用PCR技術從人類全基因組Cosmid庫中篩選ApoAI可表達全基因的方法
2023-04-23 08:50:56
專利名稱：用PCR技術從人類全基因組Cosmid庫中篩選ApoAI可表達全基因的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，具體涉及一種用PCR技術從人類全基因Cosmid庫中篩選ApoAI可表達全基因的方法。
動脈粥樣硬化心腦血管疾病(如冠心病，中風)是中國和西方國家致死疾病中的主要殺手。其主要病因是高血清總膽固醇(Gordon etal.1981；Stamler et al.1986；Pooling Project Research Group 1978；Anderson etal.1987)。流行病學調查揭示，血清總膽固醇每增加1％，冠心病危險因素增加2％(NCEPR 1991)。臨床研究發現，降低血清膽固醇水平可以減少冠心病的發病率，阻滯動脈粥樣硬化的發展(LPCP 1984；Frick 1987)。膽固醇不溶於水，不能在血液裡轉運。它必需與脂蛋白結合才能在血液裡轉運。人血液裡有四種脂蛋白負責膽固醇的運載。它們是低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，極低密度脂蛋白(VLDL)和中間密度脂蛋白(IDL)。在正常人中，三分之二的總膽固醇由LDL運載。LDL攜帶內源或外源膽固醇，穿過血管壁，進入內皮下(subendothelium)。在內皮下，LDL膽固醇被氧化成氧化型LDL膽固醇，並通過清道夫受體被巨噬細胞以膽固醇酯的形式在細胞內積聚。大量膽固醇酯積聚在巨噬細胞內形成了泡沫細胞。積聚了大量膽固醇酯的泡沫細胞沉積在血管內皮下，形成了動脈粥樣硬化斑塊的核心。資料表明，由LDL運載的膽固醇是導致動脈粥樣硬化冠心病的主要根源(Goldstein1989；Vega 1986；Innerarity 1990；Rauth1992)。所以LDL膽固醇被稱為壞膽固醇。膽固醇引起的動脈粥樣硬化不但是冠心病的主要根源，同時也是腦血管疾病，如腦血栓形成，中風的重要病因。此外人腦細胞內積聚的高膽固醇酯還可能和老年性痴呆症的形成有關。體內膽固醇來源有內源和外源。外源膽固醇來自於飲食，內源膽固醇是自體合成的結果。內源膽固醇合成亢進和家族性高膽固醇血症在西方國家較為普遍。這種疾病必須通過藥物控制。在美國，40％以上的成年人的LDL膽固醇(壞膽固醇)含量超過正常水平。由於膽固醇在形成心腦血管疾病中的重要作用，近十多年來，美國及歐洲藥廠都把其抗動脈粥樣硬化藥的研究和開發放到降低血清總膽固醇及LDL膽固醇上。這些藥中療效最顯著的有Merck藥廠的Zocor和Warner-Lambert/Parke-Davis去年上市的Lipitor。這些藥的作用機理都是抑制人體膽固醇合成的關鍵酶HMG-COA-還原酶。雖然HMG-COA-還原酶抑制藥能顯著的降低血清總膽固醇，防止、阻止及降低動脈粥樣硬化和冠心病發生，發展和死亡，但它只能減少內源性膽固醇合成及降低家族性高膽固醇血症引起的冠心病的發展或惡化。對於治療外源性膽固醇增多引起的動脈粥樣硬化，對於消除已進入巨噬細胞內的膽固醇和抑制由此導致的動脈粥樣硬化形成，對於去除動脈粥樣硬化斑塊中積聚的膽固醇，使動脈粥樣硬化血管回復正常，則作用不大或無能為力。換句話說，目前歐美市場流行的抑制內源性膽固醇生成藥物不能從根本上治療廣義的動脈粥樣硬化心腦血管疾病。
醫學研究證明，巨噬細胞吞噬和積聚膽固醇，轉換成泡沫細胞，沉積在血管壁內皮下是動脈粥樣硬化斑塊形成的基礎。清除積聚在血管壁巨噬細胞/泡沫細胞內的膽固醇，將其轉運到肝臟分解，是治療單純降低血清膽固醇所不能達到的，根治動脈粥樣硬化心腦血管疾病的最新的有效手段，清除巨噬細胞/泡沫細胞及動脈粥樣硬化斑塊內膽固醇的唯一的有效武器是HDL。近年來，西方心血管疾病研究人員及製藥公司開始把研究方向放到新一類抗動脈粥樣硬化藥，升高密度脂蛋白(HDL)藥上來。高密度脂蛋白(HDL)是一重要的膽固醇載體，它在運載膽固醇方面的功能與LDL截然相反。HDL可以刺激血管內皮下巨噬細胞內膽固醇酯水解，並將水解的非酯化膽固醇從巨噬細胞內轉運至肝臟分解。更為重要的是，HDL能刺激沉積於血管壁和血管壁動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞/泡沫細胞內膽固醇酯水解。非酯化膽固醇被HDL從泡沫細胞轉運至肝臟分解(Alan et al.1996)。從而去除了動脈粥樣硬化賴以形成的基礎。所以HDL的重要功能被稱為膽固醇逆相轉運(Reverse Cholesterol Transportation)。膽固醇逆相轉運的結果是①抑制膽固醇酯在巨噬細胞內累積，阻止其轉化為泡沫細胞，從而防止了動脈粥樣硬化的形成；②因為HDL具有獨特的轉運動脈粥樣硬化斑塊內泡沫細胞裡膽固醇至肝臟分解的作用，從而使動脈粥樣硬化血管壁逐步回復正常。HDL的此二項功能一直是西方醫學界在治療動脈粥樣硬化病中夢寐以求的效果。此外，HDL含有paraoxonase，可以抑制低密度脂蛋白氧化，防止LDL被巨噬細胞吞噬，產生泡沫細胞。HDL還可以刺激內皮細胞釋放前列環素(PI)增加膽固醇酯水解和膽固醇轉運出細胞。HDL的作用對象不分內源或外源膽固醇。基礎及臨床研究證實，每增加1mg/dl HDL膽固醇，冠心病死亡危險即下降2.5％(Alan et al.1996)。低血漿HDL是比高血漿膽固醇更重要的致動脈粥樣硬化及冠心病的危險因子(Alan et al.1996)。
提高血漿HDL含量的機理是什麼呢？簡單地說是激活合成HDL活性成份的有關基因及HDL合成過程中有關酶或蛋白的基因。它們有五項。這5項因素中，最重要一項是ApoA水平。
流行病和轉基因動物實驗研究結果證實，血漿ApoAI可以抑制動脈粥樣硬化的形成和發展(Castelliet al.1977；Rutin et al.1991)。ApoAI含量降低，動脈粥樣硬化發病率升高(Castelli et al.1986；Rutinet al.1991)。APOAI就成為篩選治療動脈粥樣硬化的重要靶點。升高ApoAI靶標篩藥系統是篩選新一代抗動脈粥樣硬化心腦血管病升高密度脂蛋白(HDL)藥中的核心技術工具，包括體外細胞靶標篩藥方法部分(龔邦強，陸浩均專利，2000年)和體內轉基因動物靶標篩藥方法部分。我們已建立了ApoAI細胞靶標篩藥方法部分。要建立轉基因動物靶標篩藥方法，其關鍵是獲得ApoAI可表達全基因。然ApoAI可表達全基因加上其相關調控序列基因全長達10.5kb。以普通PCR的方式尚不能直接從基因組中直接擴增出如此大的片斷，因此需要通過篩選合適的基因組庫來獲得完整片斷。
獲得基因的方法現在主要有兩種，分為直接PCR擴增法，雜交膜篩選文庫法。直接PCR擴增法受限於Taq酶的延伸性，一般條件下只能擴增到5kb，而且由於Taq酶具有一定的鹼基錯配率，擴增產物不完全忠實於體內的序列，因此不能獲得大片斷的基因。
雜交膜篩選文庫法根據所用文庫構建載體的類別，可以有普通質粒，M13，噬菌體，Cosmid，PAC，BAC，YAC，MAC等；Cosmid文庫既能有效包含50kb以內的全基因，又能保持目標片斷較短。篩選庫的一般做法是根據文庫的克隆片斷的能力，以及所需基因物種的基因組大小，計算2-6倍完全覆蓋率所需的最小的克隆數，以Cosmid庫與人基因組對比，1倍覆蓋率所需的克隆數為6×104，2-6倍則需要1.2×105-3.6×105克隆數；如以噬菌體或質粒計算則需要6×105-1.8×106克隆數。根據所需克隆數，以及一塊細菌培養平板上所能有效容納的克隆量，計算需要鋪設的細菌平板數量，一般一塊10cm平板可以容1200個克隆，15cm的平板可以容納3700個克隆，這樣篩選一次文庫約需300塊10cm平板或100塊15cm平板，相應的各種試劑量使用相當驚人，如細菌培養基，雜交膜，雜交探針與探針標記物，雜交試劑等，粗略概算為26300元(300套平板2700元；7.51 LB培養基300元；雜交膜30000cm228400元；標記試劑合800元；放射性同位素150uCi 7500元；探針1mg 1000元；雜交試劑如Formamide、飽和核酸、Denhardt Solution約3000元；X光片100張1600元；同位素實驗室使用1000元)，這些計算還是建立在一切順利，沒有重複的基礎上的。另外，由於需要對多達300塊的平板進行操作，人員工作量也是相當驚人，並且各道工序均需銜接，如LB平板適用時間為製備後的2-5天內，同位素有到貨周期，標記後需在7天內使用，單克隆平板製備後需在7天內得到肯定結果用於下一步使用，X光片的衝洗與曝光條件需在兩天內建立，每人同時操作的平板數不能大於10塊，否則精力分散，操作不佳，每塊平板之間需要準確的標記與定位。另外由於篩選的陽性比率低，篩選的量大，尚存在這樣的問題沒有準確的陽性克隆比對，不容易辨別假陽性雜交點；很多塊平板上為全陰性，容易喪失信心，考慮為文庫中缺少該基因的存在；平板多，控制的重複性有難度。總計算來，雜交膜篩選文庫法需要高投入約5-10萬元，長周期約6-12個月，有經驗的工作人員，只適合大實驗室使用。
本發明的目的在於設計一種簡便快速的能篩選到ApoAI可表達全基因的方法。
