一種基於樹幹畢赤酵母合成菌株發酵木糖生產衣康酸的構建方法與流程

2023-04-23 00:14:21

本發明屬於合成生物學和生物能源技術領域，具體涉及一種基於樹幹畢赤酵母合成菌株發酵木糖生產衣康酸的構建方法。以樹幹畢赤酵母(pichiastipitisfpl-uc7)為宿主，異源表達密碼子優化的衣康酸合成途徑，過表達細胞質順烏頭酸酶基因aco，獲得樹幹畢赤酵母衣康酸合成菌株，並在發酵培養基中高效發酵木糖生產衣康酸的方法。

背景技術：

衣康酸作為一種重要的c5二羧酸化合物，被美國能源部列為二十一世紀有限發展的12中平臺化合物之一，可廣泛應用於化工、醫藥、農業等領域，具有極其廣闊的市場和應用價值。衣康酸的生產方法有微生物發酵粉和化學合成法。化學合成法又可分為檸檬酸合成法和順酐合成法，因檸檬酸合成法生產成本較高，工業上已不再採用，而順酐法雖然生產成本低、選擇性高，但未實現工業化。而生物發酵粉因原料易得，工藝技術成熟等優點成為國內外工業化生產衣康酸的主導方法。現階段，微生物發酵生產衣康酸的工程菌株主要是土麴黴類aspergillusterreus。然而，由於土麴黴類的複雜生長形態，限制了發酵過程的可控性和工業化規模；同時由於該絲狀真菌的特異性重組頻率低，基因工程手段在其菌種改造方面仍很困難，這些因素限制了衣康酸產量的進一步提高。近年來，採用合成生物學，使用非麴黴菌生物合成衣康酸的研究得到了廣泛發展。利用大腸桿菌、穀氨酸棒桿菌及酵母菌等模式菌株為宿主，異源表達衣康酸合成途徑，用葡萄糖或甘油為碳源經發酵後衣康酸產量達到0.17-7.8g/l(trinhct(2012)elucidatingandreprogrammingescherichiacolimetabolismsforobligateanaerobicn-butanolandisobutanolproduction.appl.microbiol.biotechnol.95(4):1083-1094)。然而，以木糖等價格更為低廉的原料為碳源，採用合成生物菌株發酵生產衣康酸的研究未見報導。

作為木質纖維素的重要組成部分，木糖在總的單糖中能佔到30％，因此高效利用木糖生產目標代謝物是發展生物質經濟的關鍵問題之一。自然中存在能夠天然代謝木糖的微生物，如樹幹畢赤酵母具有寬廣的碳源代謝能力，能高效代謝木糖，同時具有耐低ph和高糖等優點。利用樹幹畢赤酵母發酵木糖產乙醇、富馬酸已見報導(trinhct(2012)elucidatingandreprogrammingescherichiacolimetabolismsforobligateanaerobicn-butanolandisobutanolproduction.appl.microbiol.biotechnol.95(4):1083-1094)。這些結果為利用該菌株發酵木糖合成衣康酸奠定了理論基礎和操作平臺。

本發明首次以樹幹畢赤酵母(pichiastipitisfpl-uc7)為宿主，異源表達經密碼子優化的來源於土麴黴的順烏頭酸脫羧酶基因cad，構建衣康酸合成途徑，並過表達宿主菌的細胞質順烏頭酸酶基因aco。獲得了樹幹畢赤酵母衣康酸合成菌株，並在發酵培養基中高效發酵木糖生產衣康酸。

技術實現要素：

本發明提供了一種基於樹幹畢赤酵母合成菌株發酵木糖生產衣康酸的構建方法。採用具有天然木糖代謝能力的樹幹畢赤酵母pichiastipitisfpl-uc7為宿主，異源表達經密碼子優化的來自土麴黴的順烏頭酸脫羧酶cad，進一步過表達樹幹畢赤酵母fpl-uc7細胞質順烏頭酸酶aco，獲得了樹幹畢赤酵母衣康酸合成菌株。本發明構建過表達cad和aco基因的生產衣康酸工程菌株方法，對開發生物質生產衣康酸具有現實意義和指導價值。本發明採用如下技術方案。

本發明的技術方案如下：

一種基於樹幹畢赤酵母合成菌株發酵木糖生產衣康酸的構建方法；以樹幹畢赤酵母pichiastipitisfpl-uc7為宿主菌株，異源表達cad基因和過表達aco基因，其構建步驟如下：

