一種stat3抑制劑-egcg在結腸癌治療方面的應用的製作方法
2023-04-22 18:31:16 1
一種stat3抑制劑-egcg在結腸癌治療方面的應用的製作方法
【專利摘要】Stat3信號傳導系統調控異常普遍存在於癌變細胞株中，本發明提供了一種化合物EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)是有效的Stat3的抑制劑，能夠應用於含有內源性激活的Stat3信號通道的癌症治療藥物的製備中。
【專利說明】—種STAT3抑制劑-EGCG在結腸癌治療方面的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種信號傳導系統抑制劑化合物在製備治療結腸癌藥物方面的應用。【背景技術】
[0002]據WHO統計，全世界惡性腫瘤每年發病1100多萬人，病死800多萬人，發達國家腫瘤年發病率高於300/10萬。新中國成立初期，惡性腫瘤僅佔死因的第9-10位，到20世紀70年代上升到第3位。據國家衛生資料統計，近兩年來我國城市居民惡性腫瘤佔死亡原因的第I位且每年新增患者約220萬人。WHO不久前在日內瓦發表最新《世界癌症報告》說，到2020年，全球癌症發病率可能比現在增長50%以上，新增腫瘤患者將達2000萬人。
[0003]STAT3 (signal transducer and activator of transcription-3, STAT3)即細胞信號轉導和轉錄激活因子3是一種將細胞外信號轉運至核內的轉錄因子，可被磷酸化而激活，成為活化的STAT3即P-STAT3，參與細胞的生長，增殖，凋亡等一系列重要的病理生理過程，正常信號轉導中STATs的激活是快速而短暫的，Stat3的激活對於細胞的生長、凋亡、細胞周期的調控都有重要的影響，而Stat3自身又受到細胞內多種信號轉導途徑的調控。
[0004]Stat3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通道匯集的焦點，在多種腫瘤細胞和組織中都有過度激活，如乳腺癌、頭頸癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌和各種白血病等。Stat3激活後誘導上述與細胞增殖、分化、生存、凋亡密切相關的關鍵基因的異常表達，通過各種途徑促進細胞增殖、惡性轉化，阻礙細胞凋亡，表現出致癌作用，因此Stat3已被認為是一種癌基因。
[0005]儘管Stat3參-與正常細胞因子信號的調節，但在越來越多的腫瘤細胞中發現了 Stat3的持續高表達,而且有證據顯示Stat3參與了腫瘤的形成,表明Stat3有可能成為腫瘤治療中一個新靶點，以下簡要介紹在試驗治療中阻斷STAT3信號通路方面取得的進展。(I).酪氨酸激酶抑制劑:針對STAT3信號途徑上遊酪氨酸激酶如JAK，Src, EG FR的抑制劑已經研究成功，部分已進入臨床各期試驗，AG490是酪氨酸激酶選擇性抑制劑，可以阻斷JAK激酶活性，進而影響STAT3激活，從而顯著抑制表皮細胞的生長，誘導細胞的凋亡。(2).寡核苷酸:一種是反義寡核苷酸(antisense olig-onucleotide AS-0N),能與STAT3mRNA結合組合阻止STAT3的翻譯，另一種是誘館寡核苷酸(decoy oligonucleotide,Decoy ON)，指一段雙鏈寡核苷酸，它與STAT3靶基因啟動子反應元件中STAT3識別的特異性靶DNA序列相一致，能競爭性結合活化的STAT3，減少STAT3與特異性反應性元件的結合從而阻斷STAT3信號途徑。(3)RNA幹擾:RNA幹擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA(double strandedRNA, dsRNA)引發的轉錄後基因沉默機制(Postoranscriptionalgene silencing, PTGS),其機制可能是細胞內dsRNA在Dicer酶(dsRNA特異性核酸內切酶)的作用下，可形成22bp大小幹擾的小幹擾RNA (small interfering RNA, si RNA), si RNA可進一步摻入多部分核酸酶(multicomponent nuclease,KISC),並使其激活從而精確降解與SiRNA序列相同的mRNA，完全抑制了該基因在細胞內翻譯和表達，由於目前尚沒有合適的轉基因技術，RNAi在臨床治療上的應用有待於進一步研究。(4)顯性負性蛋白，一類是野生型顯性負性蛋白，另一類是突變性顯性負性蛋白。(5)受體拮抗劑:研究證實，多種細胞外信號通過細胞表面受體激活STAT3信號轉導通路，理論上應用此受體的拮抗齊！J就可以達到阻斷該受體活化而明顯抑制STAT3活化的目的。(6)其它:STAT3通過酪氨酸磷酸化而被激活，而蛋白磷酸酶可使活化狀態的STAT3去磷酸化，從而抑制STAT3活性，其中SHP是STAT3信號傳導通路持續激活，PIAS可以抑制STAT3活性而對此通路產生負調節作用。本發明是使用有機小分子EGCG與Stat3蛋白SH2功能域相互作用，阻斷Stat3磷酸化過程，從而抑制Stat3相關的信號傳導途徑。
【發明內容】
[0006]癌基因Stat3與結腸癌的發生、發展密切相關，Stat3信號通道的過度激活破壞了正常細胞的增殖、凋亡，能夠誘導出某些轉化細胞的特性，過度表達的Stat3調節了細胞周期和凋亡活動，阻斷Stat3信號通道也許能預防和治療人類腫瘤。在這項專利申請的內容中，我們用一系列生物實驗證明了表沒食子兒茶素沒食子酸酯-EGCG ( 一種Stat3小分子抑制劑)是能夠顯著抑制結腸癌細胞HCT116的生長。在體外實驗中EGCG能抑制結腸癌細胞的生長，促進其凋亡，並呈劑量依賴性。EGCG處理的結腸癌細胞能以劑量依賴性的方式下調磷酸化的Stat3蛋白的表達。因此我們認為EGCG是一種治療結腸癌的新方法。