本發明提供了一種用PCR技術從人類全基因組Cosmid庫中篩選ApoAI可表達全基因的方法，該方法包括下列步驟1.PCR擴增部分片斷作為陽性指標，逐級稀釋文庫獨立克隆數，從Cosmid庫中快速篩選含有完全調控序列的ApoA1 10.5kb基因以及其它APO家族基因的技術方法Cosmid庫從Clontech公司購買的基因組文庫，DNA來源32歲的Caucasian胎盤，載體pWE15，獨立克隆數1.1×106，滴度108/ml，宿主菌NM538，插入長度35-50kb，平均插入長度38kb；Cosmid庫的第一級稀釋獨立克隆1)取10μl原始Cosmid庫的菌液，在100倍顯微鏡下，使用相差方式，以及醫用血球計數板，直接計數Cosmid庫的菌液濃度為108/ml；2)取10μl原始Cosmid庫的菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為106/ml；3)取100μl前述稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為105/ml；4)準備1塊無菌的96孔細胞培養板，每孔中加入200μl新鮮配製的無菌LB培養基，加入100μg/ml濃度的氨苄青黴素，另外每孔分別加入第3步所獲得的稀釋菌液10μl，此時每孔的Cosmid菌的總密度為103，分布孔的範圍為A1-H12；5)放入37℃培養箱培養16hr，此時每孔中菌液濃度約為108/ml，獨立克隆數仍為103；PCR擴增片斷設計根據可查得的部分序列，設計為三段擴增，其引物序列分別為第一段，ApoA1-300bp-+50bp片斷，引物上遊5』GACTC GAGAG GGGAA GGGGA TGAGT G3』下遊5』ATAGA TCTCC TGAAC CTTGA GCTGG G3』表徵ApoA1的起始部分；第二段，8106bp-8648bp片斷，引物上遊5』GAGGG CATTA CCTGG AGCAG3』下遊5』CCTTG CGAGC CACTG ATGC3』，表徵ApoA1可表達部分的尾部序列，10.5kb片斷的中間部分；第三段ApoA IV的promoter區域，引物上遊5』CCTCT ATTAG CGATC CATTC CTG3』下遊5』TGCTG TGTGA ATGGT TGTTA ACTG3』進一步驗證ApoA1可表達基因10.5kb被囊括其中；PCR擴增Cosmid亞庫，鑑別篩選陽性亞庫底物的快速處理以1X PCR Buffer 50μl加2μl前述製備的Cosmid稀釋克隆菌液，100℃煮沸10min，10000g離心2min，取上清2μl，加入PCR反應液中，作為底物，對於Cosmid稀釋克隆菌板上的96個孔的每一個孔的菌均作同樣的處理；PCR反應條件在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer 10μl 終濃度1X2mM dNTP10μl 終濃度0.2mM第一段序列上下遊引物各 5μl 終濃度50pmol已處理底物 2μl 105菌DNA當量Taq酶 1μl 終濃度2μl去離子水72μl 補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min
共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理1％瓊脂糖-TAE凝膠電泳鑑別陽性克隆電泳條件10V/cm 30min上樣量PCR反應液10μl，加2μl 5X上樣緩衝液分子量標準使用TaKaRa公司的DL2000，條帶大小分別為100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb。
紫外310nm下觀察電泳條帶。
條帶鑑別根據條帶的有效位置及長度判斷擴增的陽性情況，作為Cosmid載體的pWE15使用第一段序列進行PCR擴增時可以獲得可重複的250bp條帶，該條帶為背景條帶，可以剔除，目標序列擴增可以獲得400bp左右的條帶，有此條帶。初步說明為所需要篩選的陽性克隆，實際篩選獲得8個孔的亞庫具有陽性反應，取其中1個陽性孔進行下一步操作；Cosmid庫的第二級稀釋獨立克隆1)取10μl經篩選為陽性的第一級稀釋Cosmid亞庫中陽性孔的菌液，在100倍顯微鏡下，使用相差方式，以及醫用血球計數板，直接計數其菌液濃度為108/ml。
2)取10μl目標Cosmid亞庫的菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為106/ml。
3)取10μl前述稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為104/ml。
4)取100μl前述104/ml稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為103/ml。
5)準備1塊無菌的96孔細胞培養板，每孔中加入200μl新鮮配製的無菌LB培養基，加入100μg/ml濃度的氨苄青黴素，另外每孔分別加入第4步所獲得的稀釋菌液10μl，此時每孔的Cosmid菌的總密度為101，分布孔的範圍為A1-H12。
5)放入37℃培養箱培養16hr，此時每孔中菌液濃度約為108/ml，獨立克隆數仍為101；PCR擴增Cosmid亞庫，鑑別篩選第二級陽性亞庫底物的快速處理以1X PCR Buffer 50μl加2μl前述製備的Cosmid稀釋克隆菌液，100℃煮沸10min，10000g離心2min，取上清2μl，加入PCR反應液中，作為底物，對於Cosmid稀釋克隆菌板上的96個孔的每一個孔的菌均作同樣的處理；PCR反應條件在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer 10μl終濃度1X2mM dNTP10μl終濃度0.2mM第一段序列上下遊引物各 5μl 終濃度50pmol已處理底物 2μl 105菌DNA當量Taq酶 1μl 終濃度2μl去離子水72μl補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理1％瓊脂糖-TAE凝膠電泳鑑別陽性克隆電泳條件10V/cm 30min上樣量PCR反應液10μl，加2μl 5X上樣緩衝液分子量標準使用TaKaRa公司的DL2000，條帶大小分別為100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb；紫外310nm下觀察電泳條帶；條帶鑑別同第一級亞庫篩選，根據條帶的有效位置及長度判斷擴增的陽性情況，作為Cosmid載體的pWE15使用第一段序列進行PCR擴增時可以獲得可重複的250bp條帶，該條帶為背景條帶，可以剔除，目標序列擴增可以獲得400bp左右的條帶。有此條帶，初步說明為所需要篩選的陽性克隆。實際篩選獲得28個孔的亞庫具有陽性反應，此時亞庫的獨立克隆數為101，對於其中一個亞庫進行單克隆細菌平板製備分析；Cosmid庫單克隆細菌平板製備1)取10μl經篩選為陽性的第二級稀釋Cosmid亞庫中陽性孔的菌液，在100倍顯微鏡下，使用相差方式，以及醫用血球計數板，直接計數其菌液濃度平均為108/ml；
2)取10μl目標Cosmid亞庫的菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為106/ml；3)取10μl前述稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為104/ml；4)取100μl前述104/ml稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為103/ml；5)取100μl前述103/ml稀釋菌液，鋪於10cm細菌培養平板上，LB培養基，1.5％瓊脂糖，100μg/ml Amphicillin，37℃培養約16小時，待菌落長至平均1mm直徑，平均各板上可以長到50-100個克隆；6)以滅菌牙籤，挑單克隆菌落的一半於底物處理液中，用於PCR反應。將板上克隆與PCR反應管，底物處理管對應編號，根據PCR反應結果，尋找板上克隆，進行細菌培養擴增，每組篩選共挑選50個單克隆；PCR擴增Cosmid平板單克隆，鑑別篩選目標菌落底物的快速處理以1X PCR Buffer 50μl加滅菌牙籤挑的一半克隆，混勻100℃煮沸10min，10000g離心2min，取上清2μl，加入PCR反應液中，作為底物，對於Cosmid庫單克隆平板上的其它50個單菌落均作同樣的處理；PCR反應條件一在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer10μl終濃度1X2mM dNTP 10μl終濃度0.2mM第一段序列上下遊引物各5μl 終濃度50pmol已處理底物2μl 105菌DNA當量Taq酶 1μl 終濃度2μl去離子水 72μl補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理PCR反應條件二在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer 10μl終濃度1X2mM dNTP 10μl終濃度0.2mM第二段序列上下遊引物各5μl終濃度50pmol已處理底物2μl105菌DNA當量Taq酶 1μl終濃度2μl去離子水 72μl 補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理PCR反應條件三在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer 10μl終濃度1X2mM dNTP 10μl終濃度0.2mM第三段序列上下遊引物各 5μl 終濃度50pmol已處理底物 2μl 105菌DNA當量Taq酶1μl 終濃度2μl去離子水 72μl補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理1％瓊脂糖-TAE凝膠電泳鑑別陽性克隆電泳條件10V/cm 30min上樣量PCR反應液10μl，加2μl 5X上樣緩衝液分子量標準使用TaKaRa公司的DL2000，條帶大小分別為100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb。紫外310nm下觀察電泳條帶；條帶鑑別根據條帶的有效位置及長度判斷擴增的陽性情況，作為Cosmid載體的pWE15使用第一段序列進行PCR擴增時可以獲得可重複的250bp條帶，該條帶為背景條帶，可以剔除，目標序列擴增可以獲得400bp左右的條帶。有此條帶，初步說明該克隆為所需要篩選的陽性克隆以及該克隆包含所需要的ApoA1-300起始的序列；作為Cosmid載體的pWE15使用第二段序列進行PCR擴增時可以獲得可重複的100bp
條帶，該條帶為背景條帶，可以剔除，目標序列擴增可以獲得500bp左右的條帶。有此條帶說明該克隆包含所需要篩選片斷的8106-8648bp部分序列；作為Cosmid載體的pWE15使用第三段序列進行PCR擴增時沒有條帶，陽性克隆可擴增出1.1kb的片斷，說明該克隆已經包含了ApoAIV的基因調控區，整個ApoA1的10.5kb調控區均含在克隆區中。實際篩選獲得1個單克隆菌落3段PCR引物序列擴增均得到目標條帶；部分序列分析鑑定陽性克隆PCR反應產生目標陽性條帶在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer 10μl終濃度1X2mM dNTP 10μl終濃度0.2mM第一段序列上下遊引物各 5μl 終濃度50pmol(或第二段序列上下遊引物各5μl 終濃度50pmol)已處理目的克隆製備底物 2μl 105菌DNA當量Taq酶1μl 終濃度2μl去離子水 72μl補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理1％瓊脂糖-TAE凝膠電泳鑑別分離目標條帶電泳條件10V/cm 30min上樣量PCR反應液10μl，加2μl 5X上樣緩衝液分子量標準使用TaKaRa公司的DL2000，條帶大小分別為100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb。
紫外310nm下觀察電泳條帶。
第一段序列擴增的目標陽性條帶為400bp；第二段序列擴增的目標陽性條帶為500bp左右；對照分子量標準，取下相應的條帶所在的瓊脂糖膠塊；Agarose DNA快速回收(Gibco BRL，Concert Gel ExtractionSystem)準備a.50℃水浴裝置b.預熱TE緩衝液至65-70℃
1)切膠以潔淨、鋒利刀片切下含DNA片段的Agarose膠，修淨邊緣；2)稱重膠濃度小於2％，重量小於400mg者，裝入1.5ml Eppendorf管中，每10mg膠加入30ml L1(Gel.Solubilization Buffer，見Gibco公司操作手冊)；3)溶解50℃水浴15分鐘以上，每隔3分鐘混勻一次，溶解後繼續水浴5分鐘；4)裝柱取一洗脫柱放入一2ml洗滌管中，把「3」中的混和物倒入洗脫柱中，離心12000g 1分鐘，棄去洗滌管中液體；5)洗滌(可選)洗脫柱放回2ml洗滌管中，加500μl L1，室溫放置1分鐘，離心12000g 1分鐘，棄去洗滌管中液體；6)洗滌洗脫柱放回2ml洗滌管中，加700μl L2(Wash Buffer，含乙醇，見Gibco公司操作手冊)，室溫放置5分鐘，離心12000g 1分鐘，棄去洗滌管中液體，重複離心1分鐘，棄去洗滌管；7)DNA回收把洗脫柱放入一新的1.5ml Eppendorf管中，加入50μl預熱的TE緩衝液，室溫放置1分鐘，離心12000g 2分鐘，可得回收DNA；目標條帶克隆入pGEM-T Easy Vectors(Promega公司)在一新的0.5ml Eppendorf管中先後加入如下試劑2×Rapid Ligation Buffer5μlpGEM-T Easy Vector(50ng)1μlPCR product(膠回收產物) 3μlT4 DNA Ligase(3U/μl) 1μl總體積10μl，4℃連接反應過夜；細菌轉化取JM109感受態菌200μl於Eppendorf管中加入上述已連接了目標條帶的T載體(pGEM-T/apo)4μl，輕輕混勻，放置冰上30分鐘；42℃水浴，熱休克90秒，不搖動試管；管中加入無抗生素之LB培養基800μl，37℃溫和搖動(150rpm)45分鐘；5000g離心30秒，吸去上清約800μl，加入X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly--D-galactopyranoside)IPTG(isopropyl-β-thiogalactopyranoside)(Promega)混勻後，用無菌塗布器將菌液全部鋪於含氨苄青黴素的瓊脂平板表面，37℃平放20分鐘後倒置培養10-14小時(過夜)；次日挑取白色菌落接種於3ml含氨苄青黴素的液體LB培養基中，37℃搖床搖菌(180rpm)12小時；質粒提取取菌液，加入至Eppendorf管中，4℃ 4000g離心10分鐘，棄上清，倒置試管，滴盡殘存液體；加入100μl SI ，漩渦振蕩後完全重懸菌體；加入200μl SII，顛倒Eppendorf管4次；加入150μl SIII，12000g離心10分鐘；附①SI50mm葡萄糖，25mmol Tris-Hcl(pH8.0)，10mmolEDTA(pH8.0)，配製200ml。
②SII0.2mol NaOH，1％SDS，配製100ml。
③SIII5mol乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，雙蒸去離子水28.5ml。
將上清移到另一Eppendorf管中，加入等體積(450μl)苯酚氯仿異戊醇，混勻後，12000g離心10分鐘；小心吸取上層水相，加入冰無水乙醇，混勻後-70℃放置30分鐘，12000g離心15分鐘；棄上清，加500μl冷75％乙醇輕洗管壁，10000g 5分鐘，棄盡上清，37℃靜置乾燥10分鐘；用50μlTER(PH7.4)(50μlTE pH8.0，RNaseA 10mg/ml，5μl)溶解質粒；酶切鑑定克隆質粒於一新Eppendorf(EP)管中依次加入以下反應物及試劑ddH2O6μl10×緩衝液 2μl限制酶(Bgl II及Xho I)各1μl質粒DNA10μl總體積20μl，離心混合。
37℃水浴1-1.5小時。
Agarose凝膠電泳，可見相應大小的目標片段；目標條帶測序分析將PCR擴增獲得的目標片斷純化後克隆入的T/A載體，以T7 promter作序列分析引物，交上海生工(Sangon)公司測定，兩段序列均與預期序列一致，結果如下第一段序列01 TGANNCCNTGGGATACCCCGANCCCACCCGGGAGACCTGCAAGCCTGCAGACACTCCCCT61 CCCGCCCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCCCCCGCAGCTTGCTGTTTGCCCA121 CTCTATTTGCCCAGCCCCAGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCCACATTGCC181 AGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCCGGGGCTGGGCTTATCAGCCTCCCAGCCCAGACCCT241 GGCTGCAGACATAAATAGGCCCTGCAAGAGCTGGCTGCTTAGAGACTGCGAGAAGGAGGT301 