(1)密碼子優化土麴黴cad基因，並進行全基因合成；

(2)設計樹幹畢赤酵母定位細胞質的aco基因引物；

(3)以樹幹畢赤酵母fpl-uc7基因組dna為模板，擴增aco基因片段；

(4)建立連入cad和aco編碼基因的過表達載體py26tef-gpd-ia1；

(5)電轉化過表達載體py26tef-gpd-ia1到樹幹畢赤酵母fpl-uc7感受態細胞，對轉化菌株進行木糖補料發酵實驗。

所述步驟(1)cad基因擴增引物序列

cad-f5』-cgcggatcccggtgttacctctgagatctgtcac-3』(bamhi酶切位點)

cad-r5』-ccggaattcatggagacttaacagggcagttcaa-3』(ecori酶切位點)。

所述步驟(2)aco基因擴增引物序列

aco-f5』-atttgcggccgcctcagaactgctgtcaga-3』(noti酶切位點)

aco-r5』-tccgtcgacgatcaatgctcgtca-3』(sacii酶切位點)。

所述步驟(4)將全基因合成的cad基因擴增後，用bamhi-ecori雙酶切，與同樣用bamhi-ecori雙酶切的py26tef-gpd質粒連接，獲得質粒py26tef-gpd-cad；將質粒py26tef-gpd-cad和aco基因分別用noti-sacii雙酶切，連接後即獲得過表達質粒py26tef-gpd-ia1。

所述步驟(5)將過表達載體質粒擴增提純後，採用電轉化方法轉入宿主菌株，通過尿嘧啶營養缺陷型固體平板篩選，篩選獲得發酵木糖生產衣康酸的樹幹畢赤酵母合成菌株，然後對該合成菌株進行發酵試驗，檢測衣康酸產量。

所述木糖補料發酵條件為：1.5vvm通氣量、100-400rpm保證溶氧量不低於10％，ph恆定維持6.5，發酵72h補加60ml的無菌500g/l木糖溶液。

所述發酵培養基組成為：木糖20-40g/l，無氨基酵母氮源(ynb)1-2g/l，尿素1-3g/l。

本發明的樹幹畢赤酵母pichiastipitisfpl-uc7為荷蘭微生物保藏中心pichiastipitiscbs6054，尿嘧啶營養缺陷型衍生菌株。

發酵木糖生產衣康酸工程菌株構建步驟詳細說明如下：

(1)根據ncbi報導的土麴黴cad(genbankaccessionno.ab326105.1)基因的dna序列，設計pcr擴增引物cad-f/r，cad基因序列經密碼子優化後進行全基因合成；

(2)根據ncbi報導的樹幹畢赤酵母aco(genbankaccessionno.xm_001386043)基因的dna序列，利用在線工具mitoprot(http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)預測線粒體定位序列，並設計定位細胞質的pcr擴增引物aco-f/r；

(3)以樹幹畢赤酵母fpl-uc7基因組dna為模板，擴增定位於細胞質的aco基因片段；

(4)建立連入cad和aco編碼基因的過表達載體py26tef-gpd-ia1，熱激轉化到大腸桿菌dh5α感受態細胞，在氨苄青黴素抗性平板上篩選陽性轉化子，進行pcr和雙酶切驗證，並進行重組質粒py26tef-gpd-ia1的擴增提取；

(5)電轉化過表達載體py26tef-gpd-ia1到樹幹畢赤酵母fpl-uc7感受態細胞，在尿嘧啶營養缺陷型固體平板上(轉化子篩選培養基)篩選陽性轉化子，進行pcr和雙酶切驗證，對驗證正確的轉化子進行3l發酵罐補料發酵試驗，檢測衣康酸的產量。

pcr引物序列為：

(1)cad基因擴增引物序列

cad-f5』-cgcggatcccggtgttacctctgagatctgtcac-3』(bamhi酶切位點)

cad-r5』-ccggaattcatggagacttaacagggcagttcaa-3』(ecori酶切位點)

(2)aco基因擴增引物序列

aco-f5』-atttgcggccgcctcagaactgctgtcaga-3』(noti酶切位點)

aco-r5』-tccgtcgacgatcaatgctcgtca-3』(sacii酶切位點)

