫球蛋白濃度為O. I 10g/L、溶液pH5 9、柱中的停留時間為O. 5 50分、溫度為O 40°C。在該第一エ序中，溶液中的免疫球蛋白以外的物質幾乎沒有吸附而通過柱。通常為了除去一部分保持得弱的物質，用含有NaCl等鹽的中性緩衝液、例如磷酸ニ氫鈉/磷酸氫ニ鈉溶液、檸檬酸/磷酸氫ニ鈉溶液、鹽酸/三(羥甲基)氨基甲烷溶液、HEPES/氫氧化鈉溶液等洗滌填充劑。在第二エ序中，使PH2 5合適的緩衝液、例如檸檬酸/檸檬酸鈉溶液、こ酸/こ酸鈉溶液、鹽酸/甘氨酸溶液等流過來使免疫球蛋白溶出。在第三エ序中，用鹼性 液洗滌(CIP洗滌)填充劑。作為在此使用的鹼性液,例如可以舉出氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液、三乙胺、氫氧化四丁基銨等。I. 2. 5.蛋白質I和2的製造作為用於製造在本發明中使用的蛋白質I和2的標準技術，例如可以利用由Frederick Μ· Ausbel 等帝來的社 Current Protocols In Molecular Biology、Sambrook等編輯的Molecular CloningCCold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)等中記載的公知的基因重組技木。例如，在本發明中使用的蛋白質I或2可以利用在美國專利第5，151，350號說明書中記載的基因重組技術來製造。即，通過將使對目標改變蛋白質(蛋白質I或者2)編碼的核酸序列含有的表達載體轉化到大腸桿菌等宿主中、並在適合的液體培養基中培養該細胞，可以從培養後的細胞中大量且經濟地取得在本發明中使用的蛋白質I或2。作為優選的表達載體，能夠在細菌中複製的已知的載體均可以使用，例如可以舉出在美國專利第5，151, 350號說明書中記載的質粒、在Sambrook等編輯的MolecularCloningCCold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)等中記載的質粒。另夕卜，為了通過向宿主中導入核酸來使宿主轉化，可以使用在該技術領域中已知的任一方法，例如可以利用在Sambrook等編輯的Molecular CloningCCold Spring Harbor LaboratoryPress, 3rd edition, 2001)等中記載的公知的方法。對於將轉化的細菌培養而表達的蛋白質進行回收的方法是本領域技術人員熟知的。具體而言，將對需要的胺基酸序列編碼的DNA分割併合成為由數十個鹼基形成的合成寡核苷酸，通過由DNA連接酶引發的連接反應連接它們並插入到質粒中，由此可以取得目標表達載體。在此時，出於使該蛋白質在大腸桿菌中高效地表達的目的，對本領域技術人員來說，採用利用大腸桿菌的最適密碼子的核酸序列是一般進行的方法。另外，可以如後述本發明的實施例所不地利用PCR(Polymerase Chain Reaction)技術由Straphylococcusaureus的基因組DNA構築對需要的胺基酸序列編碼的DNA序列。例如，在上述製造方法中使用的核酸可以對免疫球蛋白結合蛋白質(蛋白質I或2)或者其等功能變異體進行編碼。在本發明中，免疫球蛋白結合蛋白質的所謂「等功能變異體(functional variant)」,是由於部分胺基酸的加成、削除、取代、胺基酸殘基的化學修飾等而改變的免疫球蛋白結合蛋白質，意思是能夠與改變前的免疫球蛋白結合蛋白質的胺基酸序列保持70%以上、優選為90%以上同源性、且在免疫球蛋白結合活性中作為與改變前的免疫球蛋白結合蛋白質同等蛋白質來處理的免疫球蛋白結合蛋白質。即，作為上述核酸，包括對本說明書中的蛋白質I或2編碼的核酸。另外，如上所述，在本發明中使用的蛋白質I和2可以是含有I個以上(優選為2 12個，更優選為4 10個)免疫球蛋白結合域的蛋白質。對這樣的蛋白質編碼的cDNA可以通過將規定個數的對I個免疫球蛋白結合域編碼的cDNA (互補DNA)串列地連結來容易地製作。