GCGTCCTGCTGCCTGCCCCGGTCACTCTGGCTCCCCAGCTCAAGGTTCAGGAGATCTATA第一段序列使用膠塊回收DNA直接以ApoA1-300起始的PCR第一段序列作為引物測序，故圖譜上顯示出第一段序列的反向引物序列，其它部分序列與GenBank中編號[gi178765]的對應片斷完全一致；第二段序列GCCGCGGGAATTCGATTGAGGGCATTACCTGGAGCAGCTGCCTCTAGGGATGAACTGAGCAGACAGGCAGGAGGGTTCTGACCTGTTTTATATCATCTCCAGGGCAGCAGGCACTGAGGACCCAGGGCGCTGGGCAAAGGTCACCTGCTGACCAGTGGAGATGAGGGCCTGAGGCAGGGTGTCCAGATGCAGCAAGCGGGCGGGAGAGTTGGGAAATCCCTAGGAGACTGAGTCCACGCTGCTGTCCCGCCAGCCCTGCAGCCCAGATGAGCTCAGGAACTGGGGGTGGGCCTGGGGAGCCTCATTCCTTCCTAGCTGACTGGCTCCCCAGGGAGAGGCTGGTGAGAGGGGAAATGGCTTGGACATAGGCCAGCGCTCGGGCCCATCTCAGCCTTTCACACTGGAATTTCAGGCCCCTCCCTCCACCAGCCCCAAGCCCTGAACACAGCCTGGAGTAGAGGGGTGAGGGGCTTCTTCAGACTTGAGAACAAGTGGGTGGCTTGGGCTGGGGGGTGTTTGGAGTAAAGGCACAGAAGACCGGGCATCAGTGGCTCGCAAGGCCTGGGCATAGCTTGAYGTATTTTATAGTGTCACCTAAATAGCTTNGGCGTAATNATGGCCATAAGCTGNTTTCCTTGNGGNGNAAATTGNTNTTTCCGCTTCACAAATTCCNCACAAACAATACCAAGCCCGGAAGCANTAAAGGNGGGAAAAGNCCTGGGGGGGGCCTAAATGGAGGGGAGCCTTAACCTCNCNATTTAATTTGNGTTTGGCGCTTCNCTTGGCCCCCNT下劃線部分為設計的引物序列，其它引物之間的部分序列與GenBank中編號[gi178765]的對應片斷完全一致。
所有能查到的文獻資料顯示，目前研究人員還沒有用由本方法篩選到的ApoAI可表達全基因製作ApoAI轉基因動物。本發明在國際上首次將PCR有效擴增ApoAI的部分序列作陽性指標，應用Pool Dilution方法從Cosmid庫中篩選到的人ApoAI可表達全基因作ApoAI轉基因動物。
由於PCR方法進展，利用已知的一段序列設計引物，對一定稀釋度的庫作鑑定的方式進行篩選的方法被建立。此法主要在於PCR的靈敏度足夠從106的背景中鑑別出陽性序列的存在，以及每次篩選只需在102的數量級上進行，因此可以提高工作效率與準確性。具體操作為計算所需克隆數同雜交膜篩選文庫法，根據文庫的克隆片斷的能力，以及所需基因物種的基因組大小，計算2-6倍完全覆蓋率所需的最小的克隆數，以Cosmid庫與人基因組對比，1倍覆蓋率所需的克隆數為6×104，2-6倍則需要1.2×105-3.6×105克隆數，以所需的克隆數製備小兩個數量級的獨立克隆的亞庫，總共製備100個這樣的亞庫，培養於96孔板上。如文庫中含有所需的目的基因，由於每孔亞庫使用2μl的菌液，滴度有105，計算菌內Cosmid的拷貝數，對於獨立克隆數為103的亞庫，每個目的基因在PCR底物中都有103個拷貝，足夠PCR檢測的靈敏度；第一輪篩選100個降2次方克隆數的亞庫，至少可以獲得1個陽性亞庫；以該陽性亞庫同樣作降2次方的亞亞庫(對原文庫而言為降4次方)，由於該陽性亞庫PCR檢測為陽性，因此其100個亞亞庫中必有一個陽性；對於原始105的文庫，通過兩次獨立克隆數降級，篩選獲得的陽性亞亞庫獨立克隆數為10的量級，進一步篩選，製備平板單克隆，只需1塊10cm的平板即可，對於該平板上的單克隆篩選，也可以繼續採用PCR篩選或是傳統的雜交膜篩選法。根據這種方法，與雜交膜篩選法對比，具有試劑消耗少，總計約300個PCR反應，600元，平板、LB培養基等約100元，總消耗約2000元，顯著低於雜交膜篩選法的粗略概算26300元；人員工作量小，100個PCR反應基本可以同時進行，3個月可以獲得陽性結果；難度小，由於每次反應中均肯定有陽性結果，對篩選過程有信心；不涉及到同位素操作，對環境影響小；各道工序間依賴性小，容易安排。
本方法尚注意了以下幾點1.由於PCR不能擴增5kb以上序列，對目標基因篩選設立多個PCR擴增引物對，以保證需篩選的目標基因全長均落在範圍內，同時多對PCR擴增引物的聯合使用提高了檢測的準確性；2.對篩選出的目標基因，根據所用PCR引物對擴增相應片斷作序列測定，進一步驗證目標基因的準確性；3. 96孔板上分解亞庫後，37℃繼續培養16小時，使其克隆數恢復，增加各獨立克隆的拷貝數，利於PCR檢測；4.使用了菌液的快速裂解製備PCR底物的流程，使得準備PCR反應的時間從需要製備Cosmid粗DNA開始的1天時間縮短為1小時。
因此本方法相對於現有的獲取基因的方法，具有以下的優越性高準確性，完整性(相對於PCR直接擴增基因法)、消耗小、篩選速度快、對人員要求低(相對於雜交膜篩選文庫法)。
圖1，第一段引物的陽性擴增結果左側為DL2000分子量標準，條帶依次為100bp，250bp，500bp，750bo，1.0kb，2.0kb右側為預計的380bp長度擴增條帶，其中250bp的條帶為pWE15的背景擴增條帶。該段序列的有效擴增表徵目的基因的頭部在克隆中。(見圖4)圖2，第二段引物的陽性擴增結果左側為DL2000分子量標準，條帶依次為100bp，250bp，500bp，750bo，1.0kb，2.0kb右側為預計的500bp長度擴增條帶，其中100bp的條帶為pWE15的背景擴增條帶。該段序列的有效擴增表徵目的基因的中部在克隆中。(見圖4)圖3，第三段引物的陽性擴增結果左側為DL2000分子量標準，條帶依次為100bp，250bp，500bp，750bo，1.0kb，2.0kb右側為1.1 kb Apo AIV promoter的VNTR序列，該段序列的有效擴增表徵目的基因的尾部在克隆中。(見圖4)圖4，篩選Apo A1全基因的示意圖A為Apo A1-300bp-+50bp擴增序列，即設計的第一段擴增引物；B為8106bp-8648bp擴增序列，即設計的第二段擴增引物；C為Apo AIV的promoter VNTR序列，可擴增出1.1kb片段，即設計的第三段擴增引物。
實施例1.PCR擴增部分片斷作為陽性指標，逐級稀釋文庫獨立克隆數，從Cosmid庫中快速篩選含有完全調控序列的ApoA1 10.5kb基因以及其它APO家族基因的技術方法Cosmid庫從Clontech公司購買的基因組文庫，DNA來源32歲的Caucasian胎盤，載體pWE15，獨立克隆數1.1×106，滴度108/ml，宿主菌NM538，插入長度35-50kb，平均插入長度38kb；Cosmid庫的第一級稀釋獨立克隆1)取10μl原始Cosmid庫的菌液，在100倍顯微鏡下，使用相差方式，以及醫用血球計數板，直接計數Cosmid庫的菌液濃度為108/ml；2)取10μl原始Cosmid庫的菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為106/ml；3)取100μl前述稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為105/ml；4)準備1塊無菌的96孔細胞培養板，每孔中加入200μl新鮮配製的無菌LB培養基，加入100μg/ml濃度的氨苄青黴素，另外每孔分別加入第3步所獲得的稀釋菌液10μl，此時每孔的Cosmid菌的總密度為103，分布孔的範圍為A1-H12；5)放入37C培養箱培養16hr，此時每孔中菌液濃度約為108/ml，獨立克隆數仍為103；PCR擴增片斷設計根據可查得的部分序列，設計為三段擴增，其引物序列分別為第一段，ApoA1-300bp-+50bp片斷，引物上遊5』GACTC GAGAG GGGAA GGGGA TGAGT G3』下遊5』ATAGA TCTCC TGAAC CTTGA GCTGG G3』表徵ApoA1的起始部分；第二段，8106bp-8648bp片斷，引物上遊5』GAGGG CATTA CCTGG AGCAG3』下遊5』CCTTG CGAGC CACTG ATGC3』，表徵ApoA1可表達部分的尾部序列，10.5kb片斷的中間部分；第三段ApoA IV的promoter區域，引物上遊5』CCTCT ATTAG CGATC CATTC CTG3』下遊5』TGCTG TGTGA ATGGT TGTTA ACTG3』進一步驗證ApoA1可表達基因10.5kb被囊括其中；PCR擴增Cosmid亞庫，鑑別篩選陽性亞庫底物的快速處理以1X PCR Buffer 50μl加2μl前述製備的Cosmid稀釋克隆菌液，100℃煮沸10min，10000g離心2min，取上清2μl，加入PCR反應液中，作為底物，對於Cosmid稀釋克隆菌板上的96個孔的每一個孔的菌均作同樣的處理；PCR反應條件在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer10μl終濃度1X2mM dNTP 10μl終濃度0.2mM第一段序列上下遊引物各5μl 終濃度50pmol已處理底物2μl 105菌DNA當量Taq酶 1μl 終濃度2μl去離子水 72μl補齊反應體積為100μl
混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理1％瓊脂糖-TAE凝膠電泳鑑別陽性克隆電泳條件10V/cm 30min上樣量PCR反應液10μl，加2μl 5X上樣緩衝液分子量標準使用TaKaRa公司的DL2000，條帶大小分別為100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb。
紫外310nm下觀察電泳條帶。