將全基因合成的cad基因擴增後，用bamhi-ecori雙酶切，與同樣用bamhi-ecori雙酶切的py26tef-gpd質粒連接，獲得質粒py26tef-gpd-cad；將質粒py26tef-gpd-cad和aco基因分別用noti-sacii雙酶切，連接後即獲得過表達質粒py26tef-gpd-ia1，重組質粒py26tef-gpd-ia1構建圖譜見附圖。將過表達載體質粒擴增提純後，採用電轉化方法轉入宿主菌株，通過尿嘧啶營養缺陷型固體平板(轉化子篩選培養基)篩選，篩選獲得發酵木糖生產衣康酸的樹幹畢赤酵母合成菌株，然後對該合成菌株進行發酵試驗，檢測衣康酸產量。

本發明利用合成生物學手段在樹幹畢赤酵母中pichiastipitisfpl-uc7實現衣康酸合成途徑及優化，成功構建了發酵木糖生產衣康酸的工程菌株。採用本發明基因工程菌進行衣康酸3l發酵罐補料發酵實驗，衣康酸合成產量達到了1.52g/l。本發明構建的樹幹畢赤酵母合成菌株在利用合成生物學高效發酵生物質生產衣康酸中發揮重大的作用，具有重大的潛力和廣闊的應用價值。

附圖說明

圖1：構建重組質粒py26tef-gpd-ia1圖譜。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明進行說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，本領域的專業人員按照本發明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應當視為在本發明的範圍內，本發明的範圍和實質有權利要求來限定。

本發明利用合成生物學的研究手段，以樹幹畢赤酵母中pichiastipitisfpl-uc7為宿主，異源表達衣康酸合成途徑：來自土麴黴的順烏頭酸脫羧酶基因cad，優化順烏頭酸酶基因aco，構建cad和aco雙基因的過表達載體py26tef-gpd-ia1，將其電轉化轉入宿主菌株，並對轉化子進行分批補料發酵木糖生產衣康酸實驗。

材料：

1.樹幹畢赤酵母pichiastipitisfpl-uc7(荷蘭微生物保藏中心pichiastipitiscbs6054，尿嘧啶營養缺陷型衍生菌株)

2.taqdna聚合酶(天根生化科技有限公司，中國北京)。

3.t4連接酶以及bamhi、ecori、noti、sacii等限制性內切酶(fermentas公司產品，中國上海)。

4.質粒抽提試劑盒(天根生化科技有限公司，中國北京)。

5.dna純化回收試劑盒(天根生化科技有限公司，中國北京)。

6.dna凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司，中國北京)。

7.氨苄青黴素、尿嘧啶(sigma公司)。

8.lb液體培養基(g/l)：蛋白腖10，酵母浸粉5，氯化鈉10。

9.lb固體培養基(g/l)：蛋白腖10，酵母浸粉5，氯化鈉10，瓊脂粉20。

10.轉化子篩選培養基(g/l)：葡萄糖20，無氨基酵母氮源(ynb)13，瓊脂粉20。

11.種子培養基(g/l)：木糖20，酵母提取物10，胰蛋白腖20，ph6.5。

12.發酵培養基(g/l)：木糖20-40，無氨基酵母氮源(ynb)1-2，尿素1-3，ph6.5。

實施例一：雙基因表達載體py26tef-gpd-ia1的構建及轉化子獲得

(1)根據ncbi報導的土麴黴cad(genbankaccessionno.ab326105.1)基因的dna序列，設計pcr擴增引物cad-f/r，cad基因序列經密碼子優化後進行全基因合成。以全合成基因cad為模板，設計引物cad-f/r進行pcr擴增(cad-f5』-cgcggatcccggtgttacctctgagatctgtcac-3』(bamhi酶切)，cad-r5』-ccggaattcatggagacttaacagggcagttcaa-3』(ecori酶切))。將cad基因擴增片段純化、酶切、回收後，與相應酶切的py26tef-gpd質粒連接，轉化dh5α大腸桿菌感受態細胞，在氨苄青黴素抗性平板上篩選陽性轉化子，提取質粒，採用限制性內切酶bamhi和ecori進行雙酶切驗證，雙酶切後經瓊脂糖凝膠電泳獲得1.5kb左右的酶切片段，命名為py26tef-gpd-cad，對轉化子cad基因進行測序，序列為seqno.1。