通過將這樣製作成的cDNA插入並利用到適合的表達質粒中，可以容易地製造含有I個以上免疫球蛋白結合域的蛋白質。例如，在後述實施例中示出的具有序列號4的胺基酸序列的蛋白質(SPATK)、具有序列號2的胺基酸序列的蛋白質(SP4Z)、由在序列號2或序列號4中缺失、取代或者加成I 個或幾個胺基酸而得到的胺基酸序列形成、且具有免疫球蛋白結合活性的蛋白質作為在本發明中使用的免疫球蛋白結合蛋白質是優選的。1.2.6.配體的結合作為上述載體與上述配體的結合方法，將多孔粒子含有的環氧基直接作為與配體的結合部位來利用作為エ藝是簡便的，從而優選。除此之外還有用甲苯磺醯基等將多孔粒子含有的環氧基開環而生成的醇性羥基活性化後結合配體的方法，也可以由多孔粒子含有的環氧基或者該環氧基開環而生成的基團進ー步使連接體延長後、介由該連接體將配體結合於多孔粒子。配體的結合條件根據配體結合前多孔粒子的環氧基含量、配體的種類不同而異，但可以採用對於本領域技術人員來說公知的方法。配體為蛋白質時，蛋白質N末端的氨基、蛋白質含有的賴氨酸、半胱氨酸可以成為與環氧基的反應點。結合蛋白質時，例如，可以使用與蛋白質的等電點接近的緩衝類水溶液，根據需要地添加氯化鈉、硫酸鈉等鹽，邊將蛋白質與多孔粒子混合邊使其在O 40°C下反應I 24小時來結合作為配體的蛋白質。配體的結合量根據配體的種類、靶分子的種類等來適當調節，將蛋白A這樣的抗體結合性蛋白質作為配體結合時，姆Ig多孔粒子，優選為10 200mg,更優選為25 IOOmg0如果將蛋白A這樣的抗體結合性蛋白質作為配體結合時，每Ig多孔粒子的配體結合量為IOmg以上，則動態結合容量優異，如果為200mg以下，則用於溶出結合的抗體的溶出液的量是合適量。1.2.7.開環環氧基構成本發明的親和色譜用填充劑的配體結合多孔粒子具有開環環氧基。該開環環氧基是在將配體結合於由上述特定聚合物形成的多孔粒子後、使該聚合物所含有的環氧基、即與配體結合的環氧基以外餘下的環氧基開環而獲得的。這意思是在將多孔粒子用作親和色譜用填充劑前、多孔粒子表面的環氧基實質上全部開環。此外，所謂多孔粒子表面的環氧基實質上全部開環，意思是在具有開環環氧基的配體結合多孔粒子中殘留的環氧基具體而言優選為低於O. 04mmol/g，進ー步優選為低於
O.02mmol/g，最優選沒有殘留環氧基。如果開環環氧基的殘留量低於O. 04mmol/g，則保存穩定性優異。作為環氧基開環生成的開環環氧基的醇性羥基發揮著以下作用將粒子表面親水化、防止蛋白質等非特異吸附，並且在水中使粒子的韌性提高、防止破壞高流速下的粒子。作為多孔粒子中環氧基的開環方法，例如可以舉出在水溶劑中利用酸或鹼在加熱或者室溫下進行攪拌的方法。另外，也可以利用巰基こ醇、硫甘油等具有巰基的封閉劑、單こ醇胺等具有氨基的封閉劑來使環氧基開環。最優選的開環環氧基是利用硫甘油使多孔粒子含有的環氧基開環而得到的開環環氧基。硫甘油作為原料與巰基こ醇等相比，毒性低，硫甘油加成的環氧開環基與由具有氨基的封閉劑而得到的開環基相比，具有非特異吸附低，而且動態結合量變高這個優點。 I. 2. 8.粒徑、細孔容積構成本發明的親和色譜用填充劑的、具有開環環氧基的配體結合多孔粒子的粒徑優選為35 100 μ m,更優選為38 75 μ m。如果粒徑為35 μ m以上，則壓カ特性優異。如果為100 μ m以下，則能夠獲得動態結合容量高的填充劑。如上所述，具有開環環氧基的配體結合多孔粒子的粒徑可以通過聚合多孔粒子時的條件來調整。此外，本發明中的「粒徑」是利用雷射衍射散射式粒度分布測定裝置得到的體積平均粒徑。對於構成本發明的親和色譜用填充劑的具有開環環氧基的配體結合多孔粒子，在利用壓汞儀對相當於孔徑為10 5000nm範圍的細孔進行測定時，優選具有1.00