條帶鑑別根據條帶的有效位置及長度判斷擴增的陽性情況，作為Cosmid載體的pWE15使用第一段序列進行PCR擴增時可以獲得可重複的250bp條帶，該條帶為背景條帶，可以剔除，目標序列擴增可以獲得400bp左右的條帶，有此條帶。初步說明為所需要篩選的陽性克隆，實際篩選獲得8個孔的亞庫具有陽性反應，取其中1個陽性孔進行下一步操作；Cosmid庫的第二級稀釋獨立克隆1)取10μl經篩選為陽性的第一級稀釋Cosmid亞庫中陽性孔的菌液，在100倍顯微鏡下，使用相差方式，以及醫用血球計數板，直接計數其菌液濃度為108/ml。
2)取10μl目標Cosmid亞庫的菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為106/ml。
3)取10μl前述稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為104/ml。
4)取100μl前述104/ml稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為103/ml。
5)準備1塊無菌的96孔細胞培養板，每孔中加入200μl新鮮配製的無菌LB培養基，加入100μg/ml濃度的氨苄青黴素，另外每孔分別加入第4步所獲得的稀釋菌液10μl，此時每孔的Cosmid菌的總密度為101，分布孔的範圍為A1-H12。
5)放入37℃培養箱培養16hr，此時每孔中菌液濃度約為108/ml，獨立克隆數仍為101；PCR擴增Cosmid亞庫，鑑別篩選第二級陽性亞庫底物的快速處理以1X PCR Buffer 50μl加2μl前述製備的Cosmid稀釋克隆菌液，100℃煮沸10min，10000g離心2min，取上清2μl，加入PCR反應液中，作為底物，對於Cosmid稀釋克隆菌板上的96個孔的每一個孔的菌均作同樣的處理；PCR反應條件在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer10μl終濃度1X2mM dNTP 10μl終濃度0.2mM第一段序列上下遊引物各5μl 終濃度50pmol已處理底物2μl 105菌DNA當量Taq酶 1μl 終濃度2μl去離子水 72μl補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理1％瓊脂糖-TAE凝膠電泳鑑別陽性克隆電泳條件10V/cm 30min上樣量PCR反應液10μl，加2μl 5X上樣緩衝液分子量標準使用TaKaRa公司的DL2000，條帶大小分別為100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb；紫外310nm下觀察電泳條帶；條帶鑑別同第一級亞庫篩選，根據條帶的有效位置及長度判斷擴增的陽性情況，作為Cosmid載體的pWE15使用第一段序列進行PCR擴增時可以獲得可重複的250bp條帶，該條帶為背景條帶，可以剔除，目標序列擴增可以獲得400bp左右的條帶。有此條帶，初步說明為所需要篩選的陽性克隆。實際篩選獲得28個孔的亞庫具有陽性反應，此時亞庫的獨立克隆數為101，對於其中一個亞庫進行單克隆細菌平板製備分析；Cosmid庫單克隆細菌平板製備1)取10μl經篩選為陽性的第二級稀釋Cosmid亞庫中陽性孔的菌液，在100倍顯微鏡下，使用相差方式，以及醫用血球計數板，直接計數其菌液濃度平均為108/ml；2)取10μl目標Cosmid亞庫的菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為106/ml；3)取10μl前述稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為104/ml；4)取100μl前述104/ml稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為103/ml；5)取100μl前述103/ml稀釋菌液，鋪於10cm細菌培養平板上，LB培養基，1.5％瓊脂糖，100μg/ml Amphicillin，37℃培養約16小時，待菌落長至平均1mm直徑，平均各板上可以長到50-100個克隆；6)以滅菌牙籤，挑單克隆菌落的一半於底物處理液中，用於PCR反應。將板上克隆與PCR反應管，底物處理管對應編號，根據PCR反應結果，尋找板上克隆，進行細菌培養擴增，每組篩選共挑選50個單克隆；PCR擴增Cosmid平板單克隆，鑑別篩選目標菌落底物的快速處理以1X PCR Buffer 50μl加滅菌牙籤挑的一半克隆，混勻100℃煮沸10min，10000g離心2min，取上清2μl，加入PCR反應液中，作為底物，對於Cosmid庫單克隆平板上的其它50個單菌落均作同樣的處理；PCR反應條件一在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer10μl終濃度1X2mM dNTP 10μl終濃度0.2mM第一段序列上下遊引物各5μl 終濃度50pmol已處理底物2μl 105菌DNA當量Taq酶 1μl 終濃度2μl去離子水 72μl補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理PCR反應條件二在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer 10μl終濃度1X2mM dNTP10μl終濃度0.2mM第二段序列上下遊引物各 5μl 終濃度50pmol已處理底物 2μl 105菌DNA當量Taq酶 1μl 終濃度2μl去離子水72μl補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理PCR反應條件三在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer 10μl終濃度1X2mM dNTP10μl終濃度0.2mM第三段序列上下遊引物各 5μl 終濃度50pmol已處理底物 2μl 105菌DNA當量Taq酶 1μl 終濃度2μl去離子水72μl補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理1％瓊脂糖-TAE凝膠電泳鑑別陽性克隆電泳條件10V/cm 30min上樣量PCR反應液10μl，加2μl 5X上樣緩衝液分子量標準使用TaKaRa公司的DL2000，條帶大小分別為100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb。紫外310nm下觀察電泳條帶；條帶鑑別根據條帶的有效位置及長度判斷擴增的陽性情況，作為Cosmid載體的pWE15使用第一段序列進行PCR擴增時可以獲得可重複的250bp
條帶，該條帶為背景條帶，可以剔除，目標序列擴增可以獲得400bp左右的條帶。有此條帶，初步說明該克隆為所需要篩選的陽性克隆以及該克隆包含所需要的ApoA1-300起始的序列；作為Cosmid載體的pWE15使用第二段序列進行PCR擴增時可以獲得可重複的100bp條帶，該條帶為背景條帶，可以剔除，目標序列擴增可以獲得500bp左右的條帶。有此條帶說明該克隆包含所需要篩選片斷的8106-8648bp部分序列；作為Cosmid載體的pWE15使用第三段序列進行PCR擴增時沒有條帶，陽性克隆可擴增出1.1kb的片斷，說明該克隆已經包含了ApoAIV的基因調控區，整個ApoA1的10.5kb調控區均含在克隆區中。實際篩選獲得1個單克隆菌落3段PCR引物序列擴增均得到目標條帶；部分序列分析鑑定陽性克隆PCR反應產生目標陽性條帶在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer 10μl終濃度1X2mM dNTP 10μl終濃度0.2mM第一段序列上下遊引物各 5μl 終濃度50pmol(或第二段序列上下遊引物各5μl 終濃度50pmol)已處理目的克隆製備底物 2μl 105菌DNA當量Taq酶1μl 終濃度2μl去離子水 72μl補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理1％瓊脂糖-TAE凝膠電泳鑑別分離目標條帶電泳條件10V/cm 30min上樣量PCR反應液10μl，加2μl 5X上樣緩衝液分子量標準使用TaKaRa公司的DL2000，條帶大小分別為100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb。
紫外310nm下觀察電泳條帶。