[0007]本發明主要解決的技術問題是提供了一種信號傳導系統抑制劑化合物在製備治療結腸癌藥物方面的應用。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]圖1是EGCG呈劑量依賴性抑制結腸癌HCT-116細胞的生長。經不同濃度的EGCG處理48h後，HCT-116細胞生長受到不同程度的抑制。> IOym時，隨著藥物濃度的增加，抑制率逐漸降低；< IOym時，隨藥物濃度的增加，抑制率逐漸增高，呈現劑量依賴性關係。工作濃度為 10、20、40、80、160、320μmol/L的EGCG處理HCT-116細胞48h後，IOym 的 EGCG對細胞的生長有促進作用，其他濃度的抑制率分別為28.02% ±4.86%、19.34% ±32.97%、76.64% ±21.92%、91.67% ±4.29%,88.37% ±3.52%。
[0009]圖2是流式細胞儀測定不同濃度EGCG對細胞凋亡的影響。細胞在培養瓶中貼壁生長，呈多角形，在EGCG作用下，它們生長速度減慢，形態發生改變，部分細胞變圓，脫壁。用 40,80,160,320 μ mol/L EGCG 處理作用 48h 後，其凋亡率分別為 0.8%,3.3%,6.1%,44.1 %呈現濃度依賴性。
[0010]圖3是用20、40、80、160μmol/L不同濃度的EGCG處理HCT-116細胞24h後，細胞裂解並提取總RNA，然後合成cDNA並在PCR儀中進行擴增，將擴增好的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。隨著EGCG濃度的增加，癌基因的表達量呈減少趨勢，呈現劑量依賴性關係。
【具體實施方式】
[0011]為詳細說明本發明的技術內容、構造特徵、所實現目的及效果，以下結合實施方式並配合附圖詳予說明。
[0012]實施例1:MTT法測定EGCG對BEL-7402細胞增殖的影響
[0013]設對照組和加用EGCG組(10、20、40、80、160、320Hmol/LEGCG)，取對數生長期細胞，常規胰酶消化後用含10%胎牛血清DMEM培養液製成單細胞懸液，接種於96孔培養板，每孔100 μ L (含約5*103個細胞)，待細胞貼壁後去培養液並加藥，每組設3個復孔，另設3個調零孔(不加細胞，只加100 μ L培養液)，繼續培養48h。吸掉培養基並用PBS 150 μ L洗2遍，然後每孔加入MTT 10 μ L，4h後終止培養，棄上清液，每孔加入150 μ L的溶解液，置水平搖床上震蕩lOmin，在酶標儀(Tecan F200)上測490nm波長的吸光度(OD)值。IOym的EGCG對細胞的生長有促進作用，為26.21% ±46.99% ;20、40、80、160、320 μ M的EGCG對細胞的生長抑制率分別為 28.02% ±4.86%、19.34% ±32.97%、76.64% ±21.92%、91.67% ±4.29%,88.37% ±3.52%。(*Ρ < 0.05)
[0014]實施例2:流式細胞儀檢測EGCG誘導HCT-116細胞凋亡
[0015]取對數生長期細胞，常規胰酶消化後用含10%胎牛血清DMEM培
[0016]養液製成單細胞懸液，計數後種於六孔板中，每孔約含2 * IO5個細胞，待細胞貼壁後去培養液並加藥，分別加入2mL合有0、40、80、160、320pmol/L EGCG培養液，培養48h後，用不含EDTA的胰酶消化離心收集細胞，用冷的PBS洗滌細胞兩次。然後用400 μ LIXAnnexin V結合懸浮細胞,在細胞懸液中加入5 μ L Annexin V-FITC染色液,輕輕混勻後避光孵育15min，加入10 μ L PI染色液避光孵育5min，在Ih內用流式細胞儀(Accuri C6)檢測。
[0017]實施例3 =PCR技術檢測EGCG對HCT-116的易感基因的抑制作用取對數生長期細胞，常規胰酶消化後用含10%胎牛血清DM EM培養液製成單細胞懸液，計數後種於六孔板中，每孔約含2*105個細胞，待細胞貼壁後去培養液並加藥。分別加入2mL合有20、40、80、160 μ mol/LEGCG培養液，培養48h後，用不合EDTA的胰酶消化離心收集細胞，用冷的PBS洗滌細胞兩次。收集HCT-116細胞，裂解後提取總RNA，經試劑盒反轉錄合成cDNA後經PCR擴增。使用分光光度儀測量擴增好的RNA，取2 μ g總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳
[0018]以上所述僅為本發明的實施例，並非因此限制本發明的專利範圍，凡是利用本發明說明書及附圖內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的【技術領域】，均同理包括在本發明的專利保護範圍內。
【權利要求】
1.下列化學式的信號傳導系統抑制劑化合物一表沒食子兒茶素沒食子酸酯在製備治療結腸癌藥物方面的應用:
【文檔編號】A61P35/00GK103830225SQ201210490527
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月27日 優先權日:2012年11月27日
【發明者】徐學軍, 魏潔麟 申請人:上海曼克爾瑞生物醫藥技術有限公司