I.90ml/g的細孔容積，更優選具有I. 05 I. 85ml/g的細孔容積。如果細孔容積為上述範圍內，則能夠獲得蛋白質的動態結合容量高的填充劑。而且，如果細孔容積為1.90ml/g以下，則壓カ特性優異。構成本發明的親和色譜用填充劑的具有開環環氧基的配體結合多孔粒子優選具有80 150m2/g的比表面積，更優選具有100 140m2/g的比表面積。在此，如果比表面積為80m2/g以上，則獲得動態結合容量高的填充劑。另ー方面，如果為150m2/g以下，則填充劑的強度優異，高流速下填充劑的破壞被抑制，柱壓カ的升高被抑制。所謂本發明中的「比表面積」是用粒子的乾燥質量除利用壓汞儀得到的具有細孔徑為10 5000nm的細孔的表面積而得到的值。構成本發明的親和色譜用填充劑的具有開環環氧基的配體結合多孔粒子優選具有75 300nm的體積平均細孔徑，更優選具有80 250nm的體積平均細孔徑。在此，如果體積平均細孔徑為75nm以上，則高流速下的動態結合容量降低被抑制。另ー方面，如果為300nm以下，則能夠不論流速地獲得動態結合容量優異的填充劑。所謂本發明中的「體積平均細孔徑」是利用壓汞儀得到的細孔徑為10 5000nm的細孔的體積平均細孔徑。利用顯微硬度計測定構成本發明的親和色譜用填充劑的具有開環環氧基的配體結合多孔粒子溼潤狀態的I個粒子時的彈性模量優選為3. O 10. OMPa,進ー步優選為5. O 8. OMPa0如果為3. OMPa以上，則壓カ特性優異。如果為10. OMPa以下，則獲得蛋白質的動態結合容量優異的填充劑。本發明中的彈性模量是通過以下方式得到的值將I滴水漿狀態的構成親和色譜用填充劑的具有開環環氧基的配體結合多孔粒子放在顯微硬度計的載物臺上，對於溼潤狀態的I個粒子，測定用顯微硬度計的探針從粒子正上方觸碰而使粒子變形為直徑的5%時的應力，用與粒徑相同直徑的圓的面積(単位m2)除以上述應カ(単位N)而得到值。
實施例2.實施例下面，舉出實施例來進ー步具體地說明本實施方式所涉及的親和色譜用填充劑。另外，以下記載概括地表示本發明的方式，沒有特別理由，不通過所涉及的記載來限定本發明。2. I.評價方法2. I. I.環氧基含量 配體結合前的多孔粒子的環氧基含量通過以下方式來定量以質量計量取質量濃度約為10%且已知準確質量濃度的多孔粒子水分散體到聚こ烯瓶，以使得由聚合中使用的含有環氧基的單體量計算出的環氧基摩爾數為2. OOmmol，向其中加入濃度為38%的氯化鈣水溶液25mL和2規定的鹽酸2. OOmL，在75°C下攪拌2小時30分鐘，由此將環氧基開環，冷卻後，用2規定的氫氧化鈉水溶液2. 50mL中和,進而邊用pH計監測pH邊用O. I規定的鹽酸進行反滴定。2. I. 2.粒徑利用雷射衍射散射式粒度分布測定裝置(Beckman · Coulter公司制LS13320)測定粒子的體積平均粒徑。2. I. 3.細孔容積、比表面積、體積平均細孔徑在40°C下真空乾燥24小時而獲得乾燥粒子，利用壓汞儀(島津製作所社制AUTOPORE IV9520)求得乾燥粒子的細孔容積、比表面積、以及體積平均細孔徑(細孔徑)。測定範圍以細孔徑範圍計為10 5000nm。2. 1.4.彈性模量將I滴水漿狀態的具有開環環氧基的配體結合多孔粒子放置在顯微硬度計(Fischer · Instruments公司制HM2000)的載物臺上,對於溼潤狀態的I個粒子，對將顯微硬度計的探針從粒子的正上方觸碰而使粒子變形為直徑的5%時測定的應カ(単位N)進行記錄。另外，採用最小二乗法由探針位置與應カ的圖表計算出應力=O的探針位置，將其作為對象粒子的直徑。用對象粒子直徑的圓面積(単位m2)除以記錄的應カ而得到的值作為所測定的I個粒子的彈性模量。測定是對於任意選擇的5個粒子而實施的，求得每個彈性模量的平均值，作為構成親和色譜用填充劑的具有開環環氧基的配體結合多孔粒子的弾性模量。2. I. 5.蛋白質的動態結合容量利用GE Healthcare Bio Science 公司制的 AKTAprime plus 測定線性流速為300cm/hr時的蛋白質(人IgG抗體)的動態結合容量。柱容量為4mL (5ι πιΦ X200mm長)，人IgG抗體(Equitech Bio公司制HGG-1000)用20mM磷酸緩衝液(ρΗ7· 5)稀釋到5mg/mL，由溶出前端突破10%時的人IgG抗體吸附量和柱填充體積求得動態結合容量。以下，動態結合容量有時記載成DBC。2. I. 6.