第一段序列擴增的目標陽性條帶為400bp；第二段序列擴增的目標陽性條帶為500bp左右；對照分子量標準，取下相應的條帶所在的瓊脂糖膠塊；Agarose DNA快速回收(Gibco BRL，Concert Gel ExtractionSystem)準備a.50℃水浴裝置b.預熱TE緩衝液至65-70℃1)切膠以潔淨、鋒利刀片切下含DNA片段的Agarose膠，修淨邊緣；2)稱重膠濃度小於2％，重量小於400mg者，裝入1.5ml Eppendorf管中，每10mg膠加入30ml L1(Gel.Solubilization Buffer，見Gibco公司操作手冊)；3)溶解50℃水浴15分鐘以上，每隔3分鐘混勻一次，溶解後繼續水浴5分鐘；4)裝柱取一洗脫柱放入一2ml洗滌管中，把「3」中的混和物倒入洗脫柱中，離心12000g 1分鐘，棄去洗滌管中液體；5)洗滌(可選)洗脫柱放回2ml洗滌管中，加500μl L1，室溫放置1分鐘，離心12000g 1分鐘，棄去洗滌管中液體；6)洗滌洗脫柱放回2ml洗滌管中，加700μl L2(Wash Buffer，含乙醇，見Gibco公司操作手冊)，室溫放置5分鐘，離心12000g 1分鐘，棄去洗滌管中液體，重複離心1分鐘，棄去洗滌管；7)DNA回收把洗脫柱放入一新的1.5ml Eppendorf管中，加入50μl預熱的TE緩衝液，室溫放置1分鐘，離心12000g 2分鐘，可得回收DNA；目標條帶克隆入pGEM-T Easy Vectors(Promega公司)在一新的0.5ml Eppendorf管中先後加入如下試劑2×Rapid Ligation Buffer5μlpGEM-T Easy Vector(50ng)1μlPCR product(膠回收產物) 3μlT4 DNA Ligase(3U/μl) 1μl總體積10μl，4℃連接反應過夜；細菌轉化取JM109感受態菌200μl於Eppendorf管中加入上述已連接了目標條帶的T載體(pGEM-T/apo)4μl，輕輕混勻，放置冰上30分鐘；42℃水浴，熱休克90秒，不搖動試管；管中加入無抗生素之LB培養基800μl，37℃溫和搖動(150rpm)45分鐘；5000g離心30秒，吸去上清約800μl，加入X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly--D-galactopyranoside)IPTG(isopropyl-β-thiogalactopyranoside)(Promega)混勻後，用無菌塗布器將菌液全部鋪於含氨苄青黴素的瓊脂平板表面，37℃平放20分鐘後倒置培養10-14小時(過夜)；次日挑取白色菌落接種於3ml含氨苄青黴素的液體LB培養基中，37℃搖床搖菌(180rpm)12小時；質粒提取取菌液，加入至Eppendorf管中，4℃ 4000g離心10分鐘，棄上清，倒置試管，滴盡殘存液體；加入100μlSI，漩渦振蕩後完全重懸菌體；加入200μlSII，顛倒Eppendorf管4次；加入150μlSIII，12000g離心10分鐘；附①SI50mm葡萄糖，25mmol Tris-Hcl(pH8.0)，10mmolEDTA(pH8.0)，配製200ml。
②SII0.2mol NaOH，1％SDS，配製100ml。
③SIII5mol乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，雙蒸去離子水28.5ml。
將上清移到另一Eppendorf管中，加入等體積(450μl)苯酚氯仿異戊醇，混勻後，12000g離心10分鐘；小心吸取上層水相，加入冰無水乙醇，混勻後-70℃放置30分鐘，12000g離心15分鐘；棄上清，加500μl冷75％乙醇輕洗管壁，10000g 5分鐘，棄盡上清，37℃靜置乾燥10分鐘；用50μlTER(PH7.4)(50μlTE pH8.0，RNaseA 10mg/ml，5μl)溶解質粒；酶切鑑定克隆質粒於一新Eppendorf(EP)管中依次加入以下反應物及試劑ddH2O6μl10×緩衝液 2μl限制酶(Bgl II及Xho I)各1μl質粒DNA10μl總體積20μl，離心混合。
總體積20μl，離心混合。
37℃水浴1-1.5小時。
Agarose凝膠電泳，可見相應大小的目標片段；目標條帶測序分析將PCR擴增獲得的目標片斷純化後克隆入的T/A載體，以T7 promter作序列分析引物，交上海生工(Sangon)公司測定，兩段序列均與預期序列一致，結果如下第一段序列01 TGANNCCNTGGGATACCCCGANCCCACCCGGGAGACCTGCAAGCCTGCAGACACTCCCCT61 CCCGCCCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCCCCCGCAGCTTGCTGTTTGCCCA121 CTCTATTTGCCCAGCCCCAGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCCACATTGCC181 AGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCCGGGGCTGGGCTTATCAGCCTCCCAGCCCAGACCCT241 GGCTGCAGACATAAATAGGCCCTGCAAGAGCTGGCTGCTTAGAGACTGCGAGAAGGAGGT301 GCGTCCTGCTGCCTGCCCCGGTCACTCTGGCTCCCCAGCTCAAGGTTCAGGAGATCTATA第一段序列使用膠塊回收DNA直接以ApoA1-300起始的PCR第一段序列作為引物測序，故圖譜上顯示出第一段序列的反向引物序列，其它部分序列與GenBank中編號[gi178765]的對應片斷完全一致；第二段序列GCCGCGGGAATTCGATTGAGGGCATTACCTGGAGCAGCTGCCTCTAGGGATGAACTGAGCAGACAGGCAGGAGGGTTCTGACCTGTTTTATATCATCTCCAGGGCAGCAGGCACTGAGGACCCAGGGCGCTGGGCAAAGGTCACCTGCTGACCAGTGGAGATGAGGGCCTGAGGCAGGGTGTCCAGATGCAGCAAGCGGGCGGGAGAGTTGGGAAATCCCTAGGAGACTGAGTCCACGCTGCTGTCCCGCCAGCCCTGCAGCCCAGATGAGCTCAGGAACTGGGGGTGGGCCTGGGGAGCCTCATTCCTTCCTAGCTGACTGGCTCCCCAGGGAGAGGCTGGTGAGAGGGGAAATGGCTTGGACATAGGCCAGCGCTCGGGCCCATCTCAGCCTTTCACACTGGAATTTCAGGCCCCTCCCTCCACCAGCCCCAAGCCCTGAACACAGCCTGGAGTAGAGGGGTGAGGGGCTTCTTCAGACTTGAGAACAAGTGGGTGGCTTGGGCTGGGGGGTGTTTGGAGTAAAGGCACAGAAGACCGGGCATCAGTGGCTCGCAAGGCCTGGGCATAGCTTGAYGTATTTTATAGTGTCACCTAAATAGCTTNGGCGTAATNATGGCCATAAGCTGNTTTCCTTGNGGNGNAAATTGNTNTTTCCGCTTCACAAATTCCNCACAAACAATACCAAGCCCGGAAGCANTAAAGGNGGGAAAAGNCCTGGGGGGGGCCTAAATGGAGGGGAGCCTTAACCTCNCNATTTAATTTGNGTTTGGCGCTTCNCTTGGCCCCCNT下劃線部分為設計的引物序列，其它引物之間的部分序列與GenBank中編號[gi178765]的對應片斷完全一致。
權利要求
1.一種用PCR技術從人類全基因組Cosmid庫中篩選ApoAI表達全基因的方法，該方法包括下列步驟1.PCR擴增部分片斷作為陽性指標，逐級稀釋文庫獨立克隆數，從Cosmid庫中快速篩選含有完全調控序列的ApoA1 10.5kb基因以及其它APO家族基因的技術方法Cosmid庫從Clontech公司購買的基因組文庫，DNA來源32歲的Caucasian胎盤，載體pWE15，獨立克隆數1.1×106，滴度108/ml，宿主菌NM538，插入長度35-50kb，平均插入長度38kb；Cosmid庫的第一級稀釋獨立克隆1)取10μl原始Cosmid庫的菌液，在100倍顯微鏡下，使用相差方式，以及醫用血球計數板，直接計數Cosmid庫的菌液濃度為108/ml；2)取10μl原始Cosmid庫的菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為106/ml；3)取100μl前述稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為105/ml；4)準備1塊無菌的96孔細胞培養板，每孔中加入200μl新鮮配製的無菌LB培養基，加入100μg/ml濃度的氨苄青黴素，另外每孔分別加入第3步所獲得的稀釋菌液10μl，此時每孔的Cosmid菌的總密度為103，分布孔的範圍為A1-H12；5)放入37℃培養箱培養16hr，此時每孔中菌液濃度約為108/ml，獨立克隆數仍為103；PCR擴增片斷設計根據可查得的部分序列，設計為三段擴增，其引物序列分別為第一段，ApoA1-300bp-+50bp片斷，引物上遊5』GACTC GAGAG GGGAA GGGGA TGAGT G3』下遊5』ATAGA TCTCC TGAAC CTTGA GCTGG G3』表徵ApoA1的起始部分；第二段，8106bp-8648bp片斷，引物上遊5』GAGGG CATTA CCTGG AGCAG3』下遊5』CCTTG CGAGC CACTG ATGC3』，表徵ApoA1可表達部分的尾部序列，10.5kb片斷的中間部分；第三段ApoA