(2)根據ncbi報導的樹幹畢赤酵母aco(genbankaccessionno.xm_001386043)基因的dna序列，利用在線工具mitoprot(http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)預測線粒體定位序列，設計定位細胞質的pcr擴增引物aco-f/r，aco-f5』-atttgcggccgcctcagaactgctgtcaga-3』(noti酶切)，aco-r5』-tccgtcgacgatcaatgctcgtca-3』(sacii酶切)。

(3)以樹幹畢赤酵母fpl-uc7提取的基因組為模板，以aco-f/r為引物pcr擴增定位細胞質的aco基因片段，將所得的pcr產物經0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小為分別為2.5kb左右的aco基因電泳條帶。

(4)將aco基因擴增片段純化、酶切、回收後，與相應酶切的py26tef-gpd-cad質粒連接，轉化dh5α大腸桿菌感受態細胞，在氨苄青黴素抗性平板上篩選陽性轉化子，提取質粒，採用限制性內切酶noti和sacii進行雙酶切驗證，雙酶切後經瓊脂糖凝膠電泳獲得2.5kb左右的酶切片段，對轉化子aco基因進行測序，序列為seqno.2，實驗表明獲得了插入序列正確的重組質粒，命名為py26tef-gpd-ia1。

雙酶切體系：dna片段15μl，bamhi/noti1μl，ecori/sacii1μl，10×buffer5μl，ddh2o28μl，37℃反應2h。

連接體系：酶切後的目的基因片段12μl，質粒載體片段7.5μl，t4連接酶0.5μl，22℃反應2h。

(5)將樹幹畢赤酵母fpl-uc7感受態細胞與質粒py26tef-gpd-ia1的混合液(8μl質粒、80μl感受態細胞)轉移到預冷的2mm電轉杯中，然後用啟動電轉儀進行轉化(轉化條件：電壓1500v，電容2μf，電阻200ω，電擊4-5ms)，電擊完畢後立即加入1ml預冷的1mol/l的山梨醇溶液混勻復甦電擊後的感受態細胞，然後轉至無菌的1.5ml離心管中，30℃水浴鍋孵育2h，5000rpm離心30s，吸去部分上清液剩餘約200μl，吹吸重懸，塗布轉化子篩選培養基平板，30℃培養3-5天待轉化子長出，進行酶切和pcr驗證。驗證正確後的菌株為能利用木糖發酵衣康酸的樹幹畢赤酵母合成菌株。

實施例二：樹幹畢赤酵母合成菌株利用木糖生產衣康酸的分批補料發酵實驗(一)

(1)培養基

種子液體培養基(g/l)：木糖20，酵母提取物10，胰蛋白腖20，ph6.5。

發酵培養基(g/l)：木糖20，無氨基酵母氮源(ynb)1.0，尿素1.0，ph6.5。

(2)分批補料發酵實驗：挑取平板活化的樹幹畢赤酵母單菌落接種至種子培養基，30℃、200rpm條件下搖瓶培養48小時，離心收集菌體，用新鮮發酵培養基重懸菌體，再以5％接種量接種至發酵培養基中，在3l發酵罐中發酵5-7天。發酵條件：1.5vvm通氣量、100-400rpm保證溶氧量不低於10％，ph恆定維持6.5，發酵72h補加60ml的無菌500g/l木糖溶液。

(3)衣康酸含量的測定：發酵過程中間隔24h，吸取10ml發酵液，5000rpm離心10min，取上清液進行0.22μl有機濾膜過濾，利用高效液相色譜(hplc)進行樣品檢測分析。hplc檢測條件：色譜柱為aminexhpx-87h(bio-rad,hercules,ca,usa)，流動相為15％甲醇+85％5mmol/l的稀硫酸，流速為0.8ml/min，柱溫為40℃，210nm處紫外檢測。測定結果表明：本發明構建獲得的樹幹畢赤酵母合成菌株發酵木糖生產衣康酸的產量達到了1.2g/l。

實施例三：樹幹畢赤酵母合成菌株利用木糖生產衣康酸的分批補料發酵實驗(二)

(1)培養基

種子液體培養基(g/l)：木糖20，酵母提取物10，胰蛋白腖20，ph6.5。

發酵培養基(g/l)：木糖30，無氨基酵母氮源(ynb)1.5，尿素2.0，ph6.5。

(2)分批補料發酵實驗：挑取平板活化的樹幹畢赤酵母單菌落接種至種子培養基，30℃、200rpm條件下搖瓶培養48小時，離心收集菌體，用新鮮發酵培養基重懸菌體，再以5％接種量接種至發酵培養基中，在3l發酵罐中發酵5-7天。發酵條件：1.5vvm通氣量、100-400rpm保證溶氧量不低於10％，ph恆定維持6.5，發酵72h補加60ml的無菌500g/l木糖溶液。