壓カ特性以內徑為16mm、填充高度為IOOmm的方式將由測定的具有開環環氧基的配體結合多孔粒子形成的填充劑填充到柱中，將該柱與GE Healthcare Bio Science公司制的AKTApilot連接，使純水邊以線性流速每50cm/hr階段性提高邊流動時，將以恆定線性流速流動的I分鐘觀察到超過O. 05MPa的經時壓力増加時的線性流速記錄為滲壓流速。即使3000cm/hr也沒有觀察到這樣的壓カ增加時，中止測定，記錄為> 3000cm/hr。另外,柱的絕對壓カ達到I. 9MPa吋，即使沒有觀察到這樣的壓カ增加也中止測定，記錄達到I. 9MPa時的線性流速。滲壓流速優選為900cm/hr以上，更優選為1200cm/hr以上，進ー步優選為1800cm/hr以上，最優選為2700cm/hr以上。2. 1.7.蛋白A結合量作為與多孔粒子結合的配體的蛋白A (SPA)的結合量是通過利用了ニ辛可寧酸(BCA)試劑的試劑組來定量的。具體而言，將以固體成分換算為Img的填充劑取到試管中，用 Thermo Fisher Scientific 公司(舊 PIERCE 公司)的 BCA Protein Assay Kit 進行定量。反應在37°C下通過顛倒混和進行30分鐘。校正曲線是利用與結合於多孔粒子的蛋白A同一批次的蛋白製作成的。2.2.實驗例
2. 2. I.實施例 I(i)多孔粒子的懸浮聚合在409Ig純水中添加聚こ烯醇(Kuraray公司制PVA-217) 8. 52g、十二烷基硫酸鈉(花王社制EMAL 10G)2. 13g和碳酸鈉4. 26g，攪拌一夜製備成水溶液(S-1-1)。進而，聚合當天另抽取30g的(S-1-1)，在餘下的(S-1-1)中溶解亞硝酸鈉2. 13g，製備成水溶液(S-2-1)。接著，使甘油ニ甲基丙烯酸酯(新中村化學エ業社制)125g、甲基丙烯酸縮水甘油酯(Mitsubishi Rayon公司制)17. 9g、甘油單甲基丙烯酸酯(日本油脂社制)35. 9g溶解在2-辛酮(東洋合成社制)86. 4g和苯こ酮(和光純藥エ業社制)253g中，製備成單體溶液。此夕卜，使単體的總質量為100質量份時的、各単體的份數是甘油ニ甲基丙烯酸酯為70質量份、甲基丙烯酸縮水甘油酯為10質量份、甘油単甲基丙烯酸酯為20質量份。在(S-1-1) 30g中添加2,2，-偶氮ニ異丁腈(和光純藥エ業社制)2. 2g並分散，作為引發劑分散液。接著，將準備的溶液(S-2-1)和単體溶液投入到帶有擋板的7L可拆式燒瓶內，安裝溫度計、攪拌槳、以及冷卻管，安置在溫水浴中，氮氣氛下、以220rpm開始攪拌。接著，通過溫水浴對可拆式燒瓶加熱，內溫達到85°C後，添加引發劑分散液，邊將溫度保持在85°C邊進行5小時的攪拌。接著，冷卻反應液後，用布氏漏鬥過濾所述反應液，用純水和異丙醇洗滌。將洗滌的粒子轉移到塑料瓶中，分散在水中進行3次傾析，除去小粒子。通過以上操作獲得分散在水中的12. 5質量％的多孔粒子I (粒子乾燥質量為123g)。多孔粒子I的環氧基含量是O.47mmol/g0(ii)配體的製作2. 2. I. I. SP4Z表達載體的構築按照下述步驟構築免疫球蛋白結合蛋白質(SP4Z)表達載體。圖2是說明SP4Z載體的構築方法的圖。( I)步驟 I將編碼單體Z域的DNA作為起始物質，構築具有NcoI剪切位點和EcoRI剪切位點的單體Z域載體(A-pETMll) (SPlZ)o(2)步驟 2接著，在A-pETMll載體上再加成ー個Z域，構築具有EcoRI剪切位點和SacI剪切位點的2聚體Z域載體(AB-pETMll) (SP2Z)。(3)步驟 3接著，在AB-pETMll載體上進ー步再加成ー個Z域，構築具有SacI剪切位點和Hind III剪切位點的3聚體Z域載體(ABC-pETMll) (SP3Z)。(4)步驟 4最後，在ABC-pETMll載體上加成第4個Z域，構築具有HindIII剪切位點和XhoI剪切位點的PETM11-SP4Z的載體。 2. 2. I. 2. SPlZ-pETMll載體(具有終止密碼子的單體Z域載體)的構築將SPZK DNA (序列號3)作為模板，用作為正向引物的引物153 (序列號5)和作為反向引物的引物156 (序列號8)實施PCR。