IV的promoter區域，引物上遊5』CCTCT ATTAG CGATC CATTC CTG3』下遊5』TGCTG TGTGA ATGGT TGTTA ACTG3』進一步驗證ApoA1可表達基因10.5kb被囊括其中；PCR擴增Cosmid亞庫，鑑別篩選陽性亞庫底物的快速處理以1X PCR Buffer 50μl加2μl前述製備的Cosmid稀釋克隆菌液，100℃煮沸10min，10000g離心2min，取上清2μl，加入PCR反應液中，作為底物，對於Cosmid稀釋克隆菌板上的96個孔的每一個孔的菌均作同樣的處理；PCR反應條件在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer 10μl 終濃度1X2mM dNTP10μl 終濃度0.2mM第一段序列上下遊引物各5μl 終濃度50pmol已處理底物 2μl 105菌DNA當量Taq酶 1μl 終濃度2μl去離子水72μl 補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理1％瓊脂糖-TAE凝膠電泳鑑別陽性克隆電泳條件10V/cm 30min上樣量PCR反應液10μl，加2μl 5X上樣緩衝液分子量標準使用TaKaRa公司的DL2000，條帶大小分別為100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb，紫外310nm下觀察電泳條帶，條帶鑑別根據條帶的有效位置及長度判斷擴增的陽性情況，作為Cosmid載體的pWE15使用第一段序列進行PCR擴增時可以獲得可重複的250bp條帶，該條帶為背景條帶，可以剔除，目標序列擴增可以獲得400bp左右的條帶，有此條帶。初步說明為所需要篩選的陽性克隆，實際篩選獲得8個孔的亞庫具有陽性反應，取其中1個陽性孔進行下一步操作；Cosmid庫的第二級稀釋獨立克隆1)取10μl經篩選為陽性的第一級稀釋Cosmid亞庫中陽性孔的菌液，在100倍顯微鏡下，使用相差方式，以及醫用血球計數板，直接計數其菌液濃度為108/ml，2)取10μl目標Cosmid亞庫的菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為106/ml，3)取10μl前述稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為104/ml，4)取100μl前述104/ml稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為103/ml，5)準備1塊無菌的96孔細胞培養板，每孔中加入200μl新鮮配製的無菌LB培養基，加入100μg/ml濃度的氨苄青黴素，另外每孔分別加入第4步所獲得的稀釋菌液10μl，此時每孔的Cosmid菌的總密度為101，分布孔的範圍為A1-H12，5)放入37℃培養箱培養16hr，此時每孔中菌液濃度約為108/ml，獨立克隆數仍為101；PCR擴增Cosmid亞庫，鑑別篩選第二級陽性亞庫底物的快速處理以1X PCR Buffer 50μl加2μl前述製備的Cosmid稀釋克隆菌液，100℃煮沸10min，10000g離心2min，取上清2μl，加入PCR反應液中，作為底物，對於Cosmid稀釋克隆菌板上的96個孔的每一個孔的菌均作同樣的處理；PCR反應條件在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer 10μl終濃度1X2mM dNTP10μl終濃度0.2mM第一段序列上下遊引物各5μl 終濃度50pmol已處理底物 2μl 105菌DNA當量Taq酶 1μl 終濃度2μl去離子水 72μl 補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理1％瓊脂糖-TAE凝膠電泳鑑別陽性克隆電泳條件10V/cm 30min上樣量PCR反應液10μl，加2μl 5X上樣緩衝液分子量標準使用TaKaRa公司的DL2000，條帶大小分別為100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb；紫外310nm下觀察電泳條帶；條帶鑑別同第一級亞庫篩選，根據條帶的有效位置及長度判斷擴增的陽性情況，作為Cosmid載體的pWE15使用第一段序列進行PCR擴增時可以獲得可重複的250bp條帶，該條帶為背景條帶，可以剔除，目標序列擴增可以獲得400bp左右的條帶。有此條帶，初步說明為所需要篩選的陽性克隆。實際篩選獲得28個孔的亞庫具有陽性反應，此時亞庫的獨立克隆數為101，對於其中一個亞庫進行單克隆細菌平板製備分析；Cosmid庫單克隆細菌平板製備1)取10μl經篩選為陽性的第二級稀釋Cosmid亞庫中陽性孔的菌液，在100倍顯微鏡下，使用相差方式，以及醫用血球計數板，直接計數其菌液濃度平均為108/ml；2)取10μl目標Cosmid亞庫的菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為106/ml；3)取10μl前述稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為104/ml；4)取100μl前述104/ml稀釋菌液，加入1ml新鮮配製的無菌LB培養基，混合均勻，此時稀釋菌液的濃度為103/ml；5)取100μl前述103/ml稀釋菌液，鋪於10cm細菌培養平板上，LB培養基，1.5％瓊脂糖，100μg/ml Amphicillin，37℃培養約16小時，待菌落長至平均1mm直徑，平均各板上可以長到50-100個克隆；6)以滅菌牙籤，挑單克隆菌落的一半於底物處理液中，用於PCR反應。將板上克隆與PCR反應管，底物處理管對應編號，根據PCR反應結果，尋找板上克隆，進行細菌培養擴增，每組篩選共挑選50個單克隆；PCR擴增Cosmid平板單克隆，鑑別篩選目標菌落底物的快速處理以1X PCR Buffer 50μl加滅菌牙籤挑的一半克隆，混勻100℃煮沸10min，10000g離心2min，取上清2μl，加入PCR反應液中，作為底物，對於Cosmid庫單克隆平板上的其它50個單菌落均作同樣的處理PCR反應條件一在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer 10μl 終濃度1X2mM dNTP 10μl 終濃度0.2mM第一段序列上下遊引物各 5μl 終濃度50pmol已處理底物2μl 105菌DNA當量Taq酶1μl 終濃度2μl去離子水 72μl 補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理PCR反應條件二在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer10μl 終濃度1X2mM dNTP 10μl 終濃度0.2mM第二段序列上下遊引物各 5μl 終濃度50pmol已處理底物 2μl 105菌DNA當量Taq酶 1μl 終濃度2μl去離子水 72μl 補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理PCR反應條件三在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer 10μl 終濃度1X2mM dNTP 10μl 終濃度0.2mM第三段序列上下遊引物各 5μl終濃度50pmol已處理底物2μl105菌DNA當量Taq酶1μl終濃度2μl去離子水 72μl 補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理1％瓊脂糖-TAE凝膠電泳鑑別陽性克隆電泳條件10V/cm 30min上樣量PCR反應液10μl，加2μl 5X上樣緩衝液分子量標準使用TaKaRa公司的DL2000，條帶大小分別為100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb，紫外310nm下觀察電泳條帶；條帶鑑別根據條帶的有效位置及長度判斷擴增的陽性情況，作為Cosmid載體的pWE15使用第一段序列進行PCR擴增時可以獲得可重複的250bp條帶，該條帶為背景條帶，可以剔除，目標序列擴增可以獲得400bp左右的條帶，有此條帶，初步說明該克隆為所需要篩選的陽性克隆以及該克隆包含所需要的ApoA1-300起始的序列；作為Cosmid載體的pWE15使用第二段序列進行PCR擴增時可以獲得可重複的100bp條帶，該條帶為背景條帶，可以剔除，目標序列擴增可以獲得500bp左右的條帶，有此條帶說明該克隆包含所需要篩選片斷的8106-8648bp部分序列；作為Cosmid載體的pWE15使用第三段序列進行PCR擴增時沒有條帶，陽性克隆可擴增出1.1kb的片斷，說明該克隆已經包含了ApoAIV的基因調控區，整個ApoA1的10.5kb調控區均含在克隆區中，實際篩選獲得1個單克隆菌落3段PCR引物序列擴增均得到目標條帶；部分序列分析鑑定陽性克隆PCR反應產生目標陽性條帶在0.5ml離心管中準備下列試劑10X PCR Buffer 10μl 終濃度1X2mM dNTP 10μl 終濃度0.2mM第一段序列上下遊引物各 5μl 終濃度50pmol(或第二段序列上下遊引物各5μl 終濃度50pmol)已處理目的克隆製備底物 2μl 105菌DNA當量Taq酶 1μl 終濃度2μl去離子水 72μl 補齊反應體積為100μl混勻後，加50μl石蠟油，放入PCR儀，運行參數為91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30個循環，最後72℃延伸5min，4℃保溫待處理1％瓊脂糖-TAE凝膠電泳鑑別分離目標條帶電泳條件10V/cm 30min上樣量PCR反應液10μl，加2μl 5X上樣緩衝液分子量標準使用TaKaRa公司的DL2000，條帶大小分別為100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb，紫外310nm下觀察電泳條帶，第一段序列擴增的目標陽性條帶為400bp；第二段序列擴增的目標陽性條帶為500bp左右；對照分子量標準，取下相應的條帶所在的瓊脂糖膠塊；Agarose DNA快速回收(Gibco BRL，Concert Gel ExtractionSystem)準備a.50℃水浴裝置b.