(3)衣康酸含量的測定：發酵過程中間隔24h，吸取10ml發酵液，5000rpm離心10min，取上清液進行0.22μl有機濾膜過濾，利用高效液相色譜(hplc)進行樣品檢測分析。hplc檢測條件：色譜柱為aminexhpx-87h(bio-rad,hercules,ca,usa)，流動相為15％甲醇+85％5mmol/l的稀硫酸，流速為0.8ml/min，柱溫為40℃，210nm處紫外檢測。測定結果表明：本發明構建獲得的樹幹畢赤酵母合成菌株發酵木糖生產衣康酸的產量達到了1.5g/l。

實施例四：樹幹畢赤酵母合成菌株利用木糖生產衣康酸的分批補料發酵實驗(三)

(1)培養基

種子液體培養基(g/l)：木糖20，酵母提取物10，胰蛋白腖20，ph6.5。

發酵培養基(g/l)：木糖40，無氨基酵母氮源(ynb)2.0，尿素3.0，ph6.5。

(2)分批補料發酵實驗：挑取平板活化的樹幹畢赤酵母單菌落接種至種子培養基，30℃、200rpm條件下搖瓶培養48小時，離心收集菌體，用新鮮發酵培養基重懸菌體，再以5％接種量接種至發酵培養基中，在3l發酵罐中發酵5-7天。發酵條件：1.5vvm通氣量、100-400rpm保證溶氧量不低於10％，ph恆定維持6.5，發酵72h補加60ml的無菌500g/l木糖溶液。

(3)衣康酸含量的測定：發酵過程中間隔24h，吸取10ml發酵液，5000rpm離心10min，取上清液進行0.22μl有機濾膜過濾，利用高效液相色譜(hplc)進行樣品檢測分析。hplc檢測條件：色譜柱為aminexhpx-87h(bio-rad,hercules,ca,usa)，流動相為15％甲醇+85％5mmol/l的稀硫酸，流速為0.8ml/min，柱溫為40℃，210nm處紫外檢測。測定結果表明：本發明構建獲得的樹幹畢赤酵母合成菌株發酵木糖生產衣康酸的產量達到了1.3g/l。

seqno.1

cad

ggatccatgaccaaacaatctgctgactccaacgccaagtccggtgttacctctgagatctgtcactgggcctctaatttggccactgacgacatcccatccgatgtcttggagagagctaagtacttgattttggacggaatcgcctgtgcctgggttggtgccagagtcccatggtctgagaaatacgtccaggccactatgtccttcgaaccaccaggagcttgcagagtcattggttacggtcagaaacttggtccagtcgctgctgctatgaccaactctgcctttatccaggccaccgagttggacgactaccattccgaagccccacttcattctgcctccatcgttttgcctgctgtcttcgctgcctccgaagttttggctgaacaaggtaagactatttccggtatcgacgttattttggccgccatcgtcggttttgagtccggtccaagaatcggtaaggccatctacggttccgacttgttgaacaatggttggcactgtggtgctgtttacggtgctccagctggagctttggccaccggtaagttgttgggtttgactcctgactccatggaagatgccttgggtatcgcttgtacccaagcctgtggtttgatgtctgcccagtacggtggtatggttaagcgtgtccaacacggattcgccgccagaaacggtttgttgggtggattgttggctcatggtggttacgaagccatgaagggtgtcttggagcgttcctacggtggtttcttgaagatgtttaccaagggtaacggacgtgagcctccatacaaggaagaagaggtcgtcgctggattgggttctttctggcacacttttactatcagaatcaaactttacgcttgttgcggattggttcacggaccagttgaggccatcgaaaacttgcagggtcgttaccctgagttgcttaacagagccaacttgtccaacattagacacgtccacgtccagttgtccactgcttccaactcccactgtggttggattcctgaggagagaccaatttcctctattgccggtcagatgtccgtcgcctatatcttggctgttcaattggtcgaccagcagtgcttgttgtctcagttctccgagttcgacgacaacttggagagaccagaggtttgggacttggccagaaaggtcacctcctctcaatccgaggagttcgaccaggatggtaactgcttgtctgctggtcgtgtcagaatcgagttcaacgacggttcctccattaccgagtccgttgagaagcctcttggtgtcaaggagcctatgcctaacgaaagaattttgcacaagtacagaaccttggccggttctgttaccgacgagtctagagtcaaggagatcgaagatttggttttgggtttggacagattgaccgatatttccccacttcttgagttgttgaactgccctgttaagtctccattggttgaattc