在引物153和引物156中分別包含NcoI剪切位點和SacI的限制性內切酶剪切位點。PCR的條件如下。階段I :94°C I分鐘I循環，階段2 :94°C 30秒鐘，55 V 30秒鐘，72 °C 2. 5分鐘(25循環)，階段3 72°C 10分鐘I循環，之後4°C下保持。PCR生成物是利用GE Healthcare Bio Science公司制的生成試劑盒進行PCR純化的。接著，用NcoI限制性內切酶和SacI限制性內切酶進行剪切的pETMll載體與PCR生成物的連接。利用限制性內切酶的消化反應用New England Biolabs制的NcoI限制性內切酶和SacI限制性內切酶在37°C下進行I小時,用GE Healthcare Bio Science公司制生成試劑盒進行PCR純化。對於連接反應，利用T4DNA連接酶(Invitrogen公司制)在室溫下進行整夜。利用DH5a competent cell (Biomedal Life Science公司制)使連接得到的載體轉化,將得到的轉化體在含有卡那黴素的LB培養基中37°C下整夜培養，從陽性集落(Colony)中提取出質粒，通過3730DNA序列分析儀(Applied Biosystems公司制)確認插入的DNA片段序列是正確的。2. 2. I. 3. A-pETMll載體(沒有終止密碼子的單體Z域載體)的構築用作為正向引物的引物153和作為反向引物的引物154 (序列號6)來代替引物153、156，與實驗2. 2. I. 2.同樣地構築A-pETMll載體。此外，DNA片段的插入利用pETMll的NcoI剪切位點和EcoRI剪切位點進行。2. 2. I. 4. SP2Z-pETMll載體(有終止密碼子的2聚體Z域載體)的構築用作為正向引物的引物155 (序列號7)和作為反向引物的引物156，通過PCR製備具有EcoRI剪切位點和SacI剪切位點的單體Z域的DNA，插入到A-pETMll的EcoRI剪切位點和SacI剪切位點中進行構築。實驗與實驗2. 2. 1.2.在同樣的條件下進行。2. 2. I. 5. AB-pETMll載體(沒有終止密碼子的2聚體Z域載體)的構築用作為正向引物的引物155和作為反向引物的引物157 (序列號9)，通過PCR製備具有EcoRI剪切位點和SacI剪切位點且沒有終止密碼子的單體Z域的DNA，插入到A-pETMll的EcoRI剪切位點和SacI剪切位點中，從而構築AB-pETMll載體。實驗與實驗2. 2. I. 2.在同樣的條件下進行。
2. 2. I. 6. SP3Z_pETMll載體(有終止密碼子的3聚體Z域載體)的構築用作為正向引物的引物158 (序列號10)和作為反向引物的引物161 (序列號13)，通過PCR製備具有SacI剪切位點和XhoI剪切位點的單體Z域的DNA，插入到AB-pETMll的EcoRI剪切位點和SacI剪切位點中進行構築。實驗與實驗2. 2. I. 2.在同樣的條件下進行。2. 2. I. 7. ABC-pETMll載體(沒有終止密碼子的3聚體Z域載體)的構築用作為正向引物的引物158和作為反向引物的引物159 (序列號11)，通過PCR製備具有SacI剪切位點和Hind III剪切位點且沒有終止密碼子的單體Z域的DNA，插入到AB-pETMll的SacI剪切位點和Hind III剪切位點中，從而構築ABC-pETMll載體。實驗與實驗2. 2. I. 2.在同樣的條件下進行。2. 2. I. 8. SP4Z_pETMll載體(有終止密碼子的4聚體Z域載體)的構築用引物160 (序列號12)和引物161，通過PCR製備具有Hind III剪切位點和XhoI 剪切位點的單體Z域的DNA，插入到ABC-pETMl I的Hind III剪切位點和XhoI剪切位點中，從而構築SP4Z-pETMll載體。實驗與實驗2. 2. I. 2.在同樣的條件下進行。2. 