預熱TE緩衝液至65-70℃1)切膠以潔淨、鋒利刀片切下含DNA片段的Agarose膠，修淨邊緣；2)稱重膠濃度小於2％，重量小於400mg者，裝入1.5ml Eppendorf管中，每10mg膠加入30ml L1(Gel. Solubilization Buffer，見Gibco公司操作手冊)；3)溶解50℃水浴15分鐘以上，每隔3分鐘混勻一次，溶解後繼續水浴5分鐘；4)裝柱取一洗脫柱放入一2ml洗滌管中，把「3」中的混和物倒入洗脫柱中，離心12000g 1分鐘，棄去洗滌管中液體；5)洗滌(可選)洗脫柱放回2ml洗滌管中，加500μl L1，室溫放置1分鐘，離心12000g 1分鐘，棄去洗滌管中液體；6)洗滌洗脫柱放回2ml洗滌管中，加700μl L2(Wash Buffer，含乙醇，見Gibco公司操作手冊)，室溫放置5分鐘，離心12000g 1分鐘，棄去洗滌管中液體，重複離心1分鐘，棄去洗滌管；7)DNA回收把洗脫柱放入一新的1.5ml Eppendorf管中，加入50μl預熱的TE緩衝液，室溫放置1分鐘，離心12000g 2分鐘，可得回收DNA；目標條帶克隆入pGEM-T Easy Vectors(Promega公司)在一新的0.5ml Eppendorf管中先後加入如下試劑2×Rapid Ligation Buffer 5μlpGEM-T Easy Vector(50ng) 1μlPCR product(膠回收產物) 3μlT4 DNA Ligase(3 U/μl) 1μl總體積10μl，4℃連接反應過夜；細菌轉化取JM109感受態菌200μl於Eppendorf管中加入上述已連接了目標條帶的T載體(pGEM-T/apo)4μl，輕輕混勻，放置冰上30分鐘；42℃水浴，熱休克90秒，不搖動試管；管中加入無抗生素之LB培養基800μl，37℃溫和搖動(150rpm)45分鐘；5000g離心30秒，吸去上清約800μl，加入X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly--D-galactopyranoside)IPTG(isopropyl-β-thiogalactopyranoside)(Promega)混勻後，用無菌塗布器將菌液全部鋪於含氨苄青黴素的瓊脂平板表面，37℃平放20分鐘後倒置培養10-14小時(過夜)；次日挑取白色菌落接種於3ml含氨苄青黴素的液體LB培養基中，37℃搖床搖菌(180rpm)12小時；質粒提取取菌液，加入至Eppendorf管中，4℃ 4000g離心10分鐘，棄上清，倒置試管，滴盡殘存液體；加入100μl SI，漩渦振蕩後完全重懸菌體；加入200μl SII，顛倒Eppendorf管4次；加入150μl SIII，12000g離心10分鐘；附①SI50mm葡萄糖，25mmol Tris-Hcl(pH8.0)，10mmolEDTA(pH8.0)，配製 200ml，②SII0.2mol NaOH，1％SDS，配製100ml，③SIII5mol乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，雙蒸去離子水28.5ml。將上清移到另一Eppendorf管中，加入等體積(450μl)苯酚氯仿異戊醇，混勻後，12000g離心10分鐘；小心吸取上層水相，加入冰無水乙醇，混勻後-70℃放置30分鐘，12000g離心15分鐘；棄上清，加500μl冷75％乙醇輕洗管壁，10000g 5分鐘，棄盡上清，37℃靜置乾燥10分鐘；用50μlTER(PH7.4)(50μl TE pH8.0，RNaseA 10mg/ml，5μl)溶解質粒；酶切鑑定克隆質粒於一新Eppendorf(EP)管中依次加入以下反應物及試劑ddH2O 6μl10×緩衝液 2μl限制酶(Bgl II及Xho I)各 1μl質粒DNA 10μl總體積20μl，離心混合，37℃水浴1-1.5小時，Agarose凝膠電泳，可見相應大小的目標片段；目標條帶測序分析將PCR擴增獲得的目標片斷純化後克隆入的T/A載體，以T7 promter作序列分析引物，交上海生工(Sangon)公司測定，兩段序列均與預期序列一致，結果如下第一段序列01 TGANNCCNTGGGATACCCCGANCCCACCCGGGAGACCTGCAAGCCTGCAGACACTCCCCT61 CCCGCCCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCCCCCGCAGCTTGCTGTTTGCCCA121 CTCTATTTGCCCAGCCCCAGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCCACATTGCC181 AGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCCGGGGCTGGGCTTATCAGCCTCCCAGCCCAGACCCT241 GGCTGCAGACATAAATAGGCCCTGCAAGAGCTGGCTGCTTAGAGACTGCGAGAAGGAGGT301 GCGTCCTGCTGCCTGCCCCGGTCACTCTGGCTCCCCAGCTCAAGGTTCAGGAGATCTATA第一段序列使用膠塊回收DNA直接以ApoA1-300起始的PCR第一段序列作為引物測序，故圖譜上顯示出第一段序列的反向引物序列，其它部分序列與GenBank中編號[gi178765]的對應片斷完全一致；第二段序列GCCGCGGGAATTCGATTGAGGGCATTACCTGGAGCAGCTGCCTCTAGGGATGAACTGAGCAGACAGGCAGGAGGGTTCTGACCTGTTTTATATCATCTCCAGGGCAGCAGGCACTGAGGACCCAGGGCGCTGGGCAAAGGTCACCTGCTGACCAGTGGAGATGAGGGCCTGAGGCAGGGTGTCCAGATGCAGCAAGCGGGCGGGAGAGTTGGGAAATCCCTAGGAGACTGAGTCCACGCTGCTGTCCCGCCAGCCCTGCAGCCCAGATGAGCTCAGGAACTGGGGGTGGGCCTGGGGAGCCTCATTCCTTCCTAGCTGACTGGCTCCCCAGGGAGAGGCTGGTGAGAGGGGAAATGGCTTGGACATAGGCCAGCGCTCGGGCCCATCTCAGCCTTTCACACTGGAATTTCAGGCCCCTCCCTCCACCAGCCCCAAGCCCTGAACACAGCCTGGAGTAGAGGGGTGAGGGGCTTCTTCAGACTTGAGAACAAGTGGGTGGCTTGGGCTGGGGGGTGTTTGGAGTAAAGGCACAGAAGACCGGGCATCAGTGGCTCGCAAGGCCTGGGCATAGCTTGAYGTATTTTATAGTGTCACCTAAATAGCTTNGGCGTAATNATGGCCATAAGCTGNTTTCCTTGNGGNGNAAATTGNTNTTTCCGCTTCACAAATTCCNCACAAACAATACCAAGCCCGGAAGCANTAAAGGNGGGAAAAGNCCTGGGGGGGGCCTAAATGGAGGGGAGCCTTAACCTCNCNATTTAATTTGNGTTTGGCGCTTCNCTTGGCCCCCNT下劃線部分為設計的引物序列，其它引物之間的部分序列與GenBank中編號[gi178765]的對應片斷完全一致。
全文摘要
本發明提供了一種用PCR技術從人類全基因組Cosmid庫中篩選ApoAI可表達全基因的方法。本發明首次將PCR有效擴增ApoAI的部分序列作陽性指標,應用PoolDilution方法從Cosmid庫中篩選到的人ApoAI可表達全基因作ApoAI轉基因動物。
文檔編號C12Q1/68GK1355321SQ0012751
公開日2002年6月26日 申請日期2000年11月24日 優先權日2000年11月24日
發明者龔邦強, 周曉明, 戚春婷, 張嗣良 申請人:上海醫藥(集團)總公司