seqno.2

aco

ctcagaactgctgtcagagccccacgctctatccgtgggttggccactgctggcttgaccagagactcccaagtgaaccagaacttgttggaatctcactctttcatccaatacaagaagcaactcgagaacctcgacatcgtcaaggccagattgaacagacctttgacttatgccgaaaagcttctctacggtcacttggacgaccctcacggacaagacatccagagaggtgtctcctacttgaagttgagaccagatcgtgtcgcttgtcaagatgccaccgctcaaatggccattttgcaattcatgtctgccggtttgcctcaagttgccactccttccactgtccactgtgaccatttgatccaggcccaaattggtggtgctaaggatttggccagagctattgacttgaacaaggaagtgtacgacttcttgtcgactgcctgtgccaaatacaacttgggtttctggaagcccggttccggtatcatccatcagatcgtattggaaaactacgccttcccaggtgctttgttgatcggtaccgattcgcacactcctaatgctggtggtttgggtcaattggctattggtgtaggtggtgctgatgccgtcgacgtcatggccgacttggcctgggaattgaaggctccaaagatcattggtgtcaagttgaccggtagaatgtccggctggacctcgccaaaggatatcatcttgaagttggctggtatcaccactgtcaagggtggtaccggttccattgttgaatacttcggttctggtgttgaaaccttctcctgtaccggtatgggtaccatctgtaacatgggtgccgaaattggtgctaccacctctgtcttcccattcaacaactccatggttgactatttgaatgccactggtagatccaacattgccgagtttgccaacttgtacaagaaggactacttgtctgccgacgaaggctgtgaatacgaccaagtcattgaaatcgacttgaacaccttggaaccacacattaacggtcctttcaccccagatttggctactccagtctccaagatgaaggaaactgccatcaagaacggctggccattggaagtcaaggttggtttgattggttcttgtaccaactcttcttacgaagatatgaccagagctgcttctattattgaagacgctgccacccatggcttgaagtccaaggctatctacactgtttctcctggttctgaacaagtcagagccaccattgccagagacggtcaattgaagaccttcgaagactttggcggtgttgtcatggccaacgcctgtggtccatgtatcggtcaatgggacagacaagacattaagaagggtgacaagaacaccattgtgtcttctttcaacagaaatttcactgctagaaacgacggtaatccagccactcacgctttcgtcgcttctccagaaatgaccactgctttcgccatctccggtgacttgggtttcaacccaattaccgacaccttgaaggacgctaacggaaacgagttcaagttgaaggaaccagttggtgttggtttaccagttaacggctacgaccctggtgaaaacacctaccaagctccacctgaagacagatcaacagtccaagtgcaaattgccccaacctccgacagattacaaaagttgactcctttcaagccatgggacggtaaggatgccgaaagattaccaatcttaatcaaggccgttggtaagaccacaaccgatcatatttctatggccggtccatggttgaagtaccgtggtcacttggaaaacatctccaacaactacatgattggtgctatcaacgctgaaaacggtgaagccaacaacgtcaagaaccactacactggtgtatactctggtgttccagacactggtgctgcttacagagatgctggccacaagtgggttgttattggtgacgaaaacttcggtgaaggttcttccagagaacacgctgccttggaaccaagattcttgggtggtttcgctatcatcaccaagtccttcgctcgtattcacgaaaccaacttgaagaagcaaggtttgttaccattgaacttcactgacgttgctgcctacgacaaaatccaaccagaagacgaagtagacttgctcggtttgactgaattggcccctggcaagaacgttattctcagagtccacccagctgacggttctgccacctgggaaaccgaattgtctcacacttacaacattgaacaaattgaatggttcaagtacggttccgctttgaacaagatggctgccgttgctgctgaaaagaagtaagtgatgtcttgagaggaaatagttaagtatcatttctttttgtttacctattaacattcattcgtatttatttattcattattataatatgtactttgtttaaatgacgagcattgatc