2. I. 9. SP4Z的表達和純化將得到的SP4Z-pETMll載體導入到E. coli (BL21株)細胞(STRATAGENE制)中，在18°C下添加ImM的IPTG (Sigma-Aldrich制)，孵育15小時，使重組型免疫球蛋白結合蛋白質(SP4Z)表達。在誘導之前，將上述細胞在37°C下孵育直至吸光度(0D600)達到約O. 6。蛋白質表達後，回收細胞，在PH8. O的Tris緩衝液中破碎。得到的重組型免疫球蛋白結合蛋白質(SP4Z)採用Ni親和色譜法(Ni-NTA (三こ酸胺)粒子，QIAGEN公司制)進行純化。純化的免疫球蛋白結合蛋白質採用陰離子交換色譜法(Q-瓊脂糖凝膠FF，GE Bio Science公司制)進ー步純化。由SDS-PAGE確認的免疫球蛋白結合蛋白質的純度為96%。另外，得到的重組型免疫球蛋白結合蛋白質(SP4Z)通過MALDI-T0F質譜分析，各個的胺基酸序列一致，由此確認具有圖I所示的胺基酸序列(序列號2)。此外，在圖I中，R和R2與上述通式(I)和(3)中的R和R2相對應，R1和r與上述通式(2)和(4)中的R1和r相對應。r中的下線部表示TEV域(TEV蛋白酶(肽結合水解合成酶)剪切位點)。(iii)多孔粒子與配體的結合製備以粒子乾燥質量換算為Ig的多孔粒子1、0. Ig的SP4Z分散在25mL的O. IM磷酸緩衝液(PH6. 8)中的混合液，在10°C下顛倒混和24小時，使SP4Z與多孔粒子I結合。將生成的粒子過濾後，與IM硫甘油25mL混合，在30°C下反應4小時，將餘下的環氧基開環，用PBS/0. 5%Tween20洗滌後，用PBS洗滌，從而獲得由具有開環環氧基的配體結合多孔粒子形成的親和色譜用填充劑 I (A-1)。利用 Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assaykit進行定量測定，結果與上述粒子結合的SP4Z的量為41mg/g粒子。將結果示於表2。(iv)評價(A-I)的粒徑為54 μ m,細孔容積為I. 26mL/g,比表面積為lllm2/g，體積平均細孔徑為lOlnm。弾性模量為5. 6MPa。蛋白質(人IgG抗體)的動態結合容量為40mg/mL，壓カ流速為 2700cm/hr。2. 2. 2.實施例 2
在實施例I的懸浮聚合中，使攪拌轉速為300rpm，除此之外，同樣地進行，獲得多孔粒子2，製造並評價由具有開環環氧基的配體結合多孔粒子形成的親和色譜用填充劑2(A-2)。將結果示於表2。多孔粒子2的環氧基含量為O. 45mmol/g。(A-2)的粒徑為31 μ m，細孔容積為I. 438mL/g、比表面積為132m2/g、體積平均細孔徑為llOnm。彈性模量為6. 4MPa。蛋白質(人IgG抗體)的動態結合容量為40mg/mL,壓カ流速為1100cm/hr。2. 2. 3.實施例 3( i )多孔粒子的懸浮聚合在300g純水中添加聚こ烯基醇(Kuraray公司制PVA_217)0. 600g、十二烷基硫酸鈉(花王社制EMAL10G) O. 030g和硫酸鈉I. 50g,攪拌一夜，製備成水溶液(S-1-2)。進而，聚合當天另抽取5g的(S-1-2)，在餘下的(S-1-2)中溶解亞硝酸鈉O. 150g，製備成水溶液(S-2-2)。 接著，使甘油ニ甲基丙烯酸酯(新中村化學エ業社制)8. 19g、甲基丙烯酸縮水甘油酷(Mitsubishi Rayon公司制)3. 51g溶解在2-辛酮(東洋合成社制)6. 25g和苯こ酮(和光純藥エ業社制)18. 3g中，製備成單體溶液。此外，使単體的總質量為100質量份時的、各單體的份數是甘油ニ甲基丙烯酸酯為70質量份、甲基丙烯酸縮水甘油酯為30質量份。在(S-1-2) 5g中添加2，2』 -偶氮ニ異丁腈(和光純藥エ業社制)O. 149g並分散，作為引發劑分散液。接著，將得到的溶液(S-2-2)和単體溶液投入到帶有擋板的O. 5L可拆式燒瓶內，安裝溫度計、攪拌槳、以及冷卻管，安置在溫水浴中，氮氣氛下、以680rpm開始攪拌。接著，通過溫水浴對可拆式燒瓶加熱，內溫達到85°C後，添加引發劑分散液，邊將溫度保持在 85°C邊進行5小時的攪拌。