一種快速檢測黃麴黴毒素含量的方法

2023-04-23 00:23:21

專利名稱：：一種快速檢測黃麴黴毒素含量的方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物含量的測定方法，確切地說是一種農副產品中黃麴黴毒素含量的快速測定方法。二
背景技術：
：黃麴黴毒素(Aflatoxin)是常見麴黴菌黃麴黴(AspergiUusflavus)和寄生曲(」parasiticus)中產毒菌株的代謝產物。主要毒素是B1、B2、Gl和G2,其中B1是毒性和危害最大的一種。黃麴黴毒素是目前所知致癌性最強的化合物，廣泛存在於花生、花生油、大米、玉米、糕點等糧油食品和動物飼料中,嚴重影響人們的健康，甚至威脅著人們的生命安全。我國是世界上的花生主產和出口國之一，國內的一些花生進出口企業，往往由於報檢通關手續繁雜，造成成品花生在倉庫積壓，而在花生貯藏過程中往往由於管理不善或者天氣等原因，易受到微生物汙染造成質量嚴重下降。國外有些國家對於花生等農產品的檢測標準也趨見苛刻。目前,為滿足出入境檢驗檢疫的需要,各國採取的檢測黃麴黴毒素的方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯免疫吸附法(ELISA)、免疫親和柱淨化螢光光度法、免疫親和柱淨化高效液相色譜法、多功能柱色譜淨化高效液相色譜法等，這些方法一般操作比較複雜、檢測時間長、檢測結果不夠精確。而更為快速精確的液相-串聯質譜聯用檢測法(LC-MS/MS)卻鮮有報導，本研究就利用LC-MS/MS法檢測花生樣品中的黃麴黴毒素含量。三
發明內容本發明旨在提供一種快速測定農副產品中黃麴黴毒素含量的方法。所要解決的技術問題是建立高效液相色譜和質譜串聯使用系統(LC-MS/MS)。本發明的技術方案首先將原料(農副產品)粉碎，然後萃取、過濾，濾液經純化後進行檢測，以花生為例，具體過程如下1、取50g粉碎後過篩樣品和5g氯化鈉轉移到乾淨的均質器中，加入100ml80%甲醇水溶液(80:20)高速均質lmin。將其過濾，至少留濾液10ml，用20ml去離子水稀釋5ml萃取液並徹底混合，再用玻璃纖維濾紙過濾，取濾液。2、將10ml無菌注射器接於免疫親和柱上部，取10ml已稀釋的萃取液以1-2滴/S的速度通過免疫親和柱，再用2ml去離子水洗柱，最後用lml甲醇洗脫並將洗脫液收集於乾淨的比色皿或其他容器中待用。3、色譜條件的選擇色譜柱WatersSymmetryC18柱(2.1x150mm,3.5fmi);流動相A:10mM乙酸水溶液；流動相B:100%甲醇；柱溫40°C;流速0.2~lml/min;梯度程序B在0min為50%，在010min增至90X,在1015min從90%降低為50%。4、質譜條件的優化本研究離子化模式採用電噴霧(ESI)正離子模式,通過全離子掃描(Fullscan)確定AFB卜AFB2的選擇離子,豐度最高的碎片是含Na離子的化合物AFB!對應335.2m/z、AFBz對應337.2m/z、。對質譜條件進行優化氣簾氣(CUR)10~30ml/min、離子化電壓(IS)4500V、霧化氣(GSl)1030ml/min、輔助霧化氣(GS2)30~40ml/min、輔助加熱器溫度(TEM)450°C。本方法對5份脫皮花生仁樣品進行了黃麴黴毒素含量檢測，結果見表1。TablelLC-MS/MS測脫皮花生仁樣品中黃麴黴毒素含量結果sampleAFTBl(ug/kg)AFTB2(ug/kg)0.28nd10.290.29±0.00440.30nd1.420.451.421.42±0.00250.430.43±0.01031.430.420.960.1330.970.96±0.00250.150.13±0.01190.960.110.26nd40.260.25±0.0071nd0.24nd0.560.120.560.56±0.00090.120.12±0扁90.560.12本方法提取和淨化過程使用的是甲醇，減少了對試驗人員的傷害，同時檢測花生中的黃麴黴毒素B!、B2，檢測限分別為0.15pg/kg、0.09itig/kg回收率為84.3%107.5%，相對標準偏差為5.3%9.7%。本發明具有簡便、快捷、精密、準確的特點，為農副產品中黃麴黴毒素含量檢測提供方便可靠的檢測手段。四圖1是黃麴黴毒素B"B2總的離子流色譜圖，在20min內出峰順序為AFB2、AFB^分離效果好。圖2是黃麴黴毒素B"B2的選擇離子(SIM)色譜圖。就是選擇離子(SIM)條件下的色譜圖圖3是LC-MS/MS測黃麴黴毒素B^示準曲線。圖4是LC-MS/MS測黃麴黴毒素B2標準曲線。