接著，冷卻反應液後，用布氏漏鬥過濾所述反應液，用純水和異丙醇洗滌。將洗滌的粒子轉移到塑料瓶中，分散在水中進行3次傾析，除去小粒子。通過以上操作獲得分散在水中的12. 5質量％的多孔粒子3 (粒子乾燥質量為8. 7g)。多孔粒子3的環氧基含量是I.7mmol/g0(ii)配體的製作通過後述的製備例(I) (5)，製備成具有圖3所示的胺基酸序列的免疫球蛋白結合蛋白質(SPATK (序列號4))。( I)步驟 I將金黃色葡萄球菌(Staphylococus aureus)基因組DNA作為模板,用具有限制性內切酶NcoI位點的引物(引物11)、和具有限制性內切酶BamHl以及Hind III位點的引物(弓丨物12)，通過PCR獲得編碼D-A域的DNA。利用限制性內切酶NcoI和Hind III剪切該DNA，與同樣地由限制性內切酶NcoI和Hind III剪切的pETMll連接來構築SPAK質粒。(2)步驟 2接著，將上述得到的SPAK質粒作為模板，用具有限制性內切酶BamHI位點的引物(引物13)和具有限制性內切酶Hind III位點的引物(引物14)，通過PCR獲得編碼新D-A域的DNA。用限制性內切酶BamHI和Hind III剪切該DNA，與同樣地由限制性內切酶BamHI和Hind III剪切的上述得到的SPAK質粒連接來構築SPATK質粒。(3) SPAK質粒的構築
將金黃色葡萄球菌基因組DNA作為模板，用引物11和引物12實施PCR。PCR的條件如下。階段I :94°C I分鐘I循環，階段2 :94°C 30秒鐘，53 °C 30秒鐘，72 °C 2. 5分鐘(25循環)，階段3 72°C 10分鐘I循環，然後4°C下保持。PCR生成物利用GE Healthcare Bio Science公司制的純化試劑盒進行純化。接著，用NcoI限制性內切酶和Hind III限制性內切酶剪切。對於pETMll載體，同樣地用NcoI限制性內切酶和HindIII限制性內切酶剪切。利用限制性內切酶的消化反應用New EnglandBiolabs制的NcoI限制性內切酶和Hind III限制性內切酶進行，用GE Healthcare BioScience公司制純化試劑盒進行純化。對於連接反應，利用T4DNA連接酶(Invitrogen公司制)在室溫下整夜進行。使連接得到的載體轉化成DH5a competent cell (Biomedal LifeScience公司制)，通過3730DNA序列分析儀(Applied Biosystems公司制)確認陽性集落質粒(SPAK質粒)的序列是正確的。(4) SPATK質粒的構築的構築·將SPAK質粒作為模板，用引物13和引物14，通過PCR獲得編碼新D-A域的DNA。PCR的條件是階段I :94°C I分鐘I循環，階段2 -MV 30秒鐘、55°C 30秒鐘、72°C 2. 5分鐘(25循環)，階段3 72°C 10分鐘I循環，然後4°C下保持。PCR生成物利用GE HealthcareBio Science公司制的純化試劑盒進行純化。接著，用BamHI限制性內切酶和Hind III限制性內切酶剪切該DNA。對於SPAK質粒，也同樣地用BamHI限制性內切酶和Hind III限制性內切酶剪切。利用限制性內切酶的消化反應用New England Biolabs制的BamHI限制性內切酶和Hind III限制性內切酶進行,用GE Healthcare Bio Science公司制純化試劑盒進行純化。對於連接反應，利用T4DNA連接酶(Invitrogen公司制)在室溫下整夜進行。使連接得到的載體轉化成 DH5a competent cell (Biomedal Life Science 公司制)，通過 3730DNA序列分析儀(Applied Biosystems公司制)確認陽性集落質粒(SPATK質粒)的序列是正確的。(5) SPATK的表達和純化將得到的SPATK質粒轉化成E. coli(BL21株)細胞(STRATAGENE制)。在18°C下添加ImM的IPTG(Sigma-Aldrich制)，孵育15小時，使重組型免疫球蛋白結合蛋白質(SPATK)表達。在誘導之前，將上述細胞在37で下孵育直至吸光度(00600)達到約0.6。蛋白質表達後，回收細胞，在PH8. O的Tris緩衝液中破碎。得到的重組型免疫球蛋白結合蛋白質(SPATK)採用Ni親和色譜法(Ni-NTA (三こ酸胺)粒子，QIAGEN公司制)進行純化。純化的免疫球蛋白結合蛋白質採用陰離子交換色譜法(Q-瓊脂糖凝膠FF，GE Bio Science公司制)進ー步純化。由SDS-PAGE確認的免疫球蛋白結合蛋白質的純度為96%另外，得到的重組型免疫球蛋白結合蛋白質(SPATK)通過MALDI-T0F質譜分析，各個的胺基酸序列一致，由此確認具有圖3所示的胺基酸序列。[表 I]
權利要求
1.一種親和色譜用填充劑，其特徵在於，具有 由乙烯基單體的聚合物形成的多孔粒子，所述乙烯基單體包括含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體和含有環氧基的非交聯性乙烯基單體、或者含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體， 結合於所述多孔粒子的配體，以及 開環環氧基。
2.根據權利要求I所述的親和色譜用填充劑，其中，所述配體是含有至少I個蛋白A、蛋白A的免疫球蛋白結合域、或者其變異體的蛋白質。
3.根據權利要求I或2所述的親和色譜用填充劑，其中，所述乙烯基單體由以下構成 (X-I)含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體20 90質量份、 (X-2)不含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體O 40質量份、 (M-I)含有環氧基的非交聯性乙烯基單體I 40質量份、以及 (M-2)不含有環氧基的非交聯性乙烯基單體O 70質量份， 其中，《-1)、《-2)、(1-1)和(1-2)的合計是100質量份。
4.根據權利要求I 3中任一項所述的親和色譜用填充劑，其中，所述開環環氧基是利用硫甘油使所述聚合物所含有的環氧基開環而獲得的。
5.根據權利要求I 4中任一項所述的親和色譜用填充劑，其中，所述多孔粒子是將所述乙烯基單體100質量份與以(P-I)為必需成分的水系混合物懸浮聚合而獲得的，所述(P-I)是選自碳原子數為7 14的直鏈狀、支鏈狀以及環狀的醇、醚、醛、酮、酯、碳原子數為8 10的烷基苯中的至少I種的致孔劑，其中，致孔劑的合計量是100 400質量份，(P-I)在致孔劑的合計量100質量％中為10質量％以上。
6.根據權利要求I 5中任一項所述的親和色譜用填充劑，其中，利用壓汞儀對相當於孔徑為10 5000nm範圍的細孔進行測定時所述多孔粒子的細孔容積是I. 00 I. 90ml/g。
7.根據權利要求I 6中任一項所述的親和色譜用填充劑，其中，所述多孔粒子的粒徑是 35 100 μ m。
8.一種離析免疫球蛋白的方法，包括 利用權利要求I 7中任一項所述的親和色譜用填充劑使免疫球蛋白吸附於所述填充劑的工序，以及 使所述免疫球蛋白溶出的工序。
9.一種親和色譜法用填充柱，填充有權利要求I 7中任一項所述的親和色譜用填充劑。
全文摘要
本發明提供含有蛋白質的動態結合容量高且壓力特性優異的多孔粒子的、對蛋白質純化有用的親和色譜用填充劑。本發明的親和色譜用填充劑的特徵在於，具有由乙烯基單體的聚合物形成的多孔粒子、結合於上述多孔粒子的配體、以及開環環氧基，所述乙烯基單體包括含有羥基且不含有環氧基的交聯性乙烯基單體和含有環氧基的非交聯性乙烯基單體、或者含有羥基和環氧基的交聯性乙烯基單體。
文檔編號C07K16/00GK102834407SQ20118001761
公開日2012年12月19日 申請日期2011年3月29日 優先權日2010年3月31日
發明者田守功二, 安陪毅由, 岡野友亮, 籾山昌輝, 川井洋, 日向寺慧, 王勇 申請人:Jsr株式會社