五具體實施例方式現以花生為例，非限定實施例敘述如下1、實驗原料與試劑1.1主要原料與試劑花生，取自於安徽凱利糧油食品有限公司，黃麴黴毒素B1和B2，甲醇和乙腈均為色譜純，乙酸為分析純(AR)。2、試驗方法2.l樣品的準備粉碎好的樣品過20目篩並在取樣前徹底混合，不立即分析的樣品應放在冰箱中儲存。取50g過篩樣品和5g氯化鈉轉移到乾淨的均質器中，加入100ml8(^甲醇水溶液(80:20)高速均質lmin。將其過濾，至少留濾液lOml，用20ml去離子水稀釋5ml萃取液並徹底混合，再用玻璃纖維濾紙過濾，取濾液。2.2樣品預處理將100ml無菌注射器接於免疫親和柱上部，取10ml已稀釋的萃取以1-2滴/S的速度通過免疫親和柱，再用2ml去離子水洗柱，最後用lml甲醇洗脫並將洗脫液收集於乾淨的比色皿或其他容器中待用。2.3色譜條件的選擇色譜柱WatersSymmetryC18柱(2.1x150mm,3.5nm);流動相A:10mM乙酸水溶液；流動相B:100%甲醇；柱溫4(TC;流速0.2-1ml/min;梯度程序B在0min為50X，在010min增至90X，在1015min從90%降低為50%。2.4質譜條件的優化本研究離子化模式採用電噴霧(ESI)正離子模式,通過全離子掃描(Fullscan)確定AFB!、AFB2的選擇離子，豐度最高的碎片是含Na離子的化合物AFBi對應335.2m/z、AFB2對應337.2m/z、。對質譜條件進行優化氣簾氣(CUR)10~30ml/min、離子化電壓(IS)4500V、霧化氣(GS1)1030ml/min、輔助霧化氣(GS2)30~40ml/min、輔助加熱器溫度(TEM)450°C。2.5精密度與回收率實驗取同一花生樣品，按2.1的步驟處理樣品,分析並測定其精密度及回收率。結果見表2。表2C-MS/MS法測定黃麴黴毒素的回收率及精密度tableseeoriginaldocumentpage6實驗結果顯示其回收率在84.3%到107.5%之間，平均回收率為94.9%，其精密度為5.3%到9.8%，平均精密度為8.1%，充分表明這種方法準確可靠。2.6標準曲線及檢出限準確吸取不同濃度的黃麴黴毒素混合標準工作溶液10pL，HPLC-MS/MS分析,分別以黃麴黴毒B卜B2、GhG2的峰面積對樣品的濃度進行線性回歸分析,即得標準曲線;按信噪比S/N>3:1時溶液濃度計,可得黃麴黴毒B"B2、G卜G2的檢出限。結果見圖3、圖4和表3。表3LC-MS/MS法黃麴黴毒素的回歸方程及檢出限黃麴黴素回歸方程相關係數檢出限RegressionequeationCorrelationcoefficientLimitofdetactio'n(ng)Bly=432.92x+2032.70.99940.15B2y=471.9x-53640.99180.09權利要求1、一種快速檢測黃麴黴毒素含量的方法，包括農副產品原料的粉碎、80％甲醇溶液萃取、過濾和免疫親和柱純化以及檢測，其特徵在於所述的檢測是液相色譜串聯質譜聯用檢測法，液相色譜檢測條件色譜柱WatersSymmetryC18柱(2.1×150mm，3.5μm)；流動相A10mM乙酸水溶液；流動相B100％甲醇；柱溫40℃；流速0.2～1ml/min；梯度程序B在0min為50％，在0～10min增至90％，在10～15min從90％降低為50％；質譜檢測條件採用電噴霧(ESI)正離子模式，通過全離子掃描(Fullscan)確定AFB1、AFB2的選擇離子，氣簾氣(CUR)10～30ml/min、離子化電壓(IS)4500V、霧化氣(GS1)10～30ml/min、輔助霧化氣(GS2)30～40ml/min、輔助加熱器溫度(TEM)450℃。全文摘要一種快速檢測黃麴黴毒素含量的方法，包括農副產品的粉碎、萃取和純化以及檢測，所述的檢測是色-質聯用檢測法，色譜條件色譜柱WatersSymmetryC18柱(2.1×150mm，3.5μm)；流動相A10mM乙酸水溶液；流動相B100％甲醇；柱溫40℃；流速0.2~1ml/min；梯度程序B在0min為50％，在0～10min增至90％，在10～15min從90％降低為50％；質譜條件採用電噴霧(ESI)正離子模式，通過全離子掃描(Fullscan)確定AFB1、AFB2的選擇離子，氣簾氣(CUR)10～30ml/min、離子化電壓(IS)4500V、霧化氣(GS1)10～30ml/min、輔助霧化氣(GS2)30～40ml/min、輔助加熱器溫度(TEM)450℃。本發明具有簡便、快捷、精密、準確的特點。文檔編號G01N30/00GK101655480SQ20091014422公開日2010年2月24日申請日期2009年7月24日優先權日2009年7月24日發明者孟凡莉,易苗苗,毅楊,潘丙南,範遠景,謝慧明,偉陳,高海成,黃文